Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 (CPV2) gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của một số chủng CPV2 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:151

Thêm vào BST

Báo xấu

20
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án "Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 (CPV2) gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của một số chủng CPV2 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam" với mục tiêu xác định được các đặc điểm bệnh lý cơ bản của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của các chủng virus parvo phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam để định hướng công tác chẩn đoán, điều trị bệnh trên lâm sàng và chế tạo vắc xin phòng bệnh trong tương lai.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 (CPV2) gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của một số chủng CPV2 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VÕ VĂN HẢI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA CHÓ MẮC BỆNH VIÊM RUỘT TIÊU CHẢY DO VIRUS PARVO TYPE 2 (CPV2) GÂY RA VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA MỘT SỐ CHỦNG CPV2 LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2023
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VÕ VĂN HẢI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA CHÓ MẮC BỆNH VIÊM RUỘT TIÊU CHẢY DO VIRUS PARVO TYPE 2 (CPV2) GÂY RA VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA MỘT SỐ CHỦNG CPV2 LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM Ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9 64 01 02 Người hướng dẫn: PGS.TS. Bùi Trần Anh Đào PGS.TS. Lê Văn Phan HÀ NỘI - 2023
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Tác giả luận án Võ Văn Hải i
LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc PGS.TS. Bùi Trần Anh Đào, PGS.TS. Lê Văn Phan đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học VNUA đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Hệ thống thú y 2Vet đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án./. Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Tác giả luận án Võ Văn Hải ii
MỤC LỤC Trang Lời cam đoan ..................................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii Mục lục ........................................................................................................................... iii Danh mục chữ viết tắt ...................................................................................................... vi Danh mục bảng .............................................................................................................. viii Danh mục hình ................................................................................................................. ix Trích yếu luận án ............................................................................................................. xi Thesis abstract................................................................................................................ xiii Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu ................................................................... 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................... 2 1.2.1. Mục tiêu tổng quát .............................................................................................. 2 1.2.2. Mục tiêu cụ thể ................................................................................................... 2 1.3. Phạm vi nghiên cứu ........................................................................................... 3 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................... 3 1.3.2. Thời gian nghiên cứu .......................................................................................... 3 1.3.3. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................................... 3 1.4. Các đóng góp mới của đề tài .............................................................................. 3 1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................................ 3 1.5.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................................ 3 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................ 3 Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 4 2.1. Đặc điểm sinh học của vi rút parvo ................................................................... 4 2.1.1. Cấu tạo chung ..................................................................................................... 4 2.1.2. Vị trí xếp loại ...................................................................................................... 5 2.1.3. Nguồn gốc của các chủng CPV2 ........................................................................ 5 2.2. Bệnh viêm ruột tiêu chảy do vi rút parvo trên chó ............................................ 7 2.2.1. Dịch tễ học .......................................................................................................... 7 iii
