Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 trong tạo đột biến gen GmGOLS03, GmGOLS19 trên cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) nhằm giảm lượng đường họ Raffinose trong hạt

Chia sẻ: Bobietbo | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:119

Thêm vào BST

Báo xấu

37
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án "Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 trong tạo đột biến gen GmGOLS03, GmGOLS19 trên cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) nhằm giảm lượng đường họ Raffinose trong hạt" được thực hiện với mục tiêu là phát triển và ứng dụng hệ thống CRISPR/Cas9 để tạo đột biến định hướng trên gen mã hóa GOLS nhằm nâng cao chất lượng hạt đậu tương.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 trong tạo đột biến gen GmGOLS03, GmGOLS19 trên cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) nhằm giảm lượng đường họ Raffinose trong hạt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- LÊ THỊ NHƯ THẢO NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPR/CAS9 TRONG TẠO ĐỘT BIẾN GEN GmGOLS03, GmGOLS19 TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL) NHẰM GIẢM LƯỢNG ĐƯỜNG HỌ RAFFINOSE TRONG HẠT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- LÊ THỊ NHƯ THẢO NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPR/CAS9 TRONG TẠO ĐỘT BIẾN GEN GmGOLS03, GmGOLS19 TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL) NHẰM GIẢM LƯỢNG ĐƯỜNG HỌ RAFFINOSE TRONG HẠT Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã sỗ: 9 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. ĐỖ TIẾN PHÁT 2. PGS. TS. PHẠM BÍCH NGỌC Hà Nội – 2022
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và ngoài một số kết quả nhóm nghiên cứu đã công bố, chưa có ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi trích dẫn trong luận án đã được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả LÊ THỊ NHƯ THẢO
ii LỜI CẢM ƠN Luận án của nghiên cứu sinh được hoàn thành với sự giúp đỡ, hỗ trợ nhiệt tình của các cơ quan nghiên cứu trong nước, các cơ quan đoàn thể, quí đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Tác giả xin trân trọng gửi lời cảm ơn và tri ân đến: - PGS.TS. Phạm Bích Ngọc và TS. Đỗ Tiến Phát với cương vị giáo viên hướng dẫn khoa học, đã tận tình hướng dẫn đóng góp trong nghiên cứu cũng như luận án của nghiên cứu sinh. - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã cấp kinh phí để thực hiện đề tài. - Quí Lãnh Đạo Viện Công nghệ sinh học cùng Quí Thầy – Cô của Viện và các cán bộ nghiên cứu của phòng Công nghệ tế bào thực vật, đã quan tâm giúp đỡ, định hướng, tạo điều kiện tốt cho nghiên cứu sinh thực hiện các thí nghiệm và hoàn thành luận án. - Ban Lãnh Đạo và cán bộ phòng Đào tạo Học Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện để nghiên cứu sinh hoàn thành luận án. Tôi xin bày tỏ sự biết ơn đến Ban Giám Hiệu trường Cao đẳng Nông nghiệp Nam Bộ, Khoa Trồng trọt – Bảo vệ Thực vật và các Anh chị em đồng nghiệp nhà trường đã tạo điều kiện, hỗ trợ cho tôi hoàn thành khoá học. - Cuối cùng, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, Quí Anh/chị/em, bạn bè đã luôn bên tôi, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi an tâm, hoàn thành tốt luận án! Hà Nội, ngày.......tháng.......năm 2022 LÊ THỊ NHƯ THẢO
iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii MỤC LỤC ............................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT................................... vii DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ....................................................... x MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài .................................................................................. 1 2. Mục tiêu của đề tài ........................................................................................... 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ....................................................... 3 4. Những đóng góp mới của luận án .................................................................. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................ 4 1.1 Tình hình sản xuất và chọn tạo giống đậu tương ................................... 4 1.1.1 Tình hình sản xuất ....................................................................................... 4 1.1.2 Các phương pháp phổ biến sử dụng trong chọn tạo giống đậu tương ........ 7 1.2 Sinh tổng hợp đường khó tiêu raffinose (raffinose family oligosaccharide) trong cây đậu tương ................................................... 10 1.2.1. Nhóm đường khó tiêu raffinose trong thành phần hạt đậu tương ............. 10 1.2.2 Con đường sinh tổng hợp RFOs trong cây đậu tương và các enzymes tham gia ..................................................................................................... 14 1.2.3 Gen mã hóa cho Galactinol synthase (GOLS) trong đậu tương ............... 16 1.2.4 Nghiên cứu thay đổi hàm lượng RFOs trên cây đậu tương ...................... 17 1.3. Chỉnh sửa hệ gen thông qua hệ thống CRISRP/Cas9 .......................... 17 1.3.1. Nguyên lý hoạt động của hệ thống CRISRP/Cas ...................................... 18 1.3.2. Cơ chế hoạt động của hệ thống chỉnh sửa gen CRISRP/Cas9 .................. 19 1.3.3. Ứng dụng hệ thống CRISPR/Cas9 trong chọn tạo giống ở đậu tương ..... 22 1.3.4 Phương pháp đánh giá hoạt động của cấu trúc chỉnh sửa hệ gen.............. 24 1.4. Hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ và ứng dụng trong nghiên cứu biểu hiện gen và chỉnh sửa hệ gen trên đậu tương................................................ 25 1.4.1. Hệ thống cảm ứng rễ tơ ở thực vật ............................................................ 25
iv 1.4.2. Nghiên cứu biểu hiện gen và chỉnh sửa hệ gen trên đậu tương ................ 27 1.5 Những nghiên cứu trong và ngoài nước có liên quan trực tiếp đến luận án ...................................................................................................... 28 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................................................... 29 2.1 Vật liệu nghiên cứu ................................................................................. 29 2.2 Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 30 2.3 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 30 2.3.1 Thiết kế vector chuyển gen mang hệ thống CRISPR/Cas9 ...................... 30 2.3.2. Cảm ứng rễ tơ thông qua vi khuẩn A. Rhizogenes .................................... 31 2.3.3. Kiểm tra sự có mặt và biểu hiện của gen chỉ thị và gen chọn lọc trong rễ tơ đậu tương............................................................................................... 33 2.3.4. Xác định và phân tích đột biến định hướng trên các gen đích của các dòng rễ tơ đậu tương ................................................................................ 33 2.3.5 Chuyển gen tạo cây đậu tương mang cấu trúc CRISPR/Cas9 .................. 35 2.3.6 Phương pháp trồng và chăm sóc cây đậu tương trong điều kiện nhà lưới ............................................................................................................ 