Luận án Tiến sĩ Khoa học vật liệu: Nghiên cứu chế tạo bộ cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở các vật liệu nano vàng, bạc - oxide graphene khử để phát hiện một số vi khuẩn gây bệnh

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:154

Thêm vào BST

Báo xấu

40
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài nghiên cứu nhằm tăng cường sự ổn định điện hóa của điện cực in lưới cacbon bằng một số hệ vật liệu như bạc-oxide graphene khử, hạt nano vàng và màng nano vàng để hình thành bộ cảm biến sinh học; phát triển thành công bộ cảm biến điện hóa trên cơ sở điện cực in lưới cacbon biến tính với các hệ vật liệu trên và hệ đo điện hóa cầm tay để phát hiện nhanh một số chủng vi khuẩn gây bệnh.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Khoa học vật liệu: Nghiên cứu chế tạo bộ cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở các vật liệu nano vàng, bạc - oxide graphene khử để phát hiện một số vi khuẩn gây bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ---------- Vũ Quang Khuê NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA TRÊN CƠ SỞ CÁC VẬT LIỆU NANO VÀNG, BẠC-OXIDE GRAPHENE KHỬ ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU HÀ NỘI - 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ---------- Vũ Quang Khuê NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA TRÊN CƠ SỞ CÁC VẬT LIỆU NANO VÀNG, BẠC-OXIDE GRAPHENE KHỬ ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH Ngành: Khoa học vật liệu Mã số : 9440122 LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. VŨ NGỌC PHAN 2. TS. TRẦN QUANG HUY HÀ NỘI - 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của tập thể giáo viên hướng dẫn. Các số liệu, kết quả nghiên cứu là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tập thể hướng dẫn Tác giả luận án TS. Vũ Ngọc Phan TS. Trần Quang Huy Vũ Quang Khuê
LỜI CẢM ƠN Với tấm lòng kính trọng, tôi xin bày tỏ sự biết ơn đối với TS. Vũ Ngọc Phan và TS. Trần Quang Huy bởi những chỉ dẫn quý báu về phương pháp luận và định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn tôi, động viên, khích lệ và hết lòng giúp đỡ để luận án được hoàn thành. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đối với Ban giám đốc, toàn thể cán bộ, giáo viên Viện Tiên tiến Khoa học và Công nghệ (AIST), Trường Đại học Bách khoa Hà Nội. Các cán bộ nghiên cứu tại Trung tâm nghiên cứu Y sinh, Phòng thí nghiệm Siêu cấu trúc, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Trường Cao đẳng Công nghiệp Bắc Ninh đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và thời gian, hỗ trợ về chuyên môn để tác giả hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới GS.TS. Lê Anh Tuấn - Viện Nghiên cứu Nano - Trường Đại học Phenikaa và tất cả các thành viên nhóm nghiên cứu Vật liệu Nano Y sinh và Môi trường (NEB) đã nhiệt tình giúp đỡ để tôi hoàn thành luận án này. Tôi cũng xin được dành những lời cảm ơn sâu nặng đến gia đình tôi: bố, mẹ, vợ, các con đã yêu thương, người thân và bạn bè đã cảm thông và chia sẻ, động viên, hỗ trợ mọi điều kiện để tôi có thể tập trung học tập và nghiên cứu trong suốt những năm tháng học tập tại trường Đại học Bách khoa Hà Nội. Xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ kinh phí từ nguồn học bổng cho đào tạo nghiên cứu sinh của Bộ Giáo dục và Đào tạo (đề án 911), nhiệm vụ Nghị định thư giữa chính phủ Việt Nam và chính phủ Italia, mã số nhiệm vụ: NĐT.05.ITA/15, đề tài Khoa học và công nghệ tỉnh Bắc Ninh: KCBN-(08).18. Xin chân thành cảm ơn! Tác giả luận án Vũ Quang Khuê
MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ....................................................... i DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU.............................................................................. iii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ................................................................... iv MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN........................................................................................... 6 1.1. Cảm biến sinh học và nhiễm trùng bệnh viện ................................................. 7 1.1.1. Cảm biến sinh học và cảm biến sinh học điện hóa .............................. 7 1.1.2. Tình hình nghiên cứu cảm biến sinh học trong và ngoài nước ............ 9 1.1.3. Nhiễm trùng bệnh viện ....................................................................... 11 1.1.4. Vi khuẩn gây bệnh nhiễm trùng bệnh viện ........................................ 13 1.2. Cảm biến sinh học trên cở sở SPE phát hiện vi khuẩn gây bệnh .................. 15 1.2.1. Điện cực in lưới cacbon- SPE ........................................................... 15 1.2.2. Vật liệu nano kim loại quý để biến tính điện cực .............................. 16 1.2.2.1. Vật liệu nano vàng ...................................................................... 16 1.2.2.2. Vật liệu nano lai bạc - oxide graphene khử ................................ 17 1.2.3. Vật liệu nano kim loại quý biến tính điện cực SPE ........................... 17 1.2.4. Phương pháp biến tính SPE ............................................................... 19 1.3. Các phương pháp cố định kháng thể trên bề mặt điện cực ........................... 21 1.3.1. Kháng nguyên, kháng thể................................................................... 21 1.3.2. Liên kết cộng hóa trị .......................................................................... 22 1.3.3. Ái lực sinh học ................................................................................... 24 1.3.4. Hấp phụ vật lý .................................................................................... 24 1.4. Kỹ thuật đo điện hóa trong cảm biến sinh học .............................................. 25 1.4.1. Phương pháp quét thế vòng tuần hoàn (CV) ...................................... 26 1.4.2. Phương pháp đo Von - Ampe xung vi sai (DPV) .............................. 28 1.4.3. Phương pháp phổ tổng trở điện hóa (EIS) ......................................... 29 1.5. Thiết bị cầm tay cho cảm biến sinh học ........................................................ 31 Chương 2. CHẾ TẠO CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA TRÊN CƠ SỞ ĐIỆN CỰC IN LƯỚI CACBON BIẾN TÍNH VỚI BẠC-OXIDE GRAPHENE KHỬ .................. 35 2.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 36 2.2. Vật liệu và phương pháp ............................................................................... 