Luận án Tiến sĩ chuyên ngành Sinh vật học: Phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:353

Thêm vào BST

Báo xấu

201
lượt xem 60
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án: Phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng ở tỉnh Phú Yên có đặc tính cố định đạm, hòa tan lân, sinh tổng hợp IAA cao để ứng dụng sản xuất phân bón vi sinh cho cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ chuyên ngành Sinh vật học: Phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VĂN THỊ PHƯƠNG NHƯ PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY LÚA TRỒNG TRÊN ĐẤT Ở TỈNH PHÚ YÊN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành VI SINH VẬT HỌC Mã số 62 42 01 07 Cần Thơ, 2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VĂN THỊ PHƯƠNG NHƯ PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY LÚA TRỒNG TRÊN ĐẤT Ở TỈNH PHÚ YÊN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành VI SINH VẬT HỌC Mã số 62 42 01 07 Người hướng dẫn khoa hoc Gs. Ts. CAO NGỌC ĐIỆP Cần Thơ, 2015
LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn thầy GS. TS Cao Ngọc Điệp, người đã tận tình hướng dẫn khoa học, hướng dẫn cách tiếp cận với các kiến thức khoa học trong lĩnh vực nghiên cứu để tôi hoàn thành luận án tiến sĩ. Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Lãnh Đạo Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh học, Phòng Đào Tạo, Phòng Quản Lý Khoa học, Khoa Sau Đại học và các phòng ban khác của Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án tiến sĩ. Cảm ơn gia đình và những người thân đã động viên và chia sẻ để tôi hoàn thành luận án tiến sĩ. Xin chân thành cảm ơn i
TÓM TẮT Phú Yên là tỉnh ven biển Nam Trung bộ, với nền sản xuất chủ yếu là nông nghiệp trong đó lúa là cây lương thực chính. Nhu cầu phân bón đối với cây lúa là rất lớn, nhưng trong đất trồng lúa ở tỉnh Phú Yên chất dinh dưỡng không cao, song do ý thức và trình độ canh tác của người dân còn thấp. Do vậy để cải thiện năng suất lúa người dân đã lạm dụng phân bón hóa học đã hưởng đến hiệu quả kinh tế và tác động bất lợi đối với môi trường. Vì vậy đề tài “Phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên” được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên có đặc tính cố định đạm, hòa tan lân, sinh tổng hợp IAA cao và đặc biệt là những dòng vi khuẩn này có thể thích nghi tốt với điều kiều thổ nhưỡng và thời tiết ở khu vực tỉnh Phú Yên. Các dòng vi khuẩn tuyển chọn có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất phân bón sinh học cho cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên. Trong 3 loại môi trường phân lập chuyên biệt đã chọn được 593 dòng vi khuẩn được phân lập từ cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên, có màu sắc khác nhau: vàng nhạt, vàng đậm, trắng đục và trắng trong. Hình dạng khuẩn lạc chủ yếu là tròn, bìa nguyên và nhô, hầu hết các dòng vi khuẩn có tế bào dạng hình que, Gram âm. Bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi p515FPL và p13B đã xác định được 556 dòng vi khuẩn là vi khuẩn nội sinh cây lúa. Các dòng vi khuẩn này được nuôi trong môi trường Burk không đạm, môi trường NBRIP hoặc trên môi trường phân lập và xác định khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan bằng phương pháp so màu. Kết quả cho thấy có 533 dòng có khả năng cố định đạm, trong số đó 457 dòng có khả năng hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA. Trong số đó 90 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm khá cao được phân tích vùng tự gen 16S rDNA. Kết quả cho thấy các dòng vi khuẩn được định danh có mức tương đồng 97% trở lên so với các dòng vi khuẩn nội sinh trên ngân hàng gen. 90 dòng vi khuẩn thuộc trong 5 nhóm: Alphaproteobacteria (chiếm tỉ lệ 1,11%), Betaproteobacteria (chiếm tỉ lệ 11,11%), Gammaproteobacteria (chiếm tỉ lệ 53,33%), Bacteroidetes (chiếm tỉ lệ 6,67%) và Bacilli (chiếm 27,78%). Trong số 90 dòng vi khuẩn có hoạt tính sinh học cao đã chọn được 22 dòng vi khuẩn có khả năng cung cấp đạm và hòa tan lân khó tan cung cấp cho cây lúa được trồng trong ống nghiệm. Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm và hòa tan lân cung cấp cho cây lúa được trồng trong điều kiện nhà lưới thì có 8/22 dòng vi khuẩn có khả năng giúp giảm lượng phân đạm vô cơ cung cấp từ 25% - 75% N (tương đương với 30 kg N - 90 kg N/ha) và 4/8 dòng vi khuẩn có khả năng làm giảm lượng lân vô cơ cung cấp là 50% P (tương đương với 40 kg P2O5/ha) cho cây lúa. Trong thí ii
nghiệm ngoài đồng tại 2 địa điểm khác nhau trên nền đất thịt pha cát tại tỉnh Phú Yên đã tuyển chọn được 2 dòng vi khuẩn SHL70 (tương đồng 98% với loài Azospirillum amazonense) và dòng PHL87 (tương đồng 99% Burkholderia kururiensis) có khả năng cung cấp 50% lượng đạm sinh học (tương đương 60 kg N/ha) cho cây lúa và 2 dòng vi khuẩn TAL1 (tương đồng 99% loài Pseudomonas putida) và TAL4 (tương đồng 99% với loài Bacillus subtilis) có khả năng hòa tan lân khó tan thành dễ tan để đáp ứng nhu cầu sinh trưởng và phát triển cho cây lúa và đã tiết kiệm được 50% lượng phân lân vô cơ (tương đương 40 kg P2O5/ha) nhưng vẫn đảm bảo về năng suất, cải thiện chất lượng gạo. Kết quả bổ sung kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70 và TAL4 lên cây lúa trồng ở 2 địa điểm khác nhau tại Phú Yên đều cho hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan cao hơn khi bổ sung riêng rẽ từng dòng cho cây lúa. Sự kết hợp 2 dòng SHL70 và TAL4 giúp giảm 50% N (tương đương 60 kg N/ha) và 50% P (tương đương 40 kg P2O5/ha) trong sản xuất lúa mà vẫn đảm bảo được năng suất lúa tốt. Từ khóa: Cố định đạm, hòa tan lân, lúa cao sản, Phú Yên, tổng hợp IAA, vi khuẩn nội sinh. iii
