Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:153

Thêm vào BST

Báo xấu

37
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của luận án nhằm chọn ra chủng virus PRRS tiềm năng có đặc tính sinh học, sinh học phân tử điển hình để làm phong phú nguồn quỹ gene nhằm phục vụ các nghiên cứu chuyên sâu nhƣ: sản xuất vắc-xin phù hợp có hiệu quả bảo hộ cao;chế kháng thể đạt chuẩn dùng trong phòng, trị PRRS; công cƣờng độc để đánh giá hiệu quả của vắc-xin; gây bệnh thí nghiệm để nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm bệnh lý PRRS; sử dụng làm chủng tham chiếu để nghiên cứu các virus mới phân lập và các biến chủng dùng trong dịch tễ học phân tử.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LÊ THỊ TOAN NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC, SINH HỌC PHÂN TỬ CHỦ YẾU CỦA CHỦNG VIRUS PRRS HUA 01 VÀ PRRS HUA 02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LÊ THỊ TOAN NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC, SINH HỌC PHÂN TỬ CHỦ YẾU CỦA CHỦNG VIRUS PRRS HUA 01 VÀ PRRS HUA 02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 62.64.01.02 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Thị Lan 2. PGS.TS. Phạm Công Hoạt HÀ NỘI - 2017
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu riêng của bản thân. Các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án Lê Thị Toan i
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án tác giả đã nhận đƣợc sự giúp đỡ và tạo điều kiện của rất nhiều ngƣời, sau đây là lời cảm ơn chân thành của tác giả: Trƣớc hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Lan và PGS.TS. Phạm Công Hoạt ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án. Nhờ có sự hƣớng dẫn nhiệt tình và những ý kiến đóng góp quý báu của thầy, cô mà luận án của tôi đã đƣợc hoàn thành. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Bệnh lý học Thú y, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, cùng toàn thể các thầy, cô giáo và cán bộ của Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu luận án. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn tới bạn bè, đồng nghiệp, ngƣời thân trong gia đình và cơ quan đang công tác đã tạo điều kiện về thời gian, động viên, chia sẻ tinh thần, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tác giả luận án ii
MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình x Trích yếu luận án xiii Thesis abstract xv PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài 1 1.2. Mục tiêu của đề tài 4 1.2.1. Mục tiêu chung 4 1.2.2. Mục tiêu cụ thể 4 1.3. Phạm vi nghiên cứu 4 1.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu 4 1.3.2. Phạm vi nghiên cứu 4 1.4. Những đóng góp mới của đề tài 4 1.5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 5 1.5.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài 5 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 5 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7 2.1. Tình hình về PRRS trên thế giới và Việt Nam 7 2.1.1. Lịch sử và tình hình dịch PRRS trên thế giới 7 2.1.2. Lịch sử và tình hình dịch PRRS tại Việt Nam 10 2.2. Một số hiểu biết về virus PRRS 14 2.2.1. Cấu trúc virus PRRS 15 2.2.2. Phân loại virus PRRS 16 2.2.3. Sức đề kháng của virus PRRS 17 2.2.4. Một số nghiên cứu về đặc tính sinh học của virus PRRS 17 2.2.5. Một số nghiên cứu về đặc tính sinh học phân tử của virus PRRS 23 iii