2.2.2. Bệnh học ............................................................................................................. 9 2.2.3. Triệu chứng lâm sàng ....................................................................................... 10 2.2.4. Bệnh tích ........................................................................................................... 11 2.2.5. Chẩn đoán ......................................................................................................... 16 2.2.6. Điều trị .............................................................................................................. 18 2.2.7. Phòng bệnh ....................................................................................................... 21 2.3. Các nghiên cứu trong nước và trên thế giới ..................................................... 23 2.3.1. Các nghiên cứu trong nước ............................................................................... 23 2.3.2. Các nghiên cứu trên thế giới ............................................................................. 27 Phần 3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu.......................................................... 36 3.1. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 36 3.1.1. Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 ................................................................................................................ 36 3.1.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của những chủng vi rút parvo phân lập được.................................................................................................... 36 3.2. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ..................................................................... 36 3.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 38 3.3.1. Phương pháp thu thập số liệu trực tiếp tại phòng khám ................................... 38 3.3.2. Phương pháp xác định chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 ............... 38 3.3.3. Phương pháp làm các xét nghiệm huyết học và sinh hóa máu chó bị bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 ........................................................................... 40 3.3.4. Phương pháp mổ khám quan sát biến đổi bệnh lý đại thể ................................ 41 3.3.5. Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý vi thể ......................................................... 42 3.3.6. Phương pháp nhuộm hoá mô miễn dịch ........................................................... 45 3.3.7. Phương pháp PCR ............................................................................................ 48 2.3.8. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR .................................................. 50 2.3.9. Phương pháp giải trình tự gen và xây dựng cây phả hệ.................................... 50 3.4. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................ 51 Phần 4. Kết quả và thảo luận ...................................................................................... 52 4.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của CPV2 trên chó ................................. 52 4.1.1. Tỷ lệ mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 ở chó theo từng địa phương ............. 52 iv
4.1.2. Tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 theo lứa tuổi............................... 53 4.1.3. Tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 theo giống .................................. 55 4.1.4. Tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 theo giới tính ............................. 55 4.1.5. Tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 theo tình trạng tiêm chủng ........................................................................................................ 56 4.2. Kết quả nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu ở chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 ........................................................................... 58 4.3. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 ........................................................................... 62 4.3.1. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 ............................................................................................ 62 4.3.2. Kết quả nghiên cứu bệnh tích đại thể và vi thể của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 .................................................................................... 64 4.4. Kết quả xác định sự phân bố của vi rút parvo ở một số cơ quan của chó mắc bệnh ........................................................................................................... 73 4.5. Kết quả phân tích một số đặc tính sinh học phân tử của CPV2 gây bệnh ở chó tại một số tỉnh Miền Bắc Việt Nam ........................................................... 