37 2.3.7 Phân tích sự di truyền của đột biến định hướng và gen chuyển các dòng đậu tương chỉnh sửa gen............................................................................ 37 2.3.8 Kiểm tra độ nảy mầm của hạt ................................................................... 40 2.3.9 Xác định thành phần hạt ............................................................................ 40 2.3.10 Phân tích các đột biến ngoài mục tiêu (off target) .................................... 41 2.3.11 Phân tích thống kê .................................................................................... 41 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................... 42 3.1 Thiết kế hệ thống chỉnh sửa CRISPR/Cas9 nhằm gây tạo đột biến các gen GmGOLS trên đậu tương ......................................................... 42 3.2 Kiểm tra hoạt động của cấu trúc chuyển gen và chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 thông qua hệ thống cảm ứng rễ tơ ....................... 45 3.2.1 Phát triển hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ trong điều kiện in vitro trên một số giống đậu tương ......................................................................................... 45 3.2.2. Kiểm tra hoạt động của cấu trúc chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 trên các
v dòng rễ tơ................................................................................................... 51 3.3 Tạo cây đậu tương đột biến gen mã hóa Galactinol synthase ............. 54 3.3.1 Tạo cây đậu tương chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ......... 54 3.3.2 Sàng lọc cây chuyển gen bằng phết thuốc diệt cỏ và PCR ....................... 55 3.3.3 Xác định và phân tích các đột biến gen thu được trên cây đậu tương chuyển gen T0 ........................................................................................... 56 3.4 Sàng lọc các dòng đậu tương chỉnh sửa gen qua các thế hệ T1 và T2 ................................................................................................................... 59 3.4.1 Dòng DT 1.1 của giống ĐT26.................................................................. 59 3.4.2 Các dòng M3.1 và M4.1 của giống Marverick ........................................ 63 3.5 Phân tích sinh trưởng phát triển và thành phần hạt của các dòng đậu tương mang đột biến định hướng ................................................... 71 3.5.1 Phân tích sinh trưởng, phát triển và hình thái của các dòng đậu tương mang đột biến ............................................................................................ 71 3.5.2 Phân tích khả năng nảy mầm của các dòng đột biến gen .......................... 73 3.5.3 Phân tích thành phần của hạt của các dòng đậu tương mang đột biến...... 74 3.6. Kiểm tra đột biến ngoài định hướng và lựa chọn dòng đột biến tiềm năng không mang gen chuyển ................................................................ 79 3.6.1 Phân tích đột biến ngoài mục tiêu (off target) .......................................... 79 3.6.2 Xác định các đột biến đồng hợp tử không mang gen chuyển ................... 80 CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN .............................................................................. 82 4.1 Hiệu quả của hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ trên các giống đậu tương Việt Nam .................................................................................................. 82 4.2 Chọn trình tự mục tiêu trong thiết kế cấu trúc chỉnh sửa gen trên đậu tương ................................................................................................. 83 4.3 Khả năng xuất hiện đột biến định hướng muộn thông qua hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 .................................................................. 84 4.4 Đột biến gen GmGOLS và sự nảy mầm của hạt đậu tương ................. 85 4.5 Đột biến gen GmGOLS ảnh hướng đến sự thay đổi của hàm lượng cacbohydrat có trong hạt ............................................................. 85 4.6 Tiềm năng trong chọn tạo giống đậu tương thông qua hệ thống chỉnh sửa hệ gen ................................................................................................. 87