37 2.2.1. Vật liệu, hóa chất................................................................................ 37 2.2.2. Đảm bảo an toàn sinh học .................................................................. 37 2.2.3. Quy trình chế tạo vật liệu nano lai AgNPs-rGO ................................ 37 2.2.4. Biến tính điện cực in lưới cacbon bằng vật liệu bạc-oxide graphene 38 2.2.5. Cố định kháng thể lên trên bề mặt điện cực biến tính........................ 39 2.2.6. Khảo sát khả năng phát hiện vi khuẩn Salmonella ............................ 40 2.3. Kết quả và thảo luận ...................................................................................... 41 2.3.1. Sự hình thành của hạt bạc trên tấm graphene oxít ............................. 41 2.3.2. Hình thái và kích thước hạt nano bạc trên graphene oxít .................. 43 2.3.3. Khảo sát hình thái bề mặt điện cực biến tính ..................................... 44 2.3.4. Đặc tuyến điện hóa của điện cực biến tính ........................................ 46 2.3.4.1. Đặc tuyến điện hóa của điện cực biến tính ................................. 46 2.3.4.2. Đặc trưng tín hiệu cố định kháng thể ......................................... 48
2.3.5. Phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại biến đổi Fourie ................................ 50 2.3.6. Phát hiện vi khuẩn Salmonella ........................................................... 51 2.3.7. Độ chọn lọc và giới hạn phát hiện vi khuẩn Salmonella ................... 53 2.4. Kết luận chương 2 ......................................................................................... 55 Chương 3. CHẾ TẠO CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA TRÊN CƠ SỞ ĐIỆN CỰC IN LƯỚI CACBON BIẾN TÍNH .................................................................................. 57 HẠT NANO VÀNG (AuNPs).................................................................................. 57 3.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 58 3.2. Vật liệu và phương pháp ............................................................................... 59 3.2.1. Vật liệu, hóa chất................................................................................ 59 3.2.2. Đảm bảo an toàn sinh học .................................................................. 59 3.2.3. Quy trình chế tạo hạt nano vàng ........................................................ 59 3.2.4. Biến tính điện cực in lưới cacbon bằng hạt nano vàng ...................... 60 3.2.5. Cố định kháng thể bằng liên kết cộng hóa trị .................................... 60 3.2.6. Khảo sát cảm biến phát hiện vi khuẩn E.coli O157 và MRSA ........... 61 3.3. Kết quả và thảo luận ...................................................................................... 62 3.3.1. Hình thái và kích thước hạt nano vàng .............................................. 62 3.3.1.1. Sự hình thành hạt nano vàng phụ thuộc vào điện áp điện hóa ... 62 3.3.1.2. Sự hình thành hạt nano vàng phụ thuộc vào thời gian điện hóa 63 3.3.1.3. Hình thái và kích thước hạt nano vàng quan sát bằng TEM ...... 65 3.3.2. Khảo sát hình thái bề mặt của điện cực biến tính .............................. 67 3.3.3. Đặc tuyến điện hóa của điện cực biến tính ........................................ 68 3.3.4. Điện cực biến tính phụ thuộc kích thước hạt nano vàng.................... 71 3.3.5. Đặc trưng tín hiệu cố định kháng thể ................................................. 73 3.3.6. Khảo sát khả năng phát hiện vi khuẩn E.coli O157 của cảm biến ..... 74 3.3.6.1. Phát hiện vi khuẩn E.Coli O157 ................................................. 74 3.3.6.2. Độ nhạy và độ chọn lọc của cảm biến ........................................ 74 3.3.6.3. Thời gian sống của cảm biến ...................................................... 76 3.3.7. Khảo sát phát hiện vi khuẩn MRSA của cảm biến ............................. 77 3.4. Kết luận chương 3 ......................................................................................... 82 Chương 4. CHẾ TẠO CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA TRÊN CƠ SỞ ĐIỆN CỰC IN LƯỚI CACBON BIẾN TÍNH MÀNG NANO VÀNG ........................................... 84 4.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 85 4.2. Vật liệu và phương pháp ............................................................................... 86 4.2.1. Vật liệu, thiết bị .................................................................................. 86 4.2.2. Đảm bảo an toàn sinh học và phương pháp phát hiện vi khuẩn MRSA .......................................................................................................................... 86 4.2.3. Biến tính bề mặt điện cực SPE ........................................................... 87 4.3. Kết quả và thảo luận ...................................................................................... 87 4.3.1. Hình thái bề mặt điện cực quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét ... 87 4.3.2. Khảo sát các đặc tuyến điện hóa của điện cực biến tính .................... 89 4.3.3. Đặc tuyến điện hóa của điện cực biến tính phụ thuộc chiều dày màng nano vàng .......................................................................................................... 90 4.3.4. Diện tích hoạt động điện hóa của điện cực biến tính ......................... 92 4.3.5. Đặc trưng tín hiệu cố định kháng thể ................................................. 93 4.3.6. Phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại biến đổi Fourier ............................... 94
4.3.7. Phát hiện vi khuẩn MRSA................................................................... 95 4.4. Kết luận chương 4 ......................................................................................... 97 Chương 5. CHẾ TẠO THIẾT BỊ ĐO CẦM TAY CHO CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA . 99 5.1. Đặt vấn đề ................................................................................................... 100 5.2. Vật liệu và phương pháp ............................................................................. 101 5.2.1. Vật liệu và linh kiện ......................................................................... 101 5.2.2. Thiết kế các khối của thiết bị ........................................................... 101 5.2.2.1. Các khối cơ bản ........................................................................ 102 5.2.2.2. Khối phát tín hiệu tới cảm biến ................................................ 103 5.2.2.3. Khối giao tiếp và hiển thị ......................................................... 