ABSTRACT Title “Isolation and characterization of rice endophytic bacteria cultivated on soils of Phu Yen province” Phu Yen province is located in coastal of Central Vietnam and rice is main crop. Due to low soil fertility, big amount of chemical fertilizers are used for rice production but low ecomomical effect and this may cause environmental pollution and negatively influence human health. Besides that, endophytic bacteria are microorganisms that live in plant tissues and they may be responsible for the supply of biologically fixed nitrogen to their host plant and plant promoting growth such as phosphate solubilization and IAA biosynthesis. Title “Isolation and characterization of rice endophytic bacteria cultivated on soils of Phu Yen province” was conducted to isolate and select rice endophytes with good characteristics such as high nitrogen fixation, phosphate solubilization and IAA production to produce biofertilizer for rice cultivation in soils of Phu Yen province in the future. Five hundreds and ninety-three of bacterial isolates were isolated from stems and roots of rice samples which were collected from seven districts and Tuy Hoa city in three kinds of medium (LGI, NFb, RMR). Their colonies had round-shape, climy, smooth, colourless or milk-color, yellow and some colonies appeared in much larger size. Using 16S rRNA gene fragments amplified with DNA using eubacterial universal primers (p515FPL and p13B), 556 isolates were identified as endophytic bacteria. A total of 533 endophytic isolates had the ability of nitrogen fixation, in which 457/533 isolates have ability of phosphate solubilization together with IAA biosynthesis. The sequences of selected endophytic bacteria (90 isolates) showed high degrees of similarity to those of the GenBank references strains (between 97% and 99%). From 90 isolates, 27,78% isolates belonged to Bacilli, 1,11% isolates was Alphaproteobacteria, 11,11% isolates were identified as Betaproteobacteria and 53,33% isolates were Gammaproteobacteria, while 6,67% isolates were Bacteroides. Total 22/90 endophytes having high ability of nitrogen fixation and phosphate solubilization were selected from the in-vitro experiments and 8/22 endophytes which could provides from 25% to 75% N and 4/8 endophytes solubilized 50% P2O5 for rice plants in pot experiments. From field experiments, two strains (Azospirillum amazonense SHL70 and Burkholderia vietnamiensis PHL87) fixed and provided 50% of biological nitrogen for rice plants and two strains (Pseudomonas putida TAL1 and Bacillus subtilis TAL4) solubilized and provided 50% P2O5 requirement of iv
rice cultivation. The effect of Azospirillum amazonense SHL70 and Bacillus subtilis TAL4 in rice cultivated on soils of two sites (Dong Hoa and Tuy An districts, Phu Yen province) showed that either SHL70, TAL4 or mixture of SHL70 and TAL4 saved 50% N and 50% P2O5 in rice cultivation but grain yield of inoculated rice seeds as same as control treatment 100% N and 100% P2O5 without inoculation. Keywords: endophytic bacteria, high-yielding rice, IAA biosynthesis, nitrogen fixation, phosphate solubilization, Phu Yen. v
Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Độc lập – Tự do – Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu “Phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên” là của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa được người khác công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nghiên cứu sinh Văn Thị Phương Như vi
MỤC LỤC TÓM TẮT ......................................................................................................... ii ABSTRACT ..................................................................................................... iv MỤC LỤC ...................................................................................................... vii DANH SÁCH BẢNG ...................................................................................... xi DANH SÁCH HÌNH ..................................................................................... xiv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ....................................................................... xvi CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU ........................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu .................................................................................................... 2 1.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 2 1.4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................ 3 1.5. Những đóng góp mới của luận án ............................................................. 3 1.6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án .................................. 