vi KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................... 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 90 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ .................... 100 PHỤ LỤC………………………………………………………………………101
vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt AS Acetosyringone - A. rhizogenes Agrobacterium rhizogenes - A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens - AFLP amplified fragment length Sự đa hình về chiều dài các phân polymorphism đoạn được khuếch đại Biallelic Biallelic Đột biến khác nhau trên 2 alen cùng 1ocus bp Base pair Cặp ba zơ ni tơ Cas9 Crispr associated protein 9 Protein Cas 9 CRISPR Clustered regularly Nhóm trình tự ngắn, phân cách interspaced short đều đặn, lặp lại và đối ngẫu palindromic repeat DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic GOLS galactinol synthase Gm GOLS03 Glyma.03G222000 Gm GOLS19 Glyma.19G219100 sgRNA Guide RNA Trình tự định hướng HIV human immuno-deficiency Virus gây suy giảm miễn dịch trên virus người Homo Homozygous Đồng hợp tử Hetero Heterozygous Dị hợp tử HDR Homology directed repair Sửa chữa trực tiếp theo cơ chế tương đồng HPLC High-performance liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography Mr Maverick Giống đậu tương Maverick MS Murashige and Skoog Môi trường Murashige và Skoog NCBI National Center for Trung tâm quốc gia về thông tin Biotechnology Information Công nghệ Sinh học Mỹ
viii PAM Proto-spacer adjacent motif PCR Polymerase chain reaction Phản ứng kéo dài chuỗi nhờ enzyme polymerase QTL quantitative trait loci Locus liên quan tính trạng số lượng RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic RAPD Random amplified Đa hình phân đoạn DNA được polymorphic DNA khuếch đại ngẫu nhiên Ri-plasmid Root-inducing plasmid RFOs raffinose family Nhóm đường họ raffinose oligosacharides RFO Raffinose Đường raffinose RS Raffinose synthase Enzyme raffinose synthase RS2 Raffinose synthase 2 Enzyme raffinose synthase 2 RFLP Restriction fragment length Đa hình chiều các dài đoạn cắt bởi polymorphism enzyme giới hạn RNase III Ribonuclease III STS Stachyose synthase Enzyme sinh tổng hợp stachyose SSR Simple sequence repeat Đoạn trình tự lặp lại đơn giản SNP Single nucleotide Đa hình đơn nucleotide polymorphism tracrRNA Trans-acting crispr RNA WT Wild type Cây giống gốc hay đối chứng không chỉnh sửa gen WL82 Williams 82 Giống đậu tương Williams 82 YEP Yeast extract peptone Môi trường Yeast extract peptone
ix DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Thành phần các loại môi trường trong nuôi cấy tạo rễ tơ in vitro đậu tương.……..……………………………………... 31 Bảng 2.2 Thành phần các môi trường sử dụng trong chuyển gen cây đậu tương.................................................................................. 35 Bảng 2.3 Dự kiến khả năng phát hiện các alen đột biến thông qua phản ứng PCR sử dụng các chỉ thị phân tử……………………….... 39 Bảng 3.1 Tỉ lệ mẫu sống và các mẫu biểu hiện gen chỉ thị trên môi trường chọn lọc……………………………………………….. 50 Bảng 3.2 Kết quả chuyển gen của giống ĐT26 và Mr…………………. 