104 5.2.2.4. Khối xử lý trung tâm ................................................................ 105 5.2.2.5. Thiết kế vỏ hệ đo ...................................................................... 106 5.3. Kết quả và thảo luận .................................................................................... 107 5.3.1. Bảng mạch chủ và tín hiệu thực nghiệm .......................................... 107 5.3.2. Phần mềm tích hợp thiết bị đo ......................................................... 108 5.3.3. Thông số kỹ thuật của thiết bị đo ..................................................... 109 5.3.4. Các bước thực nghiệm với hệ đo ..................................................... 110 5.4. Kết luận chương 5 ....................................................................................... 112 KẾT LUẬN CHUNG ............................................................................................. 113 KIẾN NGHỊ VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................................. 114 XÁC NHẬN THỬ NGHIỆM CỦA BỘ THIẾT BỊ CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA ...... 115 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ................. 116 QUYẾT ĐỊNH CHẤP NHẬN ĐƠN GIẢI PHÁP HỮU ÍCH ............................... 117 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 118
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Từ tiếng Anh đầy đủ Nghĩa tiếng Việt Ab Antibody Kháng thể ADC Analog to digital converter Chuyển đổi tương tự - số Ag Antigen Kháng nguyên AgNPs Silver nanoparticles Hạt nano bạc DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic APTES 3-aminopropyl–triethoxy 3-aminopropyl–triethoxy-silan silane RNA Ribonucleic acid Axít ribonucleic AuNFs Gold nano films Màng nano vàng AuNPs Gold nanoparticles Hạt nano vàng BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò EID50 50% Empryo infective dose Liều gây nhiễm trên phôi 50% CE Counter electrode Điện cực đối CEA Carcinoma Embryonic Antigen Kháng nguyên ung thư biểu mô phôi CFU Colony Forming Unit Đơn vị lạc khuẩn CNC Computer numerical control Điều khiển số bằng máy tính CNTs Carbon nanotubes Ống nano cacbon CV Cyclic Voltammetry Quét thế vòng tuần hoàn DI Deionized Water Nước khử ion DPV Differential Pulse Đo Von - Ampe xung vi sai Voltammetry EDX Energy-dispersive X-ray Phổ tán sắc năng lượng tia X spectroscopy EIS Electrochemical Impedance Đo phổ tổng trở điện hóa Spectroscopy ELISA Enzyme linked immunosorbent Kỹ thuật miễn dịch hấp phụ gắn men assay FET Field-effect transistor Transistor trường FTIR Fourier transform infrared Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier spectroscopy GA Glutaraldehyde Glutaraldehyde GC Graphene carbon Graphene cacbon GMBS Gamma-maleimidobutyrloxy Nhóm chức NHS sulphosuccinimide GO Graphene oxide Graphen oxít HCW Health care worker Nhân viên y tế IC Integrated circuit Mạch tích hợp LCD Liquid crystal display Màn hình tinh thể lỏng LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LSV Linear Sweep Voltammetry Đo xung thế tuyến tính i
L-W-H Length - Width - High Dài - rộng - cao MA Multistep Amperometry Đo dòng đa bước MRSA methicillin-resistant Khuẩn tụ cầu vàng Staphylococcus aureus MTS Mercaptopropyl- Mercaptopropyl-trimethoxysilane trimethoxysilane MWNCTs Mutil walled carbon Ống nano cacbon đa vách nanotubes NHS N-Hydroxysuccinimide N-Hydroxysuccinimide OCP Open Circuit Potentionmetry Đo thế dòng mở PBS Phosphate buffered saline Dung dịch đệm phosphate PC Personal Computer Máy tính để bàn PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase PrA Protein A Protein A Pt Platinum Platin Rct Resistor charge transfer Điện trở chuyển tích RE Reference electrode Điện cực chuẩn S/N Signal/noise Tín hiệu/nhiễu SAM Self-assembled monolayer Đơn lớp tự sắp xếp SEM Scanning electron microscopy Hiển vi điện tử quét SPE Screen printed electrode Điện cực in lưới SWNCTs Sigle wall carbon nanotubes Ống nano cacbon đơn vách TEM Transmission electron Hiển vi điện tử truyền qua microscopy USB Universal Serial Bus Kết nối chuẩn USB USD United States Dollar Đôla Mỹ UV Ultraviolet Tử ngoại WE Working electrode Điện cực làm việc WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới ii
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Trang Bảng 1.1: Tổng hợp một số kết quả nghiên cứu trên thế giới về cảm biến điện hóa phát hiện vi khuẩn Salmonella ................................................................................... 9 Bảng 1.2: Tổng hợp một số kết quả nghiên cứu cảm biến sinh học điện hóa ở Việt Nam .......................................................................................................................... 10 Bảng 2.1: Các giá trị Ipeak, Ip,a, Ip,c từ kế quả thực nghiệm đo CV đối với điện cực SPE ở các trạng thái mỗi bước biến tính cố định kháng thể .................................... 49 Bảng 2.2: Tổng hợp các giá trị Ip,a, Ip,c, Ipeak and ∆Ipeak từ phương pháp đo CV của cảm biến sinh học dò tìm vi khuẩn Salmonella ở các nồng độ khác nhau ............... 52 Bảng 2.3: So sánh kết quả phát hiện vi khuẩn Salmonella của một số phương pháp, loại cảm biến sinh học điện hóa ............................................................................... 54 Bảng 3.1: Tổng hợp các thông số điện hóa thu được từ kết quả đo CV và EIS của các điện cực SPE trần, SPE/AuNPs ......................................................................... 70 Bảng 3.2: Tổng hợp các thông số điện hóa thu được từ kết quả đo CV của các điện cực SPE trần, SPE/AuNPs-10 nm , SPE/AuNFs-15 nm và SPE/AuNPs-25 nm ..... 72 Bảng 3.3: Tổng hợp các thông số điện hóa thu được từ kết quả đo EIS của các điện cực SPE trần, SPE/AuNPs-10 nm, SPE/AuNFs-15 nm và SPE/AuNPs-25 nm ...... 72 Bảng 3.4: Tổng hợp các thông số điện hóa thu được từ kết quả đo DPV của các điện cực SPE trần, SPE/AuNPs-10 nm, SPE/AuNFs-15 nm và SPE/AuNPs-25 nm ...... 72 Bảng 3.5: Các giá trị Ip,a, Ip,c, Ipeak tính toán được từ phép đo CV đối với điện cực SPE/AuNPs sau các bước cố định kháng thể ........................................................... 73 Bảng 3.6: Các giá trị Rct tính toán được từ việc FIT sử dụng phần mềm Equivalent circuit analysis trong phép đo EIS đối với cảm biến miễn dịch chế tạo bằng điện cực SPE/AuNPs phát hiện vi khuẩn E.coli ở các nồng độ khác nhau ...................... 75 Bảng 3.7: Tổng hợp các kết quả nghiên cứu công bố trong thời gian gần đây khi sử dụng điện cực SPE biến tính vật liệu nano phát hiện một số tác nhân gây bệnh ..... 78 Bảng 4.1: Tổng hợp các thông số điện hóa thu được từ kết quả đo CV và EIS của các điện cực SPE trần, SPE/AuNFs ......................................................................... 