3 CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................... 5 2.1. Điều kiện tự nhiên và tình hình sản xuất lúa của tỉnh Phú Yên ............... 5 2.1.1. Điều kiện tự nhiên của tỉnh Phú Yên ..................................................... 5 2.1.2. Tình hình sản xuất lúa ở tỉnh Phú Yên .................................................. 6 2.2. Hiện trạng sử dụng phân bón ở Việt Nam và Phú Yên ............................ 7 2.2.1. Hiện trạng sử dụng phân bón hóa học ở Việt Nam, Phú Yên và hiệu suất sử dụng phân bón hóa học ....................................................................... 7 2.2.1.1. Ở Việt Nam ......................................................................................... 7 2.2.1.2. Ở Phú Yên ........................................................................................... 8 2.2.1.3. Hiệu suất sử dụng phân bón hóa học hiện nay và các nguyên nhân làm tổn thất lượng phân bón ............................................................................ 9 2.2.2. Phân bón hữu cơ .................................................................................. 11 2.2.3. Phân hữu cơ - vi sinh ........................................................................... 12 2.2.4. Phân vi sinh .......................................................................................... 12 2.2.4.1. Khái niệm phân vi sinh ..................................................................... 12 2.2.4.2. Tình hình nghiên cứu phân bón vi sinh ở Việt Nam ........................ 12 2.3. Vai trò của phân bón đối với cây lúa ...................................................... 15 2.3.1. Vai trò của phân đạm đối với cây lúa .................................................. 15 2.3.2. Vai trò của phân lân đối với cây lúa .................................................... 15 2.3.3. Vai trò của phân kali đối với cây lúa ................................................... 16 2.4. Tổng quan về vi khuẩn nội sinh .............................................................. 16 2.4.1. Các nhóm vi khuẩn nội sinh thực vật .................................................. 17 2.4.2. Các nhóm vi khuẩn nội sinh cây lúa .................................................... 20 2.4.3. Đặc điểm của vi khuẩn nội sinh thực vật - ở cây lúa ........................... 22 vii
2.4.4. Vai trò của vi khuẩn nội sinh ............................................................... 24 2.4.4.1. Khả năng cố định đạm ...................................................................... 24 2.4.4.2. Khả năng hòa tan lân khó tan ........................................................... 26 2.4.4.3. Khả năng tổng hợp IAA .................................................................... 28 2.4.4.4. Đối kháng sinh học ........................................................................... 29 2.4.5. Những nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn nội sinh thực vật trong sản xuất phân vi sinh ............................................................................................ 31 2.4.5.1. Phân vi sinh cố định đạm .................................................................. 31 2.4.5.2. Phân vi sinh hòa tan lân khó tan ....................................................... 33 2.4.5.3. Phân vi sinh kích thích, điều hoà sinh trưởng thực vật ..................... 35 2.4.5.4. Phân vi sinh đa chức năng ................................................................ 35 CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 37 3.1. Phương tiện nghiên cứu .......................................................................... 37 3.1.1. Vật liệu ................................................................................................. 37 3.1.2. Dụng cụ ................................................................................................ 37 3.1.3. Thiết bị ................................................................................................. 37 3.1.4. Hóa chất và môi trường phân lập nuôi cấy vi khuẩn ........................... 38 3.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 41 3.2.1. Thu mẫu lúa ......................................................................................... 42 3.2.2. Phân lập vi khuẩn nội sinh cây lúa ...................................................... 43 3.2.3. Khảo sát hình thái khuẩn lạc và đặc điểm tế bào vi khuẩn. ................. 44 3.2.4. Nhận diện vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR ................................. 45 3.2.5. Khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh cây lúa ............................... 46 3.2.6. Tuyển chọn vi khuẩn nội sinh .............................................................. 50 3.2.6.1. Nhận diện và xây dựng mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh ................................................................................................ 50 3.2.6.2. Đo lượng Acethylen bị khử ............................................................. 51 3.2.6.3. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh lên cây lúa trồng trong ống nghiệm ......................... 53 3.2.6.4. Khảo sát đặc tính sinh lý, sinh hóa của các dòng vi khuẩn .............. 55 3.2.6.5. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng trong nhà lưới .............................. 55 3.2.6.6. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng ................ 59 3.2.6.7. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi kết hợp 2 dòng vi khuẩn nội sinh lên cây lúa ............................................................. 61 3.3. Xử lý số liệu ............................................................................................ 63 viii