78 4.5.1. Kết quả phân tích trình tự nucleotide và acid amin của gen VP2..................... 78 4.5.2. Kết quả phân tích trình tự nucleotide và acid amin của bộ gen CPV2 ............. 95 Phần 5. Kết luận và kiến nghị.................................................................................... 108 5.1. Kết luận........................................................................................................... 108 5.1.1. Đặc điểm bệnh lý của chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 ....................... 108 5.1.2. Kết quả phân tích đặc điểm sinh học phân tử của CPV2................................ 108 5.2. Kiến nghị ........................................................................................................ 109 Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận án .................................. 111 Tài liệu tham khảo ...................................................................................................... 112 Phụ lục ............................................................................................................... ......... 128 v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt & Và aa Amino acid (A xít amin) Ala Alanine Arg Arginine Asn Asparagine Asp Aspartic acid CCoV Canine corona virus CDV Canine distemper virus CPV Canine parvo virus (vi rút parvo gây bệnh trên chó) CPV2 Canine parvo virus type 2 (vi rút parvo type 2 gây bệnh trên chó) CRoV Canine rota virus Cs Cộng sự Cys Cysteine DAB Diamino benzindin (cơ chất DAB) DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium (môi trường DMEM) DNA Deoxyribonucleic acid (Axit deoxyribonucleic) EDTA Ethylene Diamine Tetracetic Acid (A xít etylenediaminetetraacetic) ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (phương pháp miễn dịch gắn enzyme) FFP Fresh Frozen Plasma (Huyết thanh tươi đông lạnh) Gln Glutamine Glu Glutamic acid Gly Glycine HA Haemagglutination (Phản ứng ngưng kết hồng cầu) HE Haematoxylin - Eosin (Thuốc nhuộm tiêu bản bệnh lý) His Histidine IHC Immuno Histochemistry (Hóa mô miễn dịch tổ chức) Ile Isoleucine IV Tiêm tĩnh mạch Leu Leucine Lys Lysine Met Methionine vi
Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt NPO Nil per os (Phương pháp cho ăn không qua miệng) nt Nucleotide PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) Pro Proline Phe Phenylalanine RNA Ribonucleic acid (A xít ribonucleic) RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp có dùng enzym phiên mã ngược) s giây SC Tiêm dưới da Ser Serine Tyr Tyrosin Thr Threonine Trp Tryptophan Val Valine VRTC Viêm ruột tiêu chảy vii
DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 3.1. Thông tin mẫu bệnh phẩm được sử dụng trong nghiên cứu .............................. 37 3.2. Hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động ............................................................ 43 3.3. Hệ thống nhuộm lần 1 ....................................................................................... 45 3.4. Hệ thống nhuộm lần 2 ....................................................................................... 47 3.5. Thành phần của phản ứng PCR ......................................................................... 49 3.6. Thông tin các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ............................................. 49 4.1. Tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 theo địa phương.......................... 52 4.2. Tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 theo lứa tuổi................................ 54 4.3. Tỷ lệ chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 theo giống .......................... 55 4.4. Tỷ lệ chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 theo giới tính ...................... 56 4.5. Tỷ lệ chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 theo tình trạng tiêm vắc xin ............................................................................................................... 57 4.6. Chỉ tiêu sinh lý máu của chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 (n=36) ......... 59 4.7. Chỉ tiêu sinh hóa máu của chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 (n=36) ....... 61 4.8. Triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 ........... 62 4.9. Bệnh tích đại thể của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 .................. 66 4.10. Bệnh tích vi thể ở một số cơ quan của chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 ..... 69 4.11. Kết quả phát hiện tế bào dương tính với kháng nguyên là CPV2 ..................... 74 4.12. Thông tin mẫu bệnh phẩm được sử dụng trong nghiên cứu .............................. 79 4.13. Tỷ lệ (%) tương đồng về trình tự nucleotide (nt) của gen VP2 giữa 12 chủng vi rút parvo trong nghiên cứu này với nhau và với các chủng vi rút parvo tham chiếu khác ....................................................................................... 