55 Bảng 3.3 Danh sách các dòng đậu tương mang đột biến gen GmGOLS03 và GmGOLS19……………………………………………………. 64 Bảng 3.4 Tổng hợp kiểu gen của các dòng cây T2 sau khi sàng lọc với các chỉ thị phân tử .................................................................... 69 Bảng 3.5 Các thành phần khác trong hạt đậu tương…………………….. 78 Bảng 3.6 Các đột biến off-target có thể có ở các cây đột biến T2……….. 79 Bảng Trình tự các oligonucleotide và mồi sử dụng trong nghiên phụ lục 1 cứu……………………………………………………………. 101 Bảng Kết quả sàng lọc sự có mặt của gen chuyển trong các dòng đột phụ lục 2 biến…………………………………………………………… 103
x DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1. Biểu đồ thể hiện sản lượng cây đậu tương trên thế giới (2009- 2018)…………………………………………………………... 4 Hình 1.2. Biểu đồ thể hiện sản lượng cây đậu tương ở Việt Nam (2009- 2018).………………………………………………………….. 5 Hình 1.3. Cấu tạo và mối liên hệ của các đường thuộc họ Raffinose…..... 11 Hình 1.4. Con đường sinh tổng hợp các RFOs.………………………….. 15 Hình 1.5. Quá trình hoạt động của cơ chế CRISPR/Cas ở vi khuẩn chống lại sự xâm nhập của DNA ngoại lai……………………………. 19 Hình 1.6. Cơ chế hoạt động của CRISPR/Cas9 trong trường hợp gây biến đổi trình tự gen………………………………………………… 20 Hình 1.7. Chỉnh sửa hệ gene bằng hệ thống CRISPR/Cas……………….. 21 Hình 1.8. Chỉnh sửa bằng hệ thống CRISPR/Cas9 trên một số loại cây trồng…………………………………………………………… 23 Hình 2.1. Sơ đồ minh họa nguyên lý kỹ thuật biến tính hồi tính dùng trong sàng lọc đột biến gen………………………………………...... 34 Hình 2.2. Sơ đồ minh họa nguyên lý thiết kế các chỉ thị phân tử dùng trong sàng lọc đột biến phân ly………………………………………. 38 Hình 3.1. Mối quan hệ phát sinh loài giữa các protein GOLS đã được xác định trong các cây Arabidopsis, cà chua, ngô, 23 trình tự protein GOLS trên đậu tương………………………………………….. 42 Hình 3.2. Phân tích transcriptomics cho gen GOLS trong đậu tương.......... 43 Hình 3.3. Cấu trúc gen GmGOLS và vị trí của các trình tự gRNA……....... 44 Hình 3.4. Sơ đồ thiết kế vector chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 để chuyển gen vào đậu tương……………………………………………... 44 Hình 3.5. Tỉ lệ tạo rễ tơ của các giống đậu tương chuyển gen…………… 46 Hình 3.6. Cảm ứng tạo rễ tơ trên các giống đậu tương thí nghiệm với cấu trúc pFGC/gfp trên môi trường đồng nuôi cấy………………………………….………………………….. 46
xi Hình 3.7. Cảm ứng tạo rễ tơ của các giống đậu tương thí nghiệm với cấu trúc pFGC/gfp sau 5 ngày trên môi trường cảm ứng tạo rễ……………………………………..………………………... 47 Hình 3.8. Quy trình cảm ứng tạo rễ tơ in vitro trên đậu tương thí nghiệm… 48 Hình 3.9. Biểu hiện gen GFP chỉ thị trên rễ tơ cây đậu tương…………………………………………………………... 51 Hình 3.10. Sản phẩm khuếch đại bằng các cặp mồi đặc hiệu được điện di trên gel agarose 1.5% trong đệm TAE 1X…………………….. 52 Hình 3.11. Kết quả phân tích các đột biến ghi nhận trên các dòng rễ tơ chuyển gen…………………………………………………….. 53 Hình 3.12. Minh họa quá trình chuyển gen vào đậu tương thông qua nốt lá mầm …………………………………………………………… 55 Hình 3.13. Phân tích sản phẩm PCR của các dòng đậu tương đột biến gen thế hệ T0 bằng kỹ thuật biến tính - hồi tính trên gel polyacrylamide 15%................................................................... 57 Hình 3.14. Trình tự của các vùng trình tự đích trên gen GmGOLS03 (A) và gen GmGOLS19 (B) ở cây T0………………………………… 58 Hình 3.15. Sự phân ly của các đột biến ở thế hệ T1 và T2 của dòng DT1.1… 60 Hình 3.16. Kết quả phân tích sự phân ly của các đột biến trên gen GmGOLS………………………………………………………. 61 Hình 3.17. Sự phân ly của các đột biến trên gen GmGOLS ở thế hệ T2 của dòng DT1.1…..………………………………………………... 