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................... 64 4.1. Phân lập và đặc điểm sinh học của vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên .................................................................................. 64 4.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn .................................................................... 64 4.1.2. Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập ........... 66 4.2. Nhận diện vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR ........................................ 69 4.3. Kết quả khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh cây lúa .................. 69 4.3.1. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ của các dòng vi khuẩn ......... 70 4.3.2. Kết quả khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn .. 72 4.3.3. Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn .......... 74 4.4. Nhận diện và xây dựng mối quan hệ di truyền của 90 dòng vi khuẩn nội sinh có khả năng tổng hợp NH4+ cao, hòa tan lân và tổng hợp IAA ....... 76 4.5. Kết quả đo hàm lượng Acethylen bị khử và nhận diện gen nifH của các dòng vi khuẩn được tuyển chọn .............................................................. 90 4.5.1. Kết quả đo hàm lượng Acethylen bị khử của các dòng vi khuẩn ........ 90 4.5.2. Nhận diện gen nifH của 22 dòng vi khuẩn được tuyển chọn ............... 92 4.6. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng trong ống nghiệm ................................................ 93 4.6.1. Hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn ..................................... 93 4.6.2. Hiệu quả hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn .......................... 95 4.7. Khảo sát đặc tính sinh lý, sinh hóa của các dòng vi khuẩn được tuyển chọn ................................................................................................................ 98 4.8. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng trong điều kiện nhà lưới .................................................. 102 4.8.1. Ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng trong điều kiện nhà lưới ......... 102 4.8.2. Ảnh hưởng của 4 dòng vi khuẩn và phân lân hóa học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng trong điều kiện nhà lưới ........ 114 4.9. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng tại phường Phú Thạnh, Tuy Hòa 121 4.9.1. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, PHL87 và phân đạm hóa học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng .................................................................................................... 121 4.9.2. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn TAL1, TAL4 và phân lân hóa học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng tại phường Phú Thạnh, Tuy Hòa ......................................................... 128 4.10. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70 và TAL4 trên cây lúa trồng ở điều kiện nhà lưới và ngoài đồng..................................................................................................... 135 ix
4.10.1. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70 và TAL4 trên cây lúa trồng ở điều kiện nhà lưới ..... 135 4.10.2. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung kết hợp 2 dòng vi khuẩn trên cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng ............ 139 4.10.2.1. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung kết hợp 2 dòng vi khuẩn trên cây lúa trồng ở ngoài đồng tại huyện Đông Hòa 139 4.10.2.2. Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi bổ sung kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 trên cây lúa trồng ở ngoài đồng tại huyện Tuy An……………………………………………………………….145 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .............................................. 153 5.1. Kết luận ................................................................................................. 153 5.2. Đề xuất .................................................................................................. 153 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ...............................................................................155 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 156 PHỤ LỤC...................................................................................................... 173 x
DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1. Diện tích, năng suất và sản lượng lúa các huyện, thị xã và thành phố năm 2014 ................................................................................................... 7 Bảng 2.2. Nhu cầu và khả năng cung ứng phân bón năm 2011 ...................... 8 Bảng 2.3. Tổng lượng phân bón hóa học trong sản xuất nông nghiệp ở Phú Yên ................................................................................................................... 8 Bảng 2.4. Một số giống vi sinh vật sử dụng trong sản xuất phân vi sinh ở Việt Nam ........................................................................................................ 14 Bảng 2.5. Vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây lúa ........................................... 20 Bảng 3.1. Công thức môi trường LGI ............................................................ 38 Bảng 3.2. Công thức môi trường Nfb ............................................................ 38 Bảng 3.3. Công thức môi trường Burk không đạm ........................................ 40 Bảng 3.4. Công thức môi trường NBRIP lỏng ............................................... 40 Bảng 3.5. Công thức của môi trường dinh dưỡng Yoshida ........................... 41 Bảng 3.6. Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR ............................... 45 Bảng 3.7. Các giai đoạn của phản ứng PCR .................................................. 46 Bảng 3.8. Thành phần của dãy đường chuẩn NH4+ ........................................ 47 Bảng 3.9. Thành phần của dãy đường chuẩn P2O5 ......................................... 48 Bảng 3.10. Thành phần của dãy đường chuẩn IAA........................................ 50 Bảng 3.11. Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát hiệu quả cố định đạm....... 54 Bảng 3.12. Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát hiệu quả hòa tan lân khó tan ................................................................................................................... 54 Bảng 3.13. Đặc tính đất thí nghiệm trong chậu của tỉnh Phú Yên ................. 56 Bảng 3.14. Các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát đạm ......................... 56 Bảng 3.15. Các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát lân ........................... 58 Bảng 3.16. Đặc tính đất thí nghiệm khảo sát đạm trồng lúa ngoài đồng tại phường Phú Thạnh .......................................................................................... 59 Bảng 3.17. Đặc tính đất thí nghiệm khảo sát lân trồng lúa ngoài đồng tại phường Phú Thạnh .......................................................................................... 61 Bảng 3.18. Các nghiệm thức trong thí nghiệm tổ hợp 2 dòng vi khuẩn ......... 62 Bảng 3.19. Đặc tính đất thí nghiệm ngoài đồng ở huyện Đông Hòa .............. 62 Bảng 3.20. Đặc tính đất thí nghiệm ngoài đồng ở huyện Tuy An .................. 62 Bảng 4.1. Các dòng vi khuẩn đã được phân lập từ trong cây lúa .................. 65 Bảng 4.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn .................................. 66 Bảng 4.3. Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn ........................................ 68 Bảng 4.4. Hàm lượng NH4+, P2O5 và IAA của 90 dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường LGI, Nfb và RMR .............................................................. 77 xi
Bảng 4.5. Mối tương quan di truyền giữa các dòng vi khuẩn phân lập với các dòng vi khuẩn có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA ............................................................................................................. 79 Bảng 4.6. Sự đa dạng của trình tự Nucleotide được phân tích trong phần mềm DNASP 5.10 ......................................................................................... 89 Bảng 4.7. Hàm lượng nitrogenase được tổng hợp của 40 dòng vi khuẩn ..... 90 Bảng 4.8. Hàm lượng nitrogenase được tổng hợp của 22 dòng vi khuẩn bổ sung lên cây lúa .............................................................................................. 92 Bảng 4.9. Chiều cao cây và trọng lượng khô cây lúa 28 NSKG trong ống nghiệm ở thí nghiệm khảo sát đạm ................................................................. 94 Bảng 4.10. Chiều cao cây và trọng lượng khô cây lúa 28 NSKG trong ống nghiệm ở thí nghiệm khảo sát lân ................................................................... 96 Bảng 4.11. Đặc tính sinh lý sinh hóa của 8 dòng vi khuẩn tiềm năng nội sinh cây lúa .................................................................................................... 99 Bảng 4.12. Đặc tính của các loài vi khuẩn trong chi Bacillus ..................... 100 Bảng 4.13. Đặc tính của các loài vi khuẩn trong chi Azospirillum .............. 101 Bảng 4.14. Đặc điểm của 8 dòng vi khuẩn tiềm năng được tuyển chọn ...... 102 Bảng 4.15. Ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa ở giai đoạn 48 NSKG trồng trong chậu .................................................................................................... 104 Bảng 4.16. Ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa lúc thu hoạch (110 NSKG) trồng trong chậu .................................................................................................... 