81 4.14. Tỷ lệ (%) tương đồng về trình tự amino acid (aa) của gen VP2 giữa 12 chủng vi rút parvo trong nghiên cứu này với nhau và với các chủng vi rút parvo tham chiếu khác ....................................................................................... 82 4.15. Tỷ lệ tương đồng về trình tự nucleotide (nt) (dưới đường chéo) và amino acid (aa) (trên đường chéo) của 8 chủng CPV2 trong nghiên cứu này với các chủng CPV2 tham chiếu khác ................................................................... 100 4.16. So sánh trình tự nt và aa của 8 chủng CPV2 trong nghiên cứu này với các chủng CPV2 tham chiếu khác ......................................................................... 101 viii
DANH MỤC HÌNH TT Tên hình Trang 2.1. Mô tả quá trình tiến hoá của CPV2 ở chó ........................................................... 7 2.2. Sự phân bố của các chủng CPV2 ở chó trên thế giới .......................................... 9 4.1. Chó bị viêm ruột tiêu chảy do CPV2 (hình trái) và kết quả chẩn đoán bằng kit test nhanh (hình phải) .......................................................................... 53 4.2. Tình trạng tiêm vắc xin trên chó mắc viêm ruột tiêu chảy do vi rút parvo gây ra ................................................................................................................. 58 4.3. Triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do vi rút parvo .................................................................................................................. 64 4.4. Điện di sản phẩm PCR xác định CPV2 trên gel agarose ................................... 65 4.5. Một số hình ảnh bệnh tích đại thể ở hệ thống hạch bạch huyết và đường tiêu hoá của chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 .......................................... 67 4.6. Một số hình ảnh bệnh tích đại thể ở các cơ quan khác của chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 ..................................................................................... 68 4.7. Tổn thương vi thể ruột của chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 .................. 70 4.8. Tổn thương vi thể của chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2.......................... 71 4.9. Hình ảnh kháng nguyên của vi rút CPV2 phát hiện ở các tế bào của chó mắc bệnh ............................................................................................................ 77 4.10. Kết quả chạy điện di trên gel agarose để kiểm tra sản phẩm............................. 80 4.11. So sánh trình tự nucleotide của gen VP2 giữa 12 chủng vi rút parvo trong nghiên cứu này với nhau và với các chủng vi rút parvo tham chiếu khác (1) ..... 86 4.12. So sánh trình tự nucleotide của gen VP2 giữa 12 chủng vi rút parvo trong nghiên cứu này với nhau và với các chủng vi rút parvo tham chiếu khác (2) ..... 89 4.13. So sánh trình tự acid amin của gen VP2 giữa 12 chủng vi rút parvo trong nghiên cứu này với nhau và với các chủng vi rút parvo tham chiếu khác......... 91 4.14. Cây phả hệ nguồn gốc phát sinh loài của vi rút parvo type 2 dựa trên đoạn gen VP2 của 12 chủng trong nghiên cứu này. Hình tròn đỏ: Các chủng sử dụng trong nghiên cứu thuộc nhóm Canine Parvovirus. Hình vuông xanh: Các chủng sử dụng trong nghiên cứu thuộc nhóm Feline Panleukopenia Vi rút ......................................................................................... 94 4.15. Kết quả chạy điện di trên gel agarose để kiểm tra sản phẩm PCR. ................... 95 ix
4.16. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gen NS của các chủng CPV2 ............................................................................................................... 105 4.17. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gen VP của các chủng CPV2 ............................................................................................................... 106 4.18. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide bộ gen của 8 chủng vi rút CPV2 .......................................................................................................... 107 x
TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Võ Văn Hải Tên Luận án: Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do vi rút parvo type 2 (CPV2) gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của một số chủng CPV2 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam. Ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9 64 01 02 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Xác định các đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do vi rút parvo type 2 gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của các chủng vi rút parvo phân lập được tại một số tỉnh Miền Bắc Việt Nam để định hướng công tác chẩn đoán, điều trị bệnh trên lâm sàng và chế tạo vắc xin phòng bệnh trong tương lai. * Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý (tỷ lệ mắc, triệu chứng, chỉ tiêu lâm sàng, thay đổi huyết học, tổn thương vi thể, tổn thương đại thể, xác định sự phân bố của vi rút parvo type 2 trong các cơ quan) của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do vi rút parvo (VRTC do CPV2). - Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử (giải trình tự, so sánh trình tự nucleotide, amino acid, xây dựng cây phả hệ của vùng gen VP2 và hệ gen) của các chủng vi rút parvo phân lập được với nhau và với các chủng tham chiếu. * Vật liệu nghiên cứu - Chó mắc VRTC do vi rút parvo mang đến khám và điều trị tại Phòng khám thú y 2Vet tại Hà Nội, Bắc Giang, Bắc Ninh, Vĩnh Phúc. - 12 chủng vi rút CPV2 phân lập được trong nghiên cứu này: VNUA/C17, VNUA/C31, VNUA/C32, VNUA/C35, VNUA/CPV152-Hanoi, VNUA/CPV153-VP, VNUA/CPV175-BG, VNUA/CPV376-BN, VNUA/CPV379-VP, VNUA/CPV380- Hanoi, VNUA/CPV384-BN và VNUA/CPV385-HNa.. * Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp xác định chó mắc bệnh: dựa vào dịch tễ, triệu chứng, chẩn đoán nhanh bằng kit Test, khẳng định bằng test PCR. Phân tích huyết học bằng máy xét nghiệm máu tự động. - Phương pháp mổ khám xác định bệnh tích đại thể: theo tiêu chuẩn TCVN 8402:2010 của bộ KH-CN. Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình nhuộm Haematoxilin - Eosin (HE) thường quy tại phòng thí nghiệm bộ môn Bệnh lý thú y. - Quan sát sự hiện diện của vi rút ở các cơ quan bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (IHC) với kháng thể đặc hiệu vi rút parvo gây bệnh ở chó. - Làm phản ứng PCR theo hướng dẫn của OIE năm 2017 với bộ kit tách chiết QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen). Giải trình tự gen theo phương pháp Sanger. Các trình tự gen được căn chỉnh và so sánh bằng phần mềm Genious Prime và BioEdit. Cây sinh học phân tử được phân tích bằng phần mềm MEGA X, sử dụng phương pháp Neighbor- Joining với giá trị Bootstrap là 1000. Các chủng CPV2 tham chiếu sử dụng trong nghiên cứu được thu thập từ GenBank. xi
Kết quả chính và kết luận Đặc điểm bệnh lý của chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 - Tỷ lệ chó mắc VRTC do CPV2 được chẩn đoán bằng kit test nhanh là 15,86%. Tuổi mắc bệnh chủ yếu là chó từ 2-6 tháng. Đa số chó mắc bệnh VRTC do CVP2 nằm ở nhóm chưa tiêm vắc xin. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu là mệt mỏi, nôn mửa, tiêu chảy. Kết quả phân tích huyết học cho thấy chó mắc bệnh bị thiếu máu nặng, giảm tiểu cầu, giảm các chỉ số điện giải, mất nước. Bệnh tích điển hình là xuất huyết, sung huyết đường tiêu hóa, hạch, lách... - Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch cho thấy CPV2 được phát hiện ở 9/9 cơ quan chó mắc bệnh. Trong đó, tất cả các mẫu ruột, hạch lympho và gan 100% cho kết quả dương tính với kháng nguyên CPV2. Kết quả phân tích đặc tính sinh học phân tử của CPV2 - Từ kết quả phân tích cây phả hệ dựa trên gen VP2 mã hóa cho protein VP2 của 12 chủng vi rút parvo trong nghiên cứu này cho thấy chủng 9/12 chủng là VNUA/C17, VNUA/CPV152-Hanoi, VNUA/CPV153-VP, VNUA/CPV175-BG, VNUA/CPV376- BN, VNUA/CPV379-VP, VNUA/CPV380-Hanoi, VNUA/CPV384-BN và VNUA/CPV385-HNa đều thuộc về nhánh vi rút parvo trên chó. 3/12 chủng còn lại là VNUA/ C31, VNUA/ C32 và VNUA/ C35 nằm trên nhánh phát sinh của các chủng vi rút parvo gây bệnh cho mèo và có mối quan hệ gần gũi với các chủng vi rút parvo phân lập được trên mèo ở Trung Quốc (mã số truy cập ngân hàng GenBank: DQ474235, DQ474237, KY094114). Phát hiện này là bằng chứng quan trọng cho thấy có sự truyền lây vi rút giảm bạch cầu từ mèo sang chó. - Kết quả phân tích trình tự nucleotide và amino acid hệ gen của các chủng CPV2. + Kết quả giải trình tự hệ gen 8/12 chủng CPV2 cho thấy trình tự hệ gen của các chủng CPV2 trong nghiên cứu này có chiều dài là 4269 nucleotide (nt), bao gồm hai khung đọc mở (ORF) mã hóa cho gen phi cấu trúc (NS: 2007 nt) và gen cấu trúc (VP: 2262 nt), trong đó đoạn gen VP2 có chiều dài 1755 nt. + Kết quả phân tích về trình tự nt của hệ gen trong nghiên cứu này cũng cho thấy có sự thay thế nt diễn ra trên cả trình tự gen mã hóa cho protein cấu trúc và protein phi cấu trúc của CPV2. + Kết quả xây dựng cây phả hệ dựa trên trình tự hệ gen của 8 chủng CPV2 cho thấy chúng đều thuộc cùng nhánh phát sinh genotype Asia-4, cùng nhánh phát sinh với các chủng phân lập (Mã GenBank: MT106228 – MT106237) tại Việt Nam trong giai đoạn 2017 – 2018 (Nguyen Manh & cs., 2020) và chủng CPV/IZSSI/2743/17 phân lập tại Ý năm 2017 (Mira & cs., 2018). Đây là nghiên cứu có hệ thống tại Việt Nam đồng thời nghiên cứu về các đặc điểm bệnh lý của chó mắc VRTC do CPV2 và giải trình tự hệ gen các chủng CPV2 đang lưu hành. Những thông tin di truyền về bộ gen của các chủng CPV2 đang lưu hành và gây bệnh trên đàn chó nuôi tại Việt Nam cũng như các đặc điểm bệnh lý của chó mắc VRTC do CPV2 thu được trong nghiên cứu này sẽ là cơ sở khoa học quan trọng giúp cho việc lựa chọn được chủng vi rút CPV2 thích hợp để nghiên cứu và sản xuất vắc xin cũng như nghiên cứu chế tạo ra kháng nguyên, kháng thể đặc hiệu dùng trong các Kit chẩn đoán. xii