62 Hình 3.18. Kết quả phân tích sản phẩm PCR của chỉ thị phân tử với các cây đột biến T2…………………………………………………….. 66 Hình 3.19. Kết quả phân tích sản phẩm PCR của chỉ thị phân tử GOLS- seg F1 và GOLS-seg F3 với các cây đột biến T2……………… 68 Hình 3.20 Kết quả giải trình tự vùng gen đột biến trên các cây T2 từ dòng 3.1 và 4.1 của thế hệ T0 giống Mr…………………………….. 70 Hình 3.21. Hình thái của các dòng đậu tương đột biến trồng trong nhà lưới.. 71 Hình 3.22. Biểu đồ thể hiện sự sinh trưởng và khối lượng hạt của các dòng đậu tương đột biến…………………………………………….. 72 Hình 3.23. Khảo sát khả năng nảy mầm của hạt đậu tương đột biến gen…... 73
xii Hình 3.24. Tổng số cacbohydrat hòa tan và tổng số RFOs được đo bằng HPLC………………………………………………………….. 75 Hình 3.25. Thành phần carbohydrate trong hạt đậu tương…..…………….. 76 Hình 3.26. Tỉ lệ carbohydrate dạng stachyose và sucrose trên tổng khối lượng carbohydrate hòa tan trong hạt đậu tương …………....... 77 Hình 3.27. Tỉ lệ các thành phần khác trong hạt đậu tương ………………… 78 Hình 3.28. Phân tích trình tự off-target trong genome của các dòng đậu tương đột biến thế hệ T2……………………………..………… 80 Hình 3.29. Xác định các dòng đột biến không mang gen chuyển……….…. 81
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill), thuộc họ đậu (Fabaceae) là loại cây công nghiệp có giàu dinh dưỡng và có giá trị kinh tế cao, được sử dụng làm thực phẩm cho người, thức ăn trong chăn nuôi, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp và xuất khẩu. Cây đậu tương có tính năng cải tạo đất trồng rất tốt. Hạt đậu tương là bộ phận có giá trị dinh dưỡng cao. Thành phần của hạt bao gồm glucid (12,5-25%), lidpid (12,5-25%) được xem là nguồn dầu thực vật chủ lực trên toàn cầu, protein (35- 50%) có giá trị dinh dưỡng tương đương với protein có nguồn gốc từ động vật và chiếm khoảng 69% lượng protein trên toàn cầu phục vụ cho ngành chăn nuôi gia súc, gia cầm. Ngoài ra, thành phần hạt còn chứa các vitamin nhóm (B, D, E…), một số các axit amin thiết yếu và các thành phần muối khoáng. Tuy nhiên, ngoài những thành phần dinh dưỡng giúp ích cho sức khỏe con người, trong hạt đậu tương lại có sự hiện diện của nhóm đường họ raffinose (Raffinose family oligosaccharide - RFOs) đây là nhóm đường khó tiêu chiếm 50% tổng lượng cacbon hòa tan trong hạt. Nhóm đường RFOs chứa liên kết α-galactosidic (1-6) chỉ có thể phân giải bởi enzyme galactosidase, tuy nhiên trong hệ tiêu hóa của người và nhóm động vật không nhai lại không chứa enzyme này. Thế nên, khi RFOs vào hệ tiêu hóa của người và nhóm động vật không nhai lại thì không được tiêu hóa ở dạ dày, đến ruột non nhóm đường này không được huyển hóa, không được hấp thu. Khi RFOs vận chuyển đến đại tràng được nhóm vi sinh vật ở đây lên men tạo ra carbon dioxide, hydro và mêtan gây ra hiện tượng đầy hơi, khó chịu, ngăn cản quá trình tiêu hóa. Chính nguyên nhân này đã làm giảm đi giá trị dinh dưỡng trong hạt đậu tương. Những năm qua, các nhà khoa học đã áp dụng nhiều biện pháp nghiên cứu chọn tạo giống theo hướng truyền thống như lại tạo, đột biến, chuyển gen hay công nghệ RNAi nhằm giảm thiểu thành phần RFOs nâng cao giá trị dinh dưỡng của hạt đậu tương. Tuy nhiên các phương pháp này chưa thật sự mang lại hiệu quả. Gần đây, sự phát triển của công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 mở ra cơ hội trong việc nghiên cứu chức năng gen ở mức độ DNA và được ứng dụng rộng rãi trong cải tạo giống cây trồng, đặc biệt trong đó có cây đậu tương. CRISPR/Cas9 với những ưu điểm như dễ dàng thiết kế cấu trúc chuyển gen, có thể tác động tới nhiều gen cùng một lúc với hiệu quả cao và đặc biệt là tạo được các dòng cây đột biến không mang