90 Bảng 4.2: Tổng hợp các thông số điện hóa thu được từ kết quả đo CV của các điện cực SPE trần, SPE/AuNFs-10 nm , SPE/AuNFs-20 nm và SPE/AuNFs-30 nm ..... 91 Bảng 4.3: Tổng hợp các thông số điện hóa thu được từ kết quả đo EIS của các điện cực SPE trần, SPE/AuNFs-10 nm , SPE/AuNFs-20 nm và SPE/AuNFs-30 nm ..... 91 Bảng 4.4: Diện tích hoạt động điện hóa của điện cực biến tính và tỷ lệ diện tích hoạt động điện hóa so với diện tích hình học của điện cực SPE biến tính vật liệu nano vàng .......................................................................................................................... 92 Bảng 4.5: Các giá trị Ip,a, Ip,c, Ipeak tính toán được từ phép đo CV đối với điện cực SPE/AuNFs sau các bước cố định kháng thể ........................................................... 94 Bảng 4.6: Tổng hợp giá trị điện trở Rct theo nồng độ vi khuẩn MRSA .................. 97 iii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1: Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học (A), cảm biến điện hóa (B) . 7 Hình 1.2: Công trình công bố quốc tế giai đoạn 2009-2019 liên quan đến cảm biến sinh học (A), cảm biến miễn dịch (B) ........................................................................ 8 Hình 1.3: Các phương pháp thu nhận nhiễm trùng bệnh viện [2] ............................ 12 Hình 1.4: Một số nhiễm trùng bệnh viện do vi khuẩn gây lên theo thống kê với 13,829 bệnh nhân tại Châu Âu [2]............................................................................ 13 Hình 1.5: Điện cực SPE biến tính vật liệu nano vàng và vật liệu nano lai AgNPs-GO .................................................................................................................................. 18 Hình 1.6: Hạt AuNPs được biến tính và trực tiếp cố định trên điện cực rắn để tăng cường đầu dò và tín hiệu điện đầu ra khi phát hiện tác nhân gây bệnh (A), các đầu dò được cố định trên đế cứng hạt AuNPs được cố định với kháng thể thứ 2 nhằm tăng cường tín hiệu điện đầu ra của cảm biến (B) .................................................... 19 Hình 1.7: Phương pháp nhỏ phủ và quay phủ cho lắng đọng vật liệu nano lên bề mặt điện cực làm việc của SPE ....................................................................................... 20 Hình 1.8: Quy trình cố định bằng phương pháp liên kết cộng hóa trị thông qua nhóm thiol (ban đầu là - SH, sau đó là - NHS), quy trình (A), liên kết giữa các nhóm chức (B)[19] ............................................................................................................. 23 Hình 1.9: Quy trình cố định bằng phương pháp liên kết cộng hóa trị của kháng thể hCG với nhóm carboxyl-terminated Ppy-PPa sử dụng EDC và NHS [189]............ 24 Hình 1.10: Đồ thị quét thế vòng tuần hoàn CV thời điểm, điện thế quét (A), biểu diễn dòng điện tương ứng (B) .................................................................................. 26 Hình 1.11: Quan hệ giữa điện thế và dòng điện trong quét thế tuần vòng ............... 27 Hình 1.12: Thế ứng dụng biên độ, chu kỳ xung (A), đặc trưng đường cong Vôn- ampe (B) trong phương pháp đo DPV...................................................................... 28 Hình 1.13: Sơ đồ khối mô phỏng nguyên lý đo tổng trở .......................................... 29 Hình 1.14: Biểu diễn hình học các phần tử phức ..................................................... 30 Hình 1.15: Mạch tương đương ứng với hệ điện hóa bị khống chế........................... 30 Hình 1.16: (A) Sơ đồ biểu diễn tổng trở trên mặt phẳng phức và(B) mạch điện tương đương Randles................................................................................................ 31 Hình 1.17: Hệ thống phát hiện vi khuẩn bằng thiết bị không dây thông qua điện thoại thông minh (a) đưa mẫu phân tích vào cảm biến, (b) hình dạng kích thước của cảm biến, (c) kết quả hiển thị hoạt động của cảm biến trên điện thoại, (d) sơ đồ khối hệ thống cảm biến không dây [77] ........................................................................... 32 Hình 1.18: Bảng mạch điện tử PCB với kích thước 2.5 inches (a) và cảm biến được xây dựng từ điện cực SPE vàng lắp với đầu kết nối giao tiếp với điện thoại [170] . 33 Hình 2.1: Quy trình tổng hợp chế tạo vật liệu nano lai AgNPs-GO ........................ 38 Hình 2.2: Quy trình biến tính điện cực chế tạo cảm biến sinh học điện hóa dò tìm vi khuẩn Salmonella ..................................................................................................... 40 Hình 2.3: Sơ đồ hệ đo điện hóa sử dụng máy đo Palmsen 3.0 ................................. 40 Hình 2.4: Giản đồ nhiễu xạ tia X của vật liệu nano lai AgNPs-GO......................... 42 Hình 2.5: Phổ hồng ngoại FTIR của GO (a), AgNPs-GO (b) .................................. 42 Hình 2.6: Phổ hấp thụ UV-vis của hạt nano lai AgNPs-GO .................................... 43 iv
Hình 2.7: Ảnh hiển vi điện tử truyền qua TEM của hạt nano lai AgNPs-GO sau khi chế tạo (A) và 6 tháng sau khi bảo quản ở 40C bịt kín trong giấy bạc (B)............... 44 Hình 2. 8: Ảnh hiển vi điện tử quét có độ phân giải cao (SEM) bề mặt SPE trần (A- C) và SPE biến tính vật liệu AgNPs-GO (B-D) ....................................................... 45 Hình 2.9: Phổ EDX của điện cực SPE biến tính AgNPs-GO................................... 45 Hình 2.10: Đặc tuyến CV điện cực biến tính AgNPs-GO (b) và điện cực SPE trần (a) trong dung dịch điện ly K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 5,0 mM, KCl 0,1 M, tốc độ quét 50 mVs-1............................................................................................................ 46 Hình 2.11: Đặc tuyến CV điện cực SPE/AgNPs-GO trong dung dịch K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]5,0 mM, KCl 0,1 M, tốc độ quét 50 mVs-1 với 30 vòng quét .................................................................................................................................. 47 Hình 2.12: Phổ tổng trở điện hóa của điện cực SPE trần và điện cực SPE biến tính vật liệu nano lai AgNPs-GO trong dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 5,0 mM. ...... 48 Hình 2.13: Quy trình cố định kháng thể IgG của vi khuẩn Salmonella trên bề mặt điện cực SPE/AgNPs-GO ......................................................................................... 48 Hình 2.14: Đường CV của điện cực: (a): SPE; (b): SPE/AgNPs-GO; (c): SPE/AgNPs-GO/SH và (d):SPE/AgNPs-GO/NHS/Ab; (e)SPE/AgNPs- GO/NHS/Ab/BSA trong dung dịch K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]5,0mM, KCl 0,1 M, tốc độ quét 50 mVs-1 ................................................................................................. 