THESIS ABSTRACT PhD candidate: Võ Văn Hải Thesis title: Pathological characteristics of canine parvovirus type 2 (CPV2) infection in dogs and molecular characteristics of CPV2 strains isolated in northern provinces of Vietnam. Major: Veterinary pathology and Therapeutics of the animal diseases Code: 9 64 01 02 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture Research Objectives Determining the pathological characteristics of canine parvovirus type2 (CPV2) infection in dogs and molecular characterization of CPV2 strains isolated in northern provinces of Vietnam help orient the diagnosis and treatment of diseases in clinical practice and manufacture future vaccines. * Research Content - Study of pathological characteristics (incidence rate, clinical symptoms, hematological changes, microscopic lesions, gross lesions, distribution of parvovirus in different organs) of dogs infected with CPV2. - Molecular characterization (sequencing, analysis of nucleotide and amino acid sequences, construction of phylogentic trees based on VP2 gen region and whole genome) of isolated parvovirus strains. * Materials and Methods - Dogs infected with CPV2 were brought for examination and treatment at 2Vet Veterinary Clinic in Hanoi, Bac Giang, Bac Ninh, and Vinh Phuc provinces. - 12 strains of CPV2 virus were isolated in this study: VNUA/C17, VNUA/C31, VNUA/C32, VNUA/C35, VNUA/CPV152-Hanoi, VNUA/CPV153-VP, VNUA/CPV175-BG, VNUA/CPV376-BN, VNUA/CPV379-VP, VNUA/CPV380- Hanoi, VNUA/CPV384-BN, and VNUA/CPV385-HNa. * Methods - Disease identification of CPV2- infected dogs was based on the epidemiology, symptoms, rapid test with a commercial kit, and confirmation by PCR test. An automated blood testing machine conducted hematology analysis. - Surgical method to determine gross lesions was conducted according to standard TCVN 8402:2010 of the Ministry of Science and Technology of Vietnam. Making microscopy slides and histopathology experiments were performed routinely by Hematoxylin - Eosin (HE) staining procedure set up in the laboratory of Veterinary Pathology. - Immunohistochemical (IHC) assays using parvovirus-specific antibodies were used to study the vi rút distribution in different organs of CPV2- infected dogs. - PCR reaction was performed according to OIE in 2017 with extraction QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) according to the manufacturer’s instructions. The Sanger method was used for gen sequencing. Gen sequences were aligned and compared using Genious Prime and BioEdit software. Phylogentic trees were analyzed using MEGA X xiii
software, applying the Neighbor-Joining method with a Bootstrap value of 1000. Reference CPV2 strains used in the study were collected from the GenBank database. Main findings and conclusions Pathological characteristics - The rate of dogs infected with CPV2 using a rapid test kit was 15.86%. The average age of the diseased dogs was between 2-6 months. Most of the dogs infected with CPV2 were not vaccinated. The most common symptoms were fatigue, vomiting, and diarrhea. The results of hematology analysis showed that sick dogs had severe anemia, thrombocytopenia, decreased electrolyte indicators, and dehydration. Typical lesions were hemorrhage, congestion of the gastrointestinal tract, lymph nodes, and spleen. - Immunohistochemical (IHC) assays showed that CPV2 was detected in all 9/9 different organs collected from sick dogs. All intestine, lymph nodes, and liver samples showed 100% positive results. Phylogentic tree construction - Phylogentic tree analysis based on the VP2 gen encoding the VP2 protein of 12 CVP2 strains in this study showed that 9/12 strains (VNUA/C17, VNUA/CPV152- Hanoi, VNUA/CPV153-VP, VNUA/CPV175-BG, VNUA/CPV376-BN, VNUA/CPV379-VP, VNUA/CPV380-Hanoi, VNUA/CPV384-BN, and VNUA/CPV385-Hna) belonged to the canine parvovirus cluster. The remaining strains (VNUA/C31, VNUA/ C32, and VNUA/ C35) were clustered into feline parvovirus lineage and closely related to feline parvovirus strains isolated in China (GenBank: DQ474235, DQ474237, KY094114). The present finding provides substantial evidence that there is a transmission of leukopenia vi rút from cats to dogs. - Nucleotide and amino acid sequence analysis of CPV2 strains + The results of genomic sequencing of 8/12 strains of CPV2 showed that the obtained genomic sequences of CPV2 samples were 4269 nucleotides (nt) in length, including two open reading frames (ORFs) encoding for NS (2007 nt) and VP (2262 nt) in which the VP2 gen fragment had a length of 1755 nt. + The analysis of the genomic sequences of CPV2 in this study also showed that there were nt substitutions in both structural and non-structural proteins of CPV2. + Phylogentic tree's result based on the whole genomic sequences of CPV2 strains showed that all studied CPV2 strains belonged to cluster Asia-4, the same as previously reported CPV2 strains (GenBank: MT106228 – MT106237) isolated in Vietnam in the period 2017 - 2018 (Nguyen Manh et al. 2020) and strain CPV/IZSSI/2743/17 isolated in Italy in 2017 (Mira et al. 2018). This is the systemic study to determine pathological characteristics of dogs infected with CPV2 in Vietnam and complete genomic sequencing analysis of circulating CPV2 strains. The genomic information of the circulating CPV2 strains, as well as the pathological characteristics of dogs infected with CPV2 in this study, will be an essential scientific basis to help selecting the appropriate CPV2 strain for research and production of vaccines as well as research and production of specific antigens and antibodies used in diagnostic kits. xiv