2 gen chuyển, công nghệ này đang được phát triển và ứng dụng rộng rãi trên nhiều loại thực vật. Đặc biệt, các nghiên cứu gần đây trên cây đậu tương cho thấy CRISPR/Cas9 đã được áp thành công để tạo các dòng đậu tương đột biến định hướng và không mang gen chuyển. Galactinol synthase (GOLS) là enzyme quan trọng xúc tác phản ứng chuyển hóa L-myo-inositiol thành galactinol. Đây là phản ứng đầu tiên trong con đường sinh tổng hợp đường khó tiêu họ raffinose. Trên đậu tương, các nghiên cứu đã xác định được 6 gen mã hóa cho enzyme GOLS, trong đó gen Glyma.03G222000 (GmGOLS03) và Glyma.19G219100 (GmGOLS19) có biểu hiện mạnh nhất trong quá trình hạt phát triển. Việc giảm hàm lượng Galactinol thông qua đột biến định hướng trên từng gen riêng biệt hoặc đồng thời cả hai gen (GmGOLS03, GmGOLS19) được kỳ vọng sẽ tăng hàm lượng sucrose, đồng thời giảm hàm lượng đường khó tiêu RFOs có trong hạt đậu tương. Các nghiên cứu trước đây về việc điều khiển biểu hiện gen mã hóa các enzyme xúc tác trong quá sinh tổng hợp nhóm đường RFOs nhằm giảm hàm lượng nhóm đường này trong hạt đậu tương đã thu được những kết quả khả quan. Trong đó, nghiên cứu giảm biểu hiện của các gen mã hóa cho enzyme raffinose synthase và stachyose synthase đã được thực hiện thành công trên đậu tương, ghi nhận việc giảm đáng kể hàm lượng raffinose và stachyose trong hạt. Điều này là minh chứng khoa học cho việc điều khiển hoạt động của các enzyme tham gia quá trình sinh tổng hợp đường khó tiêu họ raffinose trong nâng cao chất lượng hạt đậu tương. Xuất phát từ cơ sở khoa học và nhu cầu thực tiễn về tạo giống đậu tương có hàm lượng đường RFOs thấp, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 trong tạo đột biến gen GmGOLS03, GmGOLS19 trên cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) nhằm giảm lượng đường họ Raffinose trong hạt” 2. Mục tiêu của đề tài Phát triển và ứng dụng hệ thống CRISPR/Cas9 để tạo đột biến định hướng trên gen mã hóa GOLS nhằm nâng cao chất lượng hạt đậu tương. Mục tiêu cụ thể - Thiết kế được hệ thống CRISPR/Cas9 và xây dựng thành công phương pháp kiểm tra hoạt động gây tạo đột biến gen của hệ thống này trên các giống đậu tương Việt Nam.
3 - Tạo được các dòng đậu tương mang đột biến định hướng trên hai gen mã hóa enzyme GOLS thông qua hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9. - Phân tích đặc điểm, tính di truyền và ảnh hưởng của các đột biến định hướng trên hai gen mã hóa enzyme GOLS đến hình thái, sinh trưởng phát triển và thành phần hạt của các dòng đột biến tiềm năng. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài  Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học khẳng định vai trò của các gen GmGOLS tới thành phần đường trong hạt đậu tương, đồng thời cho thấy tiềm năng và hiệu quả gây tạo đột biến định hướng trên cây đậu tương thông qua hệ thống chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9.  Ý nghĩa thực tiễn Các dòng đậu tương đột biến không mang gen chuyển là vật liệu cho công tác chọn dòng, lai tạo và phát triển các giống đậu tương Việt Nam có năng suất và chất lượng tốt. 4. Những đóng góp mới của luận án - Đã thiết kế thành công cấu trúc chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9 nhằm gây tạo đột biến định hướng trên các gen mã hóa enzyme GOLS và kiểm tra hoạt động thông qua hệ thống cảm ứng rễ tơ in vitro trên giống đậu tương ĐT22 và ĐT26. - Tạo thành công các dòng đậu tương mang đột biến định hướng trên các gen mã hóa cho enzyme GOLS và xác định được các dòng đậu tương (mang đột biến tiềm năng có hàm lượng đường khó tiêu trong hạt giảm. - Khẳng định vai trò của hai gen GmGOLS03 và GmGOLS19 tới con đường sinh tổng hợp đường khó tiêu họ raffinose trên cây đậu tương.