49 Hình 2.15: Đường CV của 7 điện cực SPE/AgNPs-GO/NHS/Ab/BSA (cảm biến sinh học) khác nhau (cùng sử dụng một qui trình cố định kháng thể) trong dung dịch .................................................................................................................................. 50 Hình 2.16: Phổ hấp thụ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier trong vùng sóng 800- 4000cm-1 của điện cực SPE/AgNPs-GO@MTS@GMBS@Ab............................... 51 Hình 2.17: Đường CV của cảm biến sinh học (a) và cảm biến /vi khuẩn Salmonella ở các nồng độ (b) 101 CFU/mL, (c) 102CFU/mL, (d) 103CFU/mL, (f) 104CFU/mL, (g) 105CFU/mL trong dung dịch điện ly 5,0 mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] và 0,1M KCl ở tốc độ quét 50 mVs-1 ...................................................................................... 52 Hình 2.18: Sự thay đổi tín hiệu đầu ra của cảm biến sinh học đường CV của cảm biến sinh học (a) và cảm biến miễn dịch/vi khuẩn Salmonella ở các nồng độ (b) 101 CFU/mL, (c) 102CFU/mL, (d) 103CFU/mL, (f) 104CFU/mL, (g) 105CFU/mL trong dung dịch điện ly 5,0 mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] và 0,1 M KCl ở tốc độ quét 50 mVs-1 ........................................................................................................................ 53 Hình 2.19: Đường CV của cảm biến sinh học (b) và cảm biến miễn dịch/vi khuẩn E.coli O157(a) nồng độ 105CFU/mL trong dung dịch điện ly 5,0 mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] và 0,1 M KCl ở tốc độ quét 50 mVs-1 ........................... 53 Hình 3.1: Mô hình chế tạo hạt nano vàng AuNPs, quá trình chế tạo tại phòng thí nghiệm (A), mô hình nguyên lý chế tạo hạt AuNPs (B) .......................................... 59 Hình 3.2: Quy trình biến tính điện cực để chế tạo cảm biến phát hiện vi khuẩn E.coli .................................................................................................................................. 61 Hình 3.3: Màu sắc các mẫu AuNPs chế tạo ở các mức điều chế điện áp biên độ xung khác nhau, cùng tần số và thời gian điều chế .................................................. 62 Hình 3.4: Phổ hấp thụ UV-vis các mẫu AuNPs chế tạo ở các mức điều chế điện áp biên độ xung khác nhau, cùng tần số và thời gian điều chế ..................................... 63 v
Hình 3.5: Màu sắc các mẫu AuNPs chế tạo ở điều kiện thời gian khác nhau, cùng điều kiện tần số và điện áp điều chế ......................................................................... 64 Hình 3.6: Phổ hấp thụ các mẫu AuNPs chế tạo ở điều kiện thời gian khác nhau, cùng điều kiện tần số và điện áp điều chế ................................................................ 64 Hình 3.7: Hình ảnh hiển vi điện tử truyền qua TEM các mẫu điều chế ở mức điện áp khác nhau 6V (A), 9V (B), 12V (C), 15V (D) ......................................................... 65 Hình 3.8: Hình ảnh hiển vi điện tử truyền qua TEM các mẫu điều chế trong các khoảng thời gian khác nhau 1h (A), 2h (B), 3h (C), 4h (D) ..................................... 66 Hình 3.9: (A-B) Ảnh hiển vi điện tử quét có độ phân giải cao SEM của bề mặt điện cực SPE trần, (C-D) bề mặt điện cực SPE biến tính AuNPs ở độ phân giải 500 nm và 1m ...................................................................................................................... 67 Hình 3.10: Ảnh Phổ EDX xác nhận thành phần và độ sạch của điện cực SPE biến tính hạt nano vàng ..................................................................................................... 68 Hình 3.11: Đặc trưng điện hóa của điện cực biến tính SPE/AuNPs,(A) thế quét vòng tuần hoàn, (B) phổ tồng trở điện hóa EIS, (C) ổn định của điện cực biến tính với 30 vòng quét CV, (D)Von - Ampe xung vi sai trong dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl ................................................................. 69 Hình 3.12: Đặc trưng điện hóa trong phương pháp đo Von - Ampe xung vi sai DPV với bước xung Epulse = 10 mV trong dải 0,1V đến 0,35 V, tốc độ quét 20 mVs-1, t pulse = 0,02s trong dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl............................................................................................................................ 70 Hình 3.13: Đặc trưng điện hóa của điện cực SPE/AuNPs phụ thuộc kích thước hạt nano vàng, (A)thế quét vòng tuần hoàn, (B) phổ tồng trở điện hóa EIS,(C) Von - Ampe xung vi sai DPV trong dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl ........................................................................................................ 71 Hình 3.14: (A) Đặc trưng điện hóa của điện cực biến tính SPE/AuNPs cố định phần tử sinh học SPE/AuNPs (a), SPE/AuNPs/NHS (b), SPE/AuNPs/NHS/Ab (c), SPE/AuNPs/NHS/Ab/BSA (d); (B) Ổn định điện hóa của cảm biến trong dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl, tốc độ quét 50 mVs-1 73 Hình 3.15: (A-B) Cảm biến miễn dịch có điện cực biến tính SPE/AuNPs phát hiện vi khuẩn E.coli biến ở các nồng độ 101CFU/ml (a), 102CFU/ml (b), 103CFU/ml (c), 104CFU/ml (d), 105CFU/ml (e), 106CFU/ml (f) bằng phương pháp CV-EIS trong dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl; (C) Sự thay đổi giá trị Rct của cảm biến tuyến tính theo nồng độ vi khuẩn E.coli .................... 75 Hình 3.16: (A) Độ chọn lọc của cảm biến khi khảo sát ủ với vi khuẩn đối chứng Salmonella nồng độ 1x103cfu/ml; (B) Kiểm tra thời gian sống của cảm biến bằng phương pháp quét thế vòng tuần hoàn CV sau 21 ngày bảo quản trong kho ở điều kiện 40C, PBS pH 7,4. Nồng độ vi khuẩn E.coli ủ kiểm tra 102cfu/ml ................... 76 Hình 3.17: (A) kiểm tra sự có mặt của MRSA trong mẫu; (B) đặc trưng CV các bước trong quá trình cố định kháng thể MRSA, (a) SPE trần, (b)SPE/AuNPs - 15 nm, (c) SPE/AuNPs/NHS, (d) SPE/AuNPs/NHS/Ab, (e) SPE/AuNPs/NHS/Ab/BSA, (f) SPE/AuNPs/NHS/Ab/BSA/MRSA trong dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl ................................... 77 Hình 3.18: (A) Phổ Nyquist plots của cảm biến phát hiệu vi khuẩn MRSA ở các nồng độ 10 CFU/mL(a), 102 CFU/mL (b), 103 CFU/mL (c), 104 CFU/mL (d), 105 vi