108 Bảng 4.17. Ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học lên thành phần năng suất của cây lúa lúc thu hoạch (110 NSKG) trồng trong chậu ............................................................................................................... 110 Bảng 4.18. Ảnh hưởng của 4 dòng vi khuẩn và phân lân học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng trong chậu ở giai đoạn 48 NSKG............................................................................................................ 116 Bảng 4.19. Ảnh hưởng của 4 dòng vi khuẩn và phân lân hóa học lên đặc tính sinh trưởng và phát triển của cây lúa trồng trong chậu lúc thu hoạch .. 117 Bảng 4.20. Ảnh hưởng của 4 dòng vi khuẩn và phân lân hóa học lên thành phần năng suất của cây lúa trồng trong chậu lúc thu hoạch (110 NSKG) ... 119 Bảng 4.21. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, PHL87 và phân đạm hóa học lên đặc tính sinh trưởng của cây lúa trồng ngoài đồng ở phường Phú Thạnh, Tuy Hòa ..................................................................................... 122 Bảng 4.22. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, PHL87 và phân đạm hóa học lên các thành phần năng suất của cây lúa trồng ngoài đồng ở phường Phú Thạnh, Tuy Hòa........................................................................ 124 xii
Bảng 4.23. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, PHL87 và phân đạm hóa học lên hàm lượng N trong gạo, trong rơm và protein trong gạo………126 Bảng 4.24. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn TAL1, TAL4 và phân lân hóa học lên đặc tính sinh trưởng của cây lúa trồng ở phường Phú Thạnh, Tuy Hòa ............................................................................................................... 129 Bảng 4.25. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn TAL1, TAL4 và phân lân hóa học lên các thành phần năng suất của cây lúa trồng ở phường Phú Thạnh, Tuy Hòa ........................................................................................................ 130 Bảng 4.26. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn TAL1, TAL4 và phân lân hóa học lên hàm lượng N trong gạo và protein trong gạo ................................... 132 Bảng 4.27. Ảnh hưởng của vi khuẩn TAL1, TAL4 và phân lân lên hàm lượng P trong rơm và trong gạo .................................................................... 133 Bảng 4.28. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, lân hóa học lên các chỉ tiêu sinh trưởng của cây lúa trồng ở nhà lưới ......... 136 Bảng 4.29. Ảnh hưởng của 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, lân hóa học lên thành phần năng suất của cây lúa trồng ở nhà lưới ............. 137 Bảng 4.30. Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, lân hóa học lên các chỉ tiêu sinh trưởng của cây lúa trồng ngoài đồng tại huyện Đông Hòa …………………………………………………………...140 Bảng 4.31. Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, lân hóa học lên các thành phần năng suất của cây lúa trồng ở huyện Đông Hòa ............................................................................................................... 141 Bảng 4.32. Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, phân lân hóa học lên hàm lượng N trong gạo, trong rơm và protein trong gạo ................................................................................................................. 143 Bảng 4.33. Hiệu quả của 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, phân lân hóa học lên hàm lượng P trong gạo, trong rơm …………………..144 Bảng 4.34. Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, lân hóa học lên các chỉ tiêu sinh trưởng của lúa trồng ở huyện Tuy An…………………………………………………………………………...146 Bảng 4.35. Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, lân hóa học lên các thành phần năng suất của cây lúa trồng ở huyện Tuy An………………………………………………………………………147 Bảng 4.36. Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, phân lân hóa học lên hàm lượng N trong gạo, trong rơm và protein trong gạo……………………………………………………………………149 Bảng 4.37. Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, phân lân hóa học lên hàm lượng P trong gạo, trong rơm…………………..150 xiii
DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1. Các huyện ở tỉnh Phú Yên ............................................................... 5 Hình 2.2. Cơ chế xâm nhiễm vi khuẩn nội sinh thực vật .............................. 17 Hình 2.3. Vi khuẩn Herbaspirillum xâm nhập vào cây lúa ........................... 23 Hình 2.4. Cấu trúc enzyme Nitrogenase ........................................................ 25 Hình 2.5. Sơ đồ biểu diễn cơ chế cố định N2 .................................................. 25 Hình 2.6. Sơ đồ biểu diễn cơ chế cố định đạm sinh học ............................... 26 Hình 3.1. Sơ đồ tóm tắt các nội dung thí nghiệm .......................................... 42 Hình 3.2. Sơ đồ các bước khử mẫu ................................................................ 43 Hình 3.3. Phản ứng màu của các ống nghiệm xây đường chuẩn và mẫu đo NH4+ với thuốc thử ............................................................................................. 