4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tình hình sản xuất và chọn tạo giống đậu tương 1.1.1 Tình hình sản xuất 1.1.1.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới Đậu tương là cây thực phẩm ngắn ngày, giàu dinh dưỡng, có giá trị kinh tế cao, được dùng làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, làm hàng xuất khẩu và là loài cây cải tạo đất trồng rất tốt [1]. Do có khả năng thích nghi rộng với các điều kiện khí hậu và sinh thái khác nhau nên đậu tương được trồng rộng rãi trên cả năm châu lục, tập trung nhiều nhất ở Châu Mỹ kế tiếp là Châu Á, sản lượng đậu tương trên thế giới từ năm 2009 đến 2018 đều tăng (Hình1.1). Bình quân hàng năm trên thế giới có khoảng 91 triệu ha đậu tương được gieo trồng với năng suất bình quân khá cao 22-23 tạ/ha. Trong đó 90% sản lượng đậu tương thế giới tập trung vào năm nước Mỹ, Brazil, Arghentina, Trung Quốc và Ấn Độ. Mỹ là nước có diện tích, năng suất đậu tương đứng vào loại hàng đầu thế giới. Năm 2014, diện tích đậu tương chuyển gen trồng ở Mỹ đạt 82% (90,7 triệu ha) trong tổng số 111 triệu ha đậu tương trồng trên toàn thế giới [2]. Hình 1.1. Biểu đồ thể hiện sản lượng cây đậu tương trên thế giới (2009-2018) Nguồn: Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA)*số liệu dự báo
5 Một trong những nguyên nhân dẫn đến việc tăng diện tích gieo trồng là do nhu cầu tiêu thụ đậu tương trên thế giới tăng bình quân 4-5%/năm, riêng Trung Quốc tăng 8% bình quân tiêu dùng đậu tương tại Trung Quốc là 36,2 kg/người/năm. Châu Á là nơi tiêu thụ gần 90 triệu tấn/năm, chiếm 40% sản lượng đậu tương toàn cầu. Tuy nhiên, sản xuất tại chỗ mới đạt 26,6 triệu tấn/năm còn phải phụ thuộc tới 70% vào lượng đậu tương nhập khẩu (khoảng 63,3 triệu tấn/năm). Trong số các nước châu Á, Trung Quốc là nước có diện tích đậu tương lớn nhất 8,8 triệu ha, năng suất cao nhất 16,5 tạ/ha đứng hàng thứ tư trên thế giới. Ở khu vực Đông Nam Á, Indonesia là nước có diện tích trồng đậu tương lớn nhất với 0,72 triệu ha. Thái Lan là nước đạt năng suất cao nhất đạt 16,3 tạ/ha, kế đến là Việt Nam 14,6 tạ/ha, thấp nhất là Philippines 10,0 tạ/ha. Theo FAO năm 2019 diện tích trồng đậu tương trên thế giới đặt 121 triệu ha và sản lượng đặt 2,8 tấn/ha [2]. 1.1.1.2 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam Ở nước ta, cây đậu tương được phát triển từ rất sớm với giống đầu tiên từ cây hoang dại sau đó được thuần hóa và được trồng như một cây có giá trị dinh dưỡng cao. Từ năm 1993 cả nước đã hình thành sáu vùng sản xuất đậu tương chủ lực bao gồm vùng Đông Nam Bộ với diện tích trồng đậu tương lớn nhất cả nước (chiếm 26,2% diện tích đậu tương của cả nước), khu vực miền núi Bắc Bộ (24,7%), vùng đồng bằng sông Hồng (17,5%), đồng bằng sông Cửu Long (12,4%). Tổng diện tích sáu vùng này chiếm 66,6% tổng diện tích đậu tương cả nước. Về mùa vụ, đậu tương trồng ở vụ xuân chiếm 14,2% diện tích, vụ hè thu (31,2%), vụ mùa (2,68%), vụ thu đông (22,1%), vụ đông xuân (29,7%) [1]. Hình 1.2. Biểu đồ thể hiện sản lượng cây đậu tương ở Việt Nam (2009-2018) Nguồn: Tổng cục thống kê *số liệu dự báo