CFU/mL €, 106 CFU/mL (f); (B) Dải phát hiện của cảm biến thông qua Rct ở nồng độ khác nhau; (C) độ chọn lọc của cảm biến khi sử dụng vi khuẩn đối chứng E.coli O157 ở nồng độ 106 CFU/mL .................................................................................. 78 Hình 4.1: (A) hệ phún xạ 1045 ION Sputter,(B) mặt lạ - Mask,(C) điện cực SPE biến tính màng nano vàng......................................................................................... 87 Hình 4.2: (A-B) Ảnh hiển vi điện tử quét có độ phân giải cao SEM của bề mặt điện cực SPE trần, (C-D) bề mặt điện cực SPE biến tính AuNFs ở độ phân giải 500 nm và 1m ...................................................................................................................... 88 Hình 4.3: Phổ EDX xác nhận thành phần và độ sạch của điện cực SPE biến tính màng mỏng nano vàng.............................................................................................. 89 Hình 4.4: Đặc trưng điện hóa của điện cực biến tính SPE/AuNFs chiều dày màng là 20 nm, (A) thế quét vòng tuần hoàn, (B) phổ tồng trở điện hóa EIS, (C) ổn định của điện cực biến tính với 30 vòng quét CV trong dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl ................................................................. 89 Hình 4.5: Đặc trưng điện hóa của điện cực biến tính SPE/AuNFs phụ thuộc chiều dày của lớp màng mỏng nano vàng,(A) quét thế vòng tuần hoàn,(B) phổ tồng trở điện hóa EIS trong dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl ....................................................................................................................... 91 Hình 4.6: Đặc trưng điện hóa của điện cực biến tính SPE/AuFPs cố định phần tử sinh học SPE/AuNFs (a), SPE/AuNFs/NHS (b), SPE/AuNFs/NHS/Ab (c), SPE/AuNFs/NHS/Ab/BSA (d) trong dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl, tốc độ quét 50 mV/s ............................... 93 Hình 4.7: Phổ hấp thụ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier trong vùng sóng 800- 3800cm-1 của (a) điện cực biến tính SPE/AuNPs và (b) sau khi cố định kháng thể SPE/AgNFs@MTS@GMBS@Ab. .......................................................................... 95 Hình 4.8: Đường cong CV của cảm biến sinh học dò tìm vi khuẩn MRSA trong dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl, tốc độ quét 50 mV/s..................................................................................................................... 96 Hình 4.9: (A) Cảm biến sinh học có điện cực biến tính SPE/AuNFs phát hiện vi khuẩn MRSA ở các nồng độ 101CFU/mL (a), 102CFU/mL (b), 103CFU/mL (c), 104CFU/mL (d), 105CFU/mL (e), 106CFU/mL (f) bằng phương pháp EIS trong dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl; (B) Sự thay đổi giá trị Rct của cảm biến sinh học sử dụng điện cực SPE/AuNFs phụ thuộc nồng độ vi khuẩn MRSA. .................................................................................................. 96 Hình 5.1: Sơ đồ khối của hệ đo điện hóa................................................................ 101 Hình 5.2: Sơ đồ nguyên lý của khối nguồn (A), khối tinh chỉnh Since (B) khối nạp (C) ........................................................................................................................... 102 Hình 5.3: Sơ đồ nguyên lý của khối cấp tín hiệu vào cho cảm biến sinh học ........ 103 Hình 5.4: Sơ đồ nguyên lý của khối giao tiếp USB (A) RS232 (D) tách sóng biên độ since (B) và hiển thị chuẩn HITACHI LCD (C) .................................................... 105 Hình 5.5: Nguyên lý của bộ xử lý trung tâm STM32F103C8T6 ........................... 106 Hình 5.6: Thiết kế vỏ tĩnh điện cho hệ đo điện hóa ............................................... 106 vii
Hình 5.7: Bảng mạch chỉnh của hệ đo (A) là khối xử ký trung tâm và giao tiếp, hiển thị, (B) là khối nguồn nuôi, phát tín hiệu vào cảm biến, (C) hình chụp chiếu đứng của bảng mạch chính. ............................................................................................. 107 Hình 5.8: Tín hiệu được đo thực nghiệm từ bảng mạch chủ trên máy Osilloscope(A), thiết kế đóng vỏ (B), thử nghiệm tín hiệu khuếch đại (C) ........... 108 Hình 5.9: Giao diện phần mềm iPortable trên máy tính ......................................... 109 Hình 5.10: Mô hình sử dụng thiết bị (A) và cảm biến điện hóa đo thử nghiệm lưu động tại CDC tỉnh Bắc Ninh (B) ............................................................................ 110 Hình 5. 11: So sánh khả năng khảo sát vi khuẩn của trạm đo điện hóa Palsen 3.0 sử dụng cảm biến SPE/AgNPs-GO (A), SPE/AuNPs (B), SPE/AuNFs (C) với thiết bị chế tạo(D)sử dụng điện cực SPE/AuNFs ............................................................... 111 viii
MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển nhanh chóng về kinh tế - xã hội, con người cũng phải đối mặt với nhiều mầm bệnh nguy hiểm ở các mức độ khác nhau như ung thư, bệnh truyền nhiễm, ngộ độc thực phẩm và nhiễm trùng bệnh viện. Việc khống chế và ngăn chặn kịp thời các dịch bệnh luôn được quan tâm của mọi quốc gia và trên thế giới. Với sự phát triển của khoa học và công nghệ nói chung, việc nghiên cứu ứng dụng các công nghệ mới, phương pháp phát hiện mới nhằm có thể nhanh chóng kiểm soát được dịch bệnh, sự khởi phát của bệnh cần phải có sự hỗ trợ nghiên cứu đa ngành kết hợp của công nghệ nano, vật lý, hóa học, sinh học, điện tử…Trong những năm gầy đây, việc nghiên cứu và phát triển ứng dụng cảm biến sinh học điện hóa trong kiểm soát và chăm sóc sức khỏe nói chung, trong y tế dự phòng nói riêng đang được quan tâm. Cảm biến sinh học cho phép phát hiện nhanh, nhạy, chính xác các tác nhân gây bệnh và đặc biệt là dễ sử dụng trong các trường hợp phải chẩn đoán để kiểm soát dịch bệnh trong phạm vi quy mô lớn [1]. Cảm biến sinh học dựa trên cơ sở bộ chuyển đổi theo nguyên lý điện hóa có khả năng ứng dụng lớn trong phân tích các đối tượng y sinh vì thiết bị này có khả năng phân tích nhanh, nhỏ gọn, có độ chọn lọc và nhạy cao thông qua việc ứng dụng các vật liệu nano mới để biến tính bề mặt chuyển đổi tín hiệu của cảm biến. Cảm biến sinh học điện hóa có quá trình hoạt động dựa trên sự thay đổi về đặc tính điện diễn ra sau khi có phản ứng sinh hóa giữa phần tử dò và phần tử đích trên bề mặt cảm biến, sự thay đổi rất nhỏ này có thể được ghi lại, biểu diễn bằng phương pháp phân tích điện hóa. Trong đó, phương pháp phân tích điện hóa sử dụng hệ thiết bị đơn giản, gọn nhẹ, chi phí thấp và có quá trình vận hành dễ dàng, do đó có thể tiết kiệm chi phí phân tích và đơn giản hóa các bước phân tích. Nhiều kĩ thuật điện hóa đã được phát triển để sử dụng để phân tích diễn biến quá trình hoạt động của bề mặt điện cực cảm biến điện hóa. Trong cảm biến sinh học điện hóa, các tín hiệu điện được phân tích từ đầu ra của cảm biến tỉ lệ với khả năng bắt cặp kháng nguyên, kháng thể trên bề mặt điện cực, những