47 Hình 3.4. Phản ứng màu của các ống nghiệm xây đường chuẩn và mẫu đo P2O5 ................................................................................................................ 49 Hình 3.5. Phản ứng màu của các ống nghiệm xây đường chuẩn và mẫu đo IAA ................................................................................................................ 50 Hình 4.1. Vòng pellicle xuất hiện trên các môi trường nuôi cấy ................... 66 Hình 4.2. Hình dạng khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập môi trường LGI, Nfb và RMR ........................................................................................... 67 Hình 4.3. Hình tế bào vi khuẩn chụp dưới kính hiển vi điện tử (SEM) độ phóng đại 14.000 lần ........................................................................................... 68 Hình 4.4. Nhuộm gram tế bào vi khuẩn độ phóng đại 400 lần ...................... 68 Hình 4.5. Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của các dòng vi khuẩn phân lập với 2 mồi p515FPL và p13B ............................................. 69 Hình 4.6. Khuẩn lạc dòng vi khuẩn TAL4 sau 2 ngày cấy trên môi trường Burk không đạm ............................................................................................. 70 Hình 4.7. Sự biến thiên hàm lượng NH4+ của 533 dòng vi khuẩn theo thời gian................................................................................................................... 71 Hình 4.8. Sự biến thiên hàm lượng P2O5 của 457 dòng vi khuẩn theo thời gian................................................................................................................... 74 Hình 4.9. Sự biến thiên hàm lượng IAA của 457 dòng vi khuẩn theo thời gian................................................................................................................... 75 Hình 4.10. Đa dạng về loài của 90 dòng vi khuẩn nội sinh ............................. 81 Hình 4.11.A. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với các dòng vi khuẩn thuộc nhóm Bacilli có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA……………………………………………………….83 xiv
Hình 4.11.B. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với các dòng vi khuẩn thuộc nhóm Betaproteobacteria có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA………………………………………….84 Hình 4.11.C. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với các dòng vi khuẩn thuộc chi Enterobacter có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA…………………………………………………..85 Hình 4.11.D. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với các dòng vi khuẩn thuộc chi Pantoea và Pseudomonas có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA ................................................ 86 Hình 4.11.E. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với các dòng vi khuẩn thuộc chi Acinetobacter, Stenotrophomonas, Aeromonas, Erwinia và Klebsiella có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA.................................................................................... 87 Hình 4.11.F. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh với các dòng vi khuẩn thuộc nhóm Bacteroides có trong ngân hàng gen (NCBI) dựa vào trình tự 16S rDNA ............................................................... 88 Hình 4.12. Mối tương quan giữa hàm lượng NH4+ (mg/l) và hoạt tính Nitrogenase trong dung dịch Burk (µmol)………………………...................91 Hình 4.13. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 22 dòng vi khuẩn nội sinh trên gel agarose…………………………………………………………………....93 Hình 4.14. Hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn ảnh hưởng lên sự sinh trưởng của cây lúa 28 NSKG………………………………………………...95 Hình 4.15. Hiệu quả hòa tan lân khó tan của vi khuẩn lên sự cây lúa 28 NSKG………………………………………………………………………...97 Hình 4.16. Hình vi khuẩn TAL1 dưới kính hiển vi điện tử (SEM)…………..99 Hình 4.17. Hình vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử (SEM) ......................... 100 Hình 4.18. Hình vi khuẩn dòng SHL70 dưới kính hiển vi điện tử (SEM) ... 101 Hình 4.19. Hình vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử (SEM) ......................... 102 Hình 4.20. Chiều cao của cây lúa ở các nghiệm thức 0N trong giai đoạn 48 NSKG ........................................................................................................... 106 Hình 4.21. Bông lúa khi thu hoạch ............................................................... 113 Hình 4.22. Kết quả kiểm tra tính đối kháng của 2 dòng vi khuẩn ................ 135 xv
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT 16S-rDNA 16S-ribosomal DNA coding gene ARA Acetylene Reduction Assay ATP Adenosine triphosphate Blast N Basic local alignment search tool Nucleotid ĐC Đối chứng FAME Fatty acid methyl ester FAO Food and Agriculture of Organisation GC Gas Chromatography Gen Nif Nitrogen fixing gene IAA Indole acetic acid IFA International Fertilizer industry Association ML Ma lâm MT Môi trường NCBI National centre for biotechnology information NSKC Ngày sau khi cấy NSKG Ngày sau khi gieo PGPR Plant growth promoting Rhizobacteria PCR Polymerase chain reaction PSB Phosphate solubilizing bacteria RFLP Restriction fragment length polymorphism SEM Scanning electron microscope TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TL Trọng lượng TLHC Tỷ lệ hạt chắc Trp Tryptophan VK Vi khuẩn VTCC Vietnam Type Culture Collection xvi
CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Nhu cầu lương thực ngày càng tăng là do áp lực của sự gia tăng dân số và lúa gạo là nguồn lương thực chủ yếu trong khẩu phần dinh dưỡng cho hơn 40% dân số thế giới. Trong năm 2014, sản lượng lúa trên thế giới đạt 741 triệu tấn (FAO, 2015). Năng suất cũng như sản lượng lúa tùy thuộc vào khí hậu, loại đất, độ ẩm và nguồn dinh dưỡng. Cây lúa cần nhiều chất dinh dưỡng khác nhau, chủ yếu là đạm, lân và kali để tăng trưởng, phát triển tốt và cho năng suất cao. Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cho cây lúa, nông dân phải sử dụng một lượng lớn phân bón hóa học, chủ yếu là phân đạm, lân và kali. Ở Việt Nam, tổng diện tích đất trồng lúa của cả nước trong năm 2014 khoảng 7,8 triệu ha trong đó diện tích trồng lúa tỉnh Phú Yên đạt được 57.021 ha và cần khoảng 10 triệu tấn phân bón các loại (Cục Trồng trọt, 2014), tuy nhiên hiệu suất sử dụng phân bón chỉ khoảng 35 - 40%, còn lại 60 - 65% lượng phân bón bị mất đi. Trong số lượng phân bón cây trồng không sử dụng được, một phần bị rửa trôi theo nước mặt rồi chảy vào các ao, hồ, sông suối gây ô nhiễm nguồn nước mặt và gây ảnh hưởng xấu như gây phì hóa nước và tăng nồng độ nitrate trong nước, một phần phân bón trực di xuống sâu, gây ô nhiễm nguồn nước ngầm, một phần bị bay hơi do tác động của nhiệt độ hay quá trình phản nitrate hóa gây ô nhiễm không khí (Nguyễn Đức Khiển, 2002). Nếu lạm dụng việc sử dụng phân hóa học như hiện nay thì không những gây ra lãng phí mà còn tác động và ảnh hưởng xấu đến môi trường sinh thái. Trước sức ép của vấn đề an ninh lương thực, người dân luôn đặt ra mục đích phải thu nhiều sản phẩm. Song do ý thức và trình độ canh tác chưa cao nên tình trạng lạm dụng phân bón hóa học đã xảy ra khá phổ biến. Kết quả điều tra của Sở Nông Nghiệp và PTNT Phú Yên trong năm 2012 cho thấy, chi phí mà nông dân mua phân bón để sản xuất lúa lên đến 6.000.000 đồng/ha/vụ, chi phí này > 50% tổng chi phí trong sản xuất lúa. Điều này đã tác động bất lợi đến chi phí sản xuất, đến môi trường dẫn đến kết quả sản xuất không mang lại hiệu quả kinh tế cao và chưa có nền sản xuất bền vững. Để khắc phục những tác động bất lợi này thì việc sử dụng phân bón sinh học trong quá trình sản xuất nói chung và sản xuất lúa nói riêng thật sự rất có ý nghĩa. Ngày nay, các nhà nghiên cứu đã quan tâm nhiều đến những loài vi khuẩn nội sinh và ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong sản xuất phân bón. Vi khuẩn nội sinh có vai trò quan trọng đối với cây trồng và được ứng dụng trong sản xuất phân vi sinh, chúng có những đặc tính tốt như có khả năng cố định 1
đạm cho cây trồng, hòa tan lân khó tan giúp cho cây trồng hấp thụ tốt chất dinh dưỡng, tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng IAA, tăng hàm lượng các chất khoáng, tăng khả năng kháng bệnh và giúp loại bỏ các chất gây ô nhiễm môi trường (Siciliano et al., 2001) trong đó các vi khuẩn nội sinh tiêu biểu như Azosprillum, Herbaspirillum, Burkholderia, Pseudomonas, Gluconacetobacter, ... Vì vậy, việc nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn nội sinh có ích trong sản xuất phân bón vi sinh phục vụ cho sản xuất nông nghiệp nhằm hạn chế phân bón hóa học, góp phần bảo vệ môi trường và xây dựng một nền nông nghiệp phát triển bền vững. Điều này rất có ý nghĩa, rất cần thiết trong sản xuất nông nghiệp và trong việc bảo vệ môi trường. Đặc biệt cây lúa cao sản là đối tượng cần được nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh vì đây là loại cây lương thực chính được trồng phổ biến ở tỉnh Phú Yên. Hơn nữa, hiện tại ở tỉnh Phú Yên chưa có một công trình nghiên cứu nào về vi khuẩn nội sinh trong cây lúa. Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, đề tài: “Phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên” đã được thưc hiện. 1.2. Mục tiêu Phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng ở tỉnh Phú Yên có đặc tính cố định đạm, hòa tan lân, sinh tổng hợp IAA cao để ứng dụng sản xuất phân bón vi sinh cho cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên. 1.3. Nội dung nghiên cứu - Phân lập vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng ở 7 huyện và thành phố Tuy Hòa thuộc tỉnh Phú Yên. - Nhận diện các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được bằng phương pháp truyền thống và phương pháp sinh học phân tử. - Khảo sát các đặc tính cố định đạm, hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập được và tuyển chọn những dòng có hoạt tính cao. - Định danh các dòng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính sinh học cao và xây dựng mối tương quan di truyền bằng phương pháp sinh hóa, sinh lý, hình thái và di truyền. - Tuyển chọn các dòng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính sinh học cao để ứng dụng vào sản xuất phân bón vi sinh bằng các thí nghiệm in vitro, trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng. 2