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU Trong những năm gần đây cùng với sự phát triển của xã hội và sự tăng trưởng về kinh tế, phong trào nuôi thú cưng ngày càng phát triển mạnh mẽ ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Chăn nuôi thú cưng đã và đang mang lại những giá trị tinh thần và vật chất lớn lao cho con người. Chó đã và đang được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau như: làm cảnh, giữ nhà, đi săn, phục vụ an ninh quốc phòng, phát hiện ma túy, thuốc nổ, trinh thám,... Ở các nước phát triển chó còn tham gia vào nhiều hoạt động quan trọng khác như giáo dục, phát triển nhân cách trẻ em, chăm sóc người neo đơn, cải tạo phạm nhân và là một động lực phát triển nền kinh tế… Đồng nghĩa với vai trò của chúng ngày càng quan trọng trong đời sống xã hội, nên công tác chăm sóc sức khỏe, phòng và chữa bệnh cho đàn chó cưng ngày càng phát triển và được chú trọng, từ các nhu cầu bình thường như ăn uống, chữa bệnh thông thường, đến các dịch vụ cao cấp khách sạn, huấn luyện, làm đẹp, khám chữa bệnh chất lượng cao và chuyên sâu… Sự phát triển về số lượng, chủng loại chó kèm theo sự thay đổi về điều kiện nuôi dưỡng, biến đổi khí hậu môi trường… càng làm gia tăng các loại dịch bệnh, trong đó bệnh viêm ruột tiêu chảy do vi rút parvo gây ra, ảnh hưởng về sức khỏe cho cho đàn chó, kinh tế và sức khỏe tinh thần của người nuôi. Canine parvovirus type 2 (CPV2) gây ra Bệnh viêm ruột tiêu chảy trên chó. Bệnh có tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết cao, thường gặp ở chó dưới 1 năm tuổi và chó chưa được phòng bệnh bằng vắc xin. Bệnh xuất hiện với một số triệu chứng điển hình như: ủ rũ, bỏ ăn, sốt cao, nôn mửa, mất nước nhanh chóng và tiêu chảy phân có lẫn máu (Appel & cs., 1979; Hayes & cs., 1979; Vickers, 2017). Sau khi xuất hiện vào cuối những năm 1970 (Appel & cs., 1979; Kelly, 1978), CPV2 đã có quá trình biến đổi di truyền nhanh chóng trong vòng vài năm, các biến chủng vi rút mới xuất hiện là CPV2a và CPV2b đã thay thế hoàn toàn chủng vi rút gốc ban đầu (Parrish, 1991; Parrish, 1985). Hiện nay, chủng CPV gốc ban đầu không còn lưu hành trong quần thể chó, trong khi CVP chủng 2a và 2b có sự phân bố khác nhau trên toàn thế giới (Mochizuki, 1993; Pereira, 2000; Truyen, 1996). Các biến thể CPV2 bài thải ra trong phân đã được chứng minh là có hiệu giá vi rút (HA) cao hơn so với chủng CPV2 ban đầu (Carmichael, 1994). Trong một vài năm gần đây, sự xuất hiện của các biến chủng vi rút mới đã được 1
quan sát thấy ở một số quốc gia (Battilani, 2001; Ikeda, 2000). Gần đây, một số biến chủng vi rút mới đã được báo cáo ở Ý (Buonavoglia, 2001). Biến chủng vi rút đó có một axit amin thay thế, Asp-426-Glu, xuất hiện trong phần lớp vỏ protein được coi là quan trọng đối với các đặc tính kháng nguyên của CPV2. Biến chủng này (Đột biến CPV2/ Glu-426) lần đầu tiên được ghi nhận ở Ý và hiện tại đang lây lan trong quần thể chó ở Ý cũng như các quốc gia khác trên thế giới (Decaro, 2005; Martella, 2004). Ở Việt Nam, theo Nakamura & cs. (2004), ca bệnh đầu tiên do CPV2 trên chó được phát hiện vào năm 1994. Cho đến nay, cả ba biến chủng CPV2a, CPV2b và CPV2c đã được phát hiện tại Việt Nam (Hoang & cs., 2019), trong đó biến chủng gây bệnh phổ biến nhất trong những năm gần đây là CPV2c (Hoang & cs., 2019). Mặc dù ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu khoa học phân tích về những biến đổi di truyền của các chủng CPV2 đã và đang gây bệnh trên đàn chó nuôi tại Việt Nam, nhưng những nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào giải mã và phân tích gen VP2 của CPV2 (Nakamura & cs., 2004; Hoang & cs., 2019; Doan & cs., 2021). Các nghiên cứu toàn diện về bệnh lý học và phân tích toàn bộ hệ gen của CPV2 chưa có nhiều. Do CPV2 thường xuyên có những biến đổi về di truyền để hình thành nên những biến chủng vi rút mới, vì vậy rất cần những nghiên cứu liên tục về giải mã và phân tích bộ gen của CPV2 để xác định được nguồn gốc tiến hóa và sự biến đổi di truyền của các chủng CPV2 đã và đang gây bệnh trên chó theo không gian và thời gian khác nhau. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.2.1. Mục tiêu tổng quát Xác định được các đặc điểm bệnh lý cơ bản của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do vi rút parvo gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của các chủng vi rút parvo phân lập được tại một số tỉnh Miền Bắc Việt Nam để định hướng công tác chẩn đoán, điều trị bệnh trên lâm sàng và chế tạo vắc xin phòng bệnh. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể - Xác định được tỷ lệ mắc bệnh, đặc điểm sinh lý sinh hóa máu, triệu chứng, bệnh tích đại thể, bệnh tích vi thể của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do vi rút parvo gây ra, mức độ gây hại đến các cơ quan bộ phận của vi rút parvo trong cơ thể chó mắc bệnh, nhằm đưa ra các khuyến cáo cho công tác phòng trị bệnh. - Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của vùng gen VP2 và trên toàn bộ bộ gen CPV2 phân lập được tại một số tỉnh Miền Bắc Việt Nam, từ đó cung cấp 2
thông tin cập nhật về các chủng vi rút parvo đang lưu hành, làm căn cứ định hướng chế tạo vắc xin phòng bệnh. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu Là các cá thể chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV- 2 và các mẫu vi rút parvo phân lập được từ chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy mang đến khám điều trị tại phòng khám thú y 2Vet và một số phòng khám thú y khu vực Miền Bắc Việt Nam (Hà Nội, Bắc Giang, Vĩnh Phúc, Bắc Ninh). 1.3.2. Thời gian nghiên cứu Từ tháng 01 năm 2017 đến tháng 12 năm 2021. 1.3.3. Địa điểm nghiên cứu - Bộ môn Bệnh lý - Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam - Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. - Hệ thống Thú y 2Vet và một số phòng khám khu vực Miền Bắc Việt Nam. 1.4. CÁC ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Nghiên cứu có tính hệ thống nghiên cứu đồng thời về bộ gen các chủng vi rút CPV2 đang lưu hành, gây bệnh trên đàn chó tại Việt Nam và lần đầu tiên sử dụng phương pháp hoá mô miễn dịch để xác định sự phân bố của CPV2 trong các tổ chức ở chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV- 2 gây ra tại Việt Nam. Các công bố của đề tài sẽ là những thông tin khách quan và mới nhất về căn bệnh này trên chó tại nước ta hiện nay. 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1. Ý nghĩa khoa học Bổ sung và hoàn thiện thêm hiểu biết về bệnh viêm ruột tiêu chảy do vi rút parvo gây ra trên chó tại Việt Nam. Luận án là tài liệu tham khảo chính thống và tương đối toàn diện về bệnh do CPV2 trên chó tại khu vực Miền Bắc Việt Nam. 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn Nâng cao hiệu quả trong việc chẩn đoán, chẩn đoán phân biệt, tiên lượng, điều trị bệnh viêm ruột tiêu chảy do vi rút parvo, đưa ra các khuyến cáo nhằm phòng ngừa và giảm thiểu thiệt hại do căn bệnh gây ra. 3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI RÚT PARVO Vi rút parvo là những vi rút DNA dạng chuỗi đơn, không có vỏ bọc, được biết có khả năng gây bệnh ở nhiều loài động vật có vú, mặc dù hầu hết vi rút parvo đặc trưng theo loài (Pollock, 1984). Vi rút parvo nhân lên cần tế bào vật chủ, đặc biệt là nhân tế bào và kết nối với tế bào chủ bằng các đầu sợi đôi của bộ gen. Sự nhân lên của vi rút chỉ xảy ra ở các tế bào phân chia nhanh như tế bào mầm ở biểu mô ruột non, tế bào tiền thân tủy xương và tế bào cơ tim. Sự nhân lên của vi rút gây chết tế bào và mất đi do suy giảm phân bào (Smith & cs., 1997). Không phải các quần thể tế bào phân chia nhanh đều bị ảnh hưởng như nhau, cho thấy vi rút có tính hướng đến cơ quan đích nhất định (Pollock, 1984). 2.1.1. Cấu tạo chung Vi rút parvo có đường kính nhỏ (~25 nm), không có vỏ bao phủ. Cấu trúc ba chiều của CPV2 đã được xác định nhờ sử dụng tia X (Tsao & cs., 1991; Xie & Chapman, 1996). Vi rút này có bộ gen DNA thẳng, sợi đơn âm, kích thước khoảng 5.2kb, chứa hai khung đọc mở (ORF1 và ORF2). Một trong số đó mã hóa hai protein không cấu trúc NS1 và NS2 và một khung khác mã hóa hai protein cấu trúc khác VP1 và VP2. Ở hai đầu của hệ gen, cấu trúc thứ cấp ở đầu xuôi và đầu ngược có 150 base thường được sử dụng cho việc nhân bản DNA (Reed & cs., 1988; Parrish, 1999). Ngoài ra còn một loại protein thứ 3, VP3 được tạo ra bằng quá trình phân giải protein VP2 (Mohan, 2010). Hầu hết bề mặt capsid được hình thành bởi sự tương tác giữa mô-típ b-barrel và các vòng linh hoạt tạo ra lõi trung tâm được bảo tồn cao của VPs (Tsao, 1991; Chapman, 1996; Xie & Chapman, 1996). Các đặc tính kháng nguyên của vi rút parvo ở chó bị ảnh hưởng bởi sự thay thế axit amin trong trình tự VP2 (Strassheim, 1994). Capsid chứa 60 tiểu đơn vị protein của VP1 (5-6 bản) và VP2 (54-55 bản), những protein khác có chung cấu trúc. Các vùng mã hóa cho VP1 (727 vị trí axit amin) và VP2 (584 vị trí axit amin) chồng lên nhau, trừ một vùng đầu N duy nhất có 143 vị trí axit amin ở VP1 (Tsao & cs., 1991). Hai protein cấu trúc được tạo ra bằng cách nối tiếp các mRNA của vi rút (Reed & cs., 1988; Parrish & Kawaoka, 2005). Protein VP2 có thể được cắt gần đầu N của nó bằng các proteaza của vật chủ để tạo ra một protein cấu trúc khác, VP3 chỉ xuất hiện trong các virion hoàn chỉnh (chứa DNA). 4