kỹ thuật đo cảm biến điện hóa này cho nhiều ưu điểm như: chi phí thấp, thao tác đơn giản, thời gian cho kết quả nhanh mà vẫn có độ nhạy và độ chính xác cao, tránh việc mất mát mẫu đo trong quá trình đo đạc. Hơn nữa, do hệ thiết bị gọn nhẹ, và việc xử lý mẫu đơn giản nên phương pháp này được phát triển thành các thiết bị đo cầm tay để phân tích mẫu trực tiếp ngoài hiện trường và khảo sát thực địa. Tuy nhiên, một trong những điểm cần quan tâm đối với cảm biến sinh học điện hóa là sự ổn định bề mặt điện cực trong quá trình đo lường và khả năng bắt cặp giữa phần tử dò và phần tử đích trên bề mặt điện cực [3],[6]. Đối với điện cực in lưới (SPE) cacbon, mặc dù đã được phát triển từ những năm 1990, nhưng hiện nay điện cực này vẫn là một trong những linh kiện được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật phân tích điện hóa và kỹ thuật y sinh nhằm phát hiện nhanh độc tố hay kim loại nặng gây ô nhiễm môi trường, trong nông nghiệp và thực phẩm [5],[6]. Điện cực này có những tính năng vượt trội như giá thành thí nghiệm và chi phí chế tạo thấp hơn nhiều so với các kim loại quý, khả năng tương thích tốt với các phần tử sinh học hay hóa học, có độ nhạy và thời gian đáp ứng nhanh, có thể biến tính dễ dàng với các vật liệu kim loại quý nhằm nâng cao khả năng khuếch đại tín hiệu của bộ phận chuyển đổi [7]. Mặc dù có nhiều ưu điểm tuy nhiên trong quá 1
trình ứng dụng chế tạo cảm biến sinh học nhưng điện cực cacbon rất ít khi được sử dụng trực tiếp. Cảm biến sinh học sử dụng trực tiếp điện cực SPE cacbon khó cảm nhận được sự thay đổi nhỏ xảy ra trên bề mặt điện cực khi có sự hiện diện của đối tượng phát hiện, thời gian phát hiện đáp ứng được quá trình phân tích [8],[2]. Những nghiên cứu ứng dụng các hệ vật liệu có cấu trúc nano với kích thước nhỏ hơn 100 nm gần đây đã được sử dụng để biến tính bề mặt SPE để tăng độ nhạy và khả năng truyền tải điện tích từ dung dịch điện ly đến điện cực. Hệ vật liệu nano có thể được tổng hợp từ hạt nano vàng, hạt nano lai bạc-graphene oxít hay ống nano cacbon. Nhờ những thuộc tính vật lý và hóa học điển hình của hạt nano vàng, hạt nano lai bạc - graphene oxít, ống nano cacbon có thể giúp các cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở SPE cacbon để tăng cường sự ổn định, có độ nhạy và độ chọn lọc cao, thời gian phát hiện các tác nhân gây bệnh nhanh hơn [9]. Cảm biến sinh học đang được nghiên cứu, áp dụng để phát hiện nhiều tác nhân gây bệnh khác nhau, trong đó có các tác nhân vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện và gây ngộ độc thực phẩm. Nhiễm trùng bệnh viện đang là vấn đề được cả thế giới quan tâm do ngày càng xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn kháng kháng sinh, thậm chí kháng đa thuốc. Nhiễm trùng bệnh viện là nhiễm trùng mắc phải trong thời gian nằm viện, xuất hiện ít nhất 48 giờ sau khi bệnh nhân vào viện và không có biểu hiện ở giai đoạn ủ bệnh khi nhập viện. Nhiễm trùng bệnh viện có thể xuất hiện sau 1 tháng đối với nhiễm khuẩn vết mổ sau là 72 giờ sinh đối với bệnh nhân nhi sơ sinh, đối với phẫu thuật cấy ghép có thể nhiễm khuẩn sau 1 năm [10]. Nhiễm trùng bệnh viện là một trong những thách thức to lớn và mối quan tâm hàng đầu trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Hàng năm, Hoa Kỳ có 1,7 triệu người nhiễm trùng bệnh viện và có tới 99 nghìn người tử vong. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), năm 2012 trên toàn cầu có thêm 450 nghìn người mới nhiễm lao kháng đa thuốc [11]. Nhiễm trùng bệnh viện không chỉ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe người dân mà còn gây thiệt hại nặng nề về kinh tế xã hội. Nhiễm trùng bệnh viện làm tăng thời gian nằm viện, tăng chi phí cho một người bệnh nằm điều trị bị nhiễm trùng bệnh viện. Việc đầu tư cho chẩn đoán, khẳng định sớm tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện còn nhiều hạn chế, trong khi các bệnh viện lớn ở tuyến trung ương luôn xảy ra tình trạng quá tải. Việc chẩn đoán bệnh và phát hiện tác nhân vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện chủ yếu vẫn dựa theo phương pháp truyền thống như phân lập, nuôi cấy, các phương pháp huyết thanh học hoặc sinh học phân tử [12]–[15]. Nhược điểm chính của các kỹ thuật chẩn đoán truyền thống là phải thực hiện nhiều bước và thời gian phân tích lâu cho kết quả sau vài giờ đến hàng ngày, các kỹ thuật trên yêu cầu mẫu bệnh phẩm phải được xử lý trước. Hơn nữa, những kỹ thuật này đòi hỏi trang thiết bị, hóa chất, sinh phẩm đắt tiền, cán bộ thực hiện được đào tạo chuyên nghiệp và được thực hiện trong phòng đạt tiêu chuẩn an toàn sinh học. Trong khi bệnh nhân bị nhiễm vi khuẩn nhiễm từ bệnh viện thường gặp phải là các chủng kháng kháng sinh hoặc kháng đa thuốc, do vậy cần điều trị đúng liệu pháp và kịp thời. Thông thường, với các phương pháp chẩn đoán truyền thống, thời gian nhận được kết quả chính xác chủng vi khuẩn nào gây bệnh nào phải mất 8 đến 48 giờ, giới hạn phát hiện tới 105- 106 CFU/mL nếu không được làm giàu sơ bộ [16]. Trong khi đó, một số kỹ thuật chẩn đoán sinh học phân tử có độ nhạy cao, có thể cho kết quả sau vài giờ, tuy nhiên chi phí thường đắt và đòi hỏi người làm xét nghiệm cần phải vững vàng về chuyên môn. Gần đây, với 2
sự phát triển nhanh chóng của khoa học và công nghệ, đặc biệt là công nghệ nano và công nghệ cảm biến, đã thu hút được sự quan tâm rất lớn từ các nhà khoa học trên thế giới nhằm tạo ra những thiết bị chẩn đoán mầm bệnh nhanh chóng, tiện dụng, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao [1], [17]. Từ những yêu cầu thực tiễn trên đây cùng với việc tìm hiểu tài liệu thông qua các công trình công bố liên quan ở trong và ngoài nước, chúng tôi đã triển khai hướng nghiên cứu chế tạo bộ cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở điện cực in lưới cacbon thương mại. Bề mặt của vùng điện cực làm việc được biến tính với một số vật liệu cấu trúc nano như bạc-oxide graphene khử (AgNPs-rGO), hạt nano vàng (AuNPs), màng nano vàng (AuNFs) nhằm tăng cường sự ổn định, giảm điện trở bề mặt, khuếch đại tín hiệu ra và tăng mật độ bám dính của phần tử sinh học trong phần tử cảm nhận để phát hiện nhanh một số tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện. Theo sự hiểu biết của nghiên cứu sinh cho tới nay vấn đề này vẫn chưa có nhiều công bố ở Việt Nam và quốc tế. Từ thực trạng tại Việt Nam và xuất phát từ thực tiễn, luận án nghiên cứu với tiêu đề: “Nghiên cứu chế tạo bộ cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở các vật liệu nano vàng, bạc - oxide graphene khử để phát hiện một số vi khuẩn gây bệnh” được đề xuất cho luận án tiến sĩ này. Đề tài được có 02 mục tiêu chính: (1) Tăng cường sự ổn định điện hóa của điện cực in lưới cacbon bằng một số hệ vật liệu như bạc-oxide graphene khử, hạt nano vàng và màng nano vàng để hình thành bộ cảm biến sinh học; (2) Phát triển thành công bộ cảm biến điện hóa trên cơ sở điện cực in lưới cacbon biến tính với các hệ vật liệu trên và hệ đo điện hóa cầm tay để phát hiện nhanh một số chủng vi khuẩn gây bệnh. Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu: Cách tiếp cận của luận án trong quá trình nghiên cứu dựa trên thực nghiệm kết hợp với lý thuyết biện chứng và các tài liệu tham khảo để bổ sung, so sánh, đánh giá từ đó tìm ra những quy trình, giải pháp tối ưu nhất thực hiện mục tiêu đề tài. Nội dung nghiên cứu của luận án: Nội dung nghiên cứu của luận án gồm 4 phần tương ứng với 4 chương thực nghiệm: (1) Chế tạo cảm biến điện hóa trên cơ sở điện cực in lưới cacbon biến tính với bạc-oxide graphene khử; (2) Chế tạo cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở điện cực in lưới cacbon biến tính hạt nano vàng; (3) Chế tạo cảm biến điện hóa trên cơ sở điện cực in lưới cacbon biến tính màng vàng; (4) Nghiên cứu, chế tạo thiết bị cầm tay cho cảm biến điện hóa. Đề tài được thực hiện tại Viện Tiên tiến Khoa học và Công nghệ, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội và Trung tâm nghiên cứu y sinh, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Kết quả của luận án sẽ mở ra một hướng nghiên cứu mới nhằm phát triển các bộ thiết bị chẩn đoán trên cơ sở cảm biến sinh học điện hóa có độ ổn định, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, kích thước nhỏ và tiện dụng để phát hiện nhanh và sàng lọc mầm bệnh tại chỗ trong các chiến dịch phòng, chống nhiễm trùng bệnh viện. 3
Ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực tiễn của luận án: Ý nghĩa khoa học:  Đã xây dựng được quy trình khoa học thực hiện chế tạo vật liệu nano lai AgNPs-rGO bằng phương pháp thủy nhiệt và chế tạo hạt nano vàng AuNPs bằng phương pháp điện hóa để biến tính cho các điện cực SPE. Các điều kiện phún xạ màng mỏng vàng lên điện cực làm việc (WE) của SPE;  Tìm ra phương pháp và các điều kiện ổn định đặc trưng điện hóa điện cực cacbon SPE biến tính làm cơ sở cho quá trình chế tạo cảm biến sinh học điện hóa;  Xây dựng, xác lập được các điều kiện tối ưu trong quá trình chế tạo cảm biến sinh học bằng việc biến tính AgNPs-rGO để phát hiện vi khuẩn Salmonella; biến tính AuNPs và AuNFs để phát hiện vi khuẩn E.coli O157 và vi khuẩn MRSA;  Tính toán và đánh giá vai trò của vật liệu nano biến tính trên cơ sở các giá trị diện tích hoạt động điện hóa tương ứng. Vật liệu màng vàng cho giá trị tối ưu về tính chất điện hóa được ứng dụng chế tạo cảm biến điện hóa ứng dụng phát hiện vi khuẩn MRSA gây nhiễm trùng bệnh viện;  Nghiên cứu, chế tạo thành công thiết bị đo điện hóa cầm tay cho cảm biến sinh học điện hóa để phát hiện vi khuẩn tại thực địa. Ý nghĩa thực tiễn: Chủ động chế tạo các vật liệu nano lai AgNPs-rGO và hạt AuNPs, màng vàng (AuNFs) để biến tính điện cực SPE nhằm chế tạo thành công cảm biến sinh học điện hóa phát hiện nhanh vi khuẩn Salmonella, vi khuẩn E.coli O157 và vi khuẩn MRSA ứng dụng sàng lọc tác nhân gây bệnh. Kết quả của luận án là các cảm biến sinh học điện hóa được chế tạo dựa trên điện cực cacbon in lưới biến tính các vật liệu nano lai bạc và graphene oxít và hạt nano vàng (hạt và màng vàng) nhằm tăng cường khả năng khuếch đại tín hiệu bộ chuyển đổi, sự bám dính thích ứng sinh học của phần tử cảm nhận nhằm tạo ra cảm biến có độ nhạy, độ chọn lọc cao, giới hạn phát hiện thấp kết hợp với thiết bị cầm tay nhằm phát hiện vi khuẩn gây bệnh ngay tại thực địa. Sản phẩm của Luận án không chỉ dừng lại ở các bài báo khoa học và còn có sản phẩm đăng ký sở hữu trí tuệ. Những đóng góp mới của luận án:  Sự ổn định điện hóa của điện cực in lưới cacbon khi biến tính vật liệu nano lai giữa hạt nano bạc -oxide graphene khử (AgNPs-rGO) ứng dụng chế tạo cảm biến phát hiện vi khuẩn Samonella. Cảm biến phát hiện vi khuẩn Salmonella thời gian 25 phút, dải đo 10 CFU/mL đến 106 CFU/mL tuân theo hàm Ipeak = 0,02x - 0,01, có R2 = 0,9559 và giới hạn phát hiện LOD = 22 CFU/mL.  Khảo sát sự ổn định điện hóa trong quá trình sử dụng SPE cacbon biến tính hạt nano vàng (AuNPs) ở các kích thước hạt khác nhau 10 nm, 15 nm, 25 nm trong việc phát hiện một số tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện phổ biến hiện nay là vi khuẩn MRSA và E.coli O157. Kết quả là giới hạn phát hiện: 13 4
CFU/mL (MRSA, AuNPs 15 nm) và 15 CFU/mL (AuNPs 18 nm), dải đo từ 10 CFU/mL đến 106 CFU/mL, thời gian phát hiện 25 phút. Kết quả này tốt hơn so với 40 công trình công bố gần đây;  Chế tạo thành công ban đầu cảm biến điện hóa trên cơ sở màng vàng có độ bền, độ chọn lọc, độ nhạy cao để phát hiện vi khuẩn MRSA gây bệnh. Kết quả cho thấy thời gian phát hiện 25 phút, với dải đo từ 10 CFU/mL đến 106 CFU/mL tuân theo hàm Rct = 1,102 x - 0,677, R2 = 0,9879, giới hạn phát hiện: 9 CFU/mL.  Luận án đã công bố được các giá trị diện tích hoạt động điện hóa (SPE biến tính - Ahđ) so sánh với diện tích hình học (SPE trần - Ahh) từ kết quả đo thực nghiệm khi sử dụng điện cực in lưới cacbon biến tính với vật liệu nano bạc/graphene oxide khử (AgNPs-rGO, tăng 1,53 lần), hạt nano vàng (AuNPs, tăng 1,76 lần), màng nano vàng (AuNFs, tăng 1,92 lần). Kết quả thu được tạo cơ sở cho việc lựa chọn vật liệu nano phù hợp để ứng dụng chế tạo cảm biến phát hiện một số tác nhân gây bệnh;  Chế tạo thiết bị cầm tay cho sử dụng cảm biến chế tạo được. Thiết bị cho phép chẩn đoán lưu động dựa trên kỹ thuật đo thế để phát hiện vi khuẩn tại thực địa ở dạng định tính, dễ sử dụng, thân thiện với môi trường, hiển thị ở 02 dạng chế độ Pos+: dương tính, Neg-: âm tính. Cấu trúc của luận án: Luận án được trình bày cấu trúc gồm: Mở đầu Chương 1. Tổng quan Chương 2. Chế tạo cảm biến điện hóa trên cơ sở điện cực in lưới cacbon biến tính với bạc/graphene oxít Chương 3. Chế tạo cảm biến điện hóa trên cơ sở điện cực in lưới cacbon biến tính hạt nano vàng Chương 4. Chế tạo cảm biến điện hóa trên cơ sở điện cực in lưới cacbon biến tính màng nano vàng Chương 5. Chế tạo thiết bị cầm tay cho cảm biến điện hóa Kết luận Các kết quả chính của luận án được công bố trong 9 công trình khoa học (tác giả chính), trong đó có 02 bài báo được đăng trên tạp chí chuyên ngành quốc tế (ISI), 04 báo cáo tại các hội nghị trong nước và quốc tế, 03 bài báo được đăng trên tạp chí chuyên ngành trong nước. Sản phẩm của luận án được nhóm nghiên cứu đăng ký sáng chế, giải pháp hữu ích với mã đơn đăng ký: 2-2020-00200 và được chấp nhận đơn theo quyết định số 1006w/QĐ-SHTT, ngày 21/7/2020. 5