2.3. Một số hiểu biết về hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS) 27 2.3.1. Truyền nhiễm học 27 2.3.2. Triệu chứng và bệnh tích 32 2.3.3. Chẩn đoán và phòng trị bệnh 35 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 3.1. Địa điểm nghiên cứu 40 3.2. Thời gian nghiên cứu 40 3.3. Vật liệu nghiên cứu 40 3.4. Nội dung nghiên cứu 41 3.4.1. Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam 41 3.4.2. Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam 42 3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu 42 3.5.1. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào 42 3.5.2. Phƣơng pháp gây nhiễm virus PRRS trên tế bào 43 3.5.3. Phƣơng pháp xác định TCID50 44 3.5.4. Phƣơng pháp xác định đƣờng biểu biễn sự nhân lên của virus 45 3.5.5. Phƣơng pháp RT – PCR 45 3.5.6. Phƣơng pháp giải trình tự gene 47 3.5.7. Phƣơng pháp Realtime RT-PCR 48 3.5.8. Phƣơng pháp gây bệnh thực nghiệm 49 3.5.9. Phƣơng pháp khám lâm sàng 51 3.5.10. Phƣơng pháp mổ khám 51 3.5.11. Phƣơng pháp làm tiêu bản bệnh lý 51 3.5.12. Phƣơng pháp hóa mô miễn dịch 52 3.5.13. Phƣơng pháp ELISA 52 3.5.14. Phƣơng pháp phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm 52 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54 4.1. Nghiên cứu đặc tính sinh học của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía bắc việt nam 54 iv
4.1.1. Kết quả nghiên cứu xác định hiệu giá (TCID50) của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 54 4.1.2. Kết quả nghiên cứu xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 55 4.1.3. Kết quả nghiên cứu xác định sự ổn định của các đời virus qua các đời cấy chuyển 59 4.1.4. Kết quả nghiên cứu xác định đƣờng biểu diễn sự nhân lên của 02 chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 61 4.1.5. Nghiên cứu khả năng gây bệnh của 02 chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam 64 4.2. Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía bắc việt nam 91 4.2.1. Kết quả phản ứng RT-PCR 91 4.2.2. Kết quả giải trình tự gene của các chủng virus PRRS nghiên cứu 92 4.2.3. Kết quả truy cập ngân hàng gene 93 4.2.4. So sánh mức độ tƣơng đồng về trình tự nucleotide giữa các chủng virus nghiên cứu 105 4.2.5. So sánh mức độ tƣơng đồng về trình tự amino acid giữa các chủng virus nghiên cứu 107 4.2.6. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử của các chủng virus nghiên cứu 109 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 114 5.1. Kết luận 114 5.2. Kiến nghị 116 Danh mục công trình đã công bố 117 Tài liệu tham khảo 118 Phụ lục 127 v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa Tiếng Việt BCĐNTT Bạch cầu đa nhân trung tính CPE Cytophathogenic Effect (Bệnh tích tế bào) DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Môi trƣờng nuôi cấy tế bào) DNA Deoxyribonucleic acid (gen sợi kép) EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid (Dung dịch đệm) ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Phản ứng miễn dịch gắn enzym) FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thanh thai bò) HE Haematoxylin – Eosin (Thuốc nhuộm tiêu bản bệnh lý) IHC Immuno Histochemistry (Hóa miễn dịch tổ chức) IPMA Immunoperoxidase monolayer Assay (Phản ứng miễn dịch có gắn men trên tế bào một lớp) KKT Kháng kháng thể MARC 145 Tế bào thận khỉ MLV Modifier Live Vacine (Vắc xin nhƣợc độc) MOI Multiplicity Of Infection (Tỷ lệ giữa số lƣợng virus và số lƣợng tế bào) NSP Non structural protein (Protein phi cấu trúc) OD Optical Density (Mật độ quang) ORF Open Reading Frame (Khung đọc mở trong hệ gen) PAM Porcine Alveolar Macrophage (đại thực bào phế nang lợn) PBS Photphat Buffer Saline (Dung dịch đệm) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn) PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (Virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn) RNA Ribonucleic acid (gen sợi đơn) vi
RT- PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp có dùng enzym phiên mã ngƣợc) S/P Sample/Positive (giá trị tính toán trong phản ứng ELISA) SP Structural protein (Protein cấu trúc) TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose (Liều gây nhiễm 50% mô nuôi cấy) TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine (Cơ chất bắt màu huỳnh quang) TPB Triptose phosphas broth (Dung dịch đệm) vii
DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 2.1. Protein cấu trúc của PRRSV 16 3.1. Thông tin về nguồn gốc 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 40 4.1. Kết quả xác định hiệu giá của 03 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 và chủng virus vắc-xin 54 4.2. Khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 55 4.3. Khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 qua các đời cấy chuyển 60 4.4. Hiệu giá 02 chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 qua các đời cấy chuyển 60 4.5. Kết quả kiểm tra hàm lƣợng kháng thể của lợn lô 1 trƣớc khi gây nhiễm thực nghiệm bằng phƣơng pháp ELISA 65 4.6. Kết quả kiểm tra hàm lƣợng kháng thể của lợn lô 2 trƣớc khi gây nhiễm thực nghiệm bằng phƣơng pháp ELISA 65 4.7. Kết quả xét nghiệm sự có mặt của virus PRRS và một số virus khác bằng phƣơng pháp RT – PCR 66 4.8. Kết quả xét nghiệm PRRSV bằng phƣơng pháp RT-PCR 67 4.9. Kết quả xét nghiệm hàm lƣợng PRRSV bằng phƣơng pháp Realtime RT-PCR 70 4.10. Bảng tổng hợp triệu chứng lâm sàng chủ yếu của các lợn đƣợc gây bệnh thực nghiệm 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 75 4.11. Bệnh tích đại thể của lợn thí nghiệm gây nhiễm 2 chủng PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 78 4.12. Bệnh tích đại thể của lợn thí nghiệm gây nhiễm 2 chủng PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 (tiếp) 79 4.13. Bệnh tích vi thể của lợn thí nghiệm gây nhiễm 2 chủng PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 83 4.14. Kết quả xác định virus PRRS ở lợn gây bệnh thực nghiệm bằng phƣơng pháp hóa mô miễn dịch 87 viii
4.15. Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gene ORF7 giữa các chủng virus nghiên cứu với chủng virus tham chiếu 95 4.16. Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gene ORF5 giữa các chủng virus nghiên cứu với chủng virus tham chiếu 98 4.17. Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene ORF7 giữa 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và chủng virus tham chiếu 102 4.18. Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene ORF5 giữa 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và chủng virus tham chiếu 103 4.19. Sự tƣơng đồng về trình tự nucleotide của gene ORF7 giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu với mẫu virus tham chiếu 105 4.20. Sự tƣơng đồng về trình tự nucleotide của gene ORF5 giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu với mẫu virus tham chiếu 106 4.21. Sự tƣơng đồng về amino acid mã hóa từ gene ORF7 giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng virus tham chiếu 107 4.22. Sự tƣơng đồng về amino acid mã hóa từ gene ORF5 giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng tham chiếu 108 ix
DANH MỤC HÌNH TT Tên hình Trang 2.1. Hình thái virus PRRS 15 2.2. Hình ảnh cấu trúc hệ gene của virus PRRS 16 2.3. Kết quả quy luật sinh trƣởng của virus PRRS trên môi trƣờng nuôi cấy Marc 145 22 2.4. Quy luật nhân lên của virus trên các môi trƣờng nuôi cấy dòng tế bào BHK-21, Marc 145, 3D4/31 22 2.5. Quan hệ về nguồn gốc di truyền của virus PRRS với các virus khác trong bộ Nidovirales và họ Picornaviridae 24 2.6. Virus PRRS xâm nhập và phá hủy tế bào đại thực bào 30 3.1. Gây nhiễm virus bằng cách nhỏ niêm mạc mũi 50 4.1. Tế bào Marc 145 không gây nhiễm virus 57 4.2. Bệnh tích tế bào sau 24 giờ gây nhiễm chủng PRRS HUA 01 57 4.3. Bệnh tích tế bào sau 36 giờ gây nhiễm chủng PRRS HUA 01 57 4.4. Bệnh tích tế bào sau 60 giờ gây nhiễm chủng PRRS HUA 01 57 4.5. Bệnh tích tế bào sau 72 giờ gây nhiễm chủng PRRS HUA 01 57 4.6. Bệnh tích tế bào sau 36 giờ gây nhiễm chủng PRRS HUA 02 57 4.7. Bệnh tích tế bào sau 48 giờ gây nhiễm chủng PRRS HUA 02 58 4.8. Bệnh tích tế bào sau 72 giờ gây nhiễm chủng PRRS HUA 02 58 4.9. Bệnh tích tế bào sau 84 giờ gây nhiễm chủng PRRS HUA 02 58 4.10. Hình biểu diễn sự nhân lên của chủng virus PRRS HUA 01 62 4.11. Hình biểu diễn sự nhân lên của chủng virus PRRS HUA 02 62 4.12. Thân nhiệt của lợn thí nghiệm trƣớc khi gây nhiễm 64 4.13. Kết quả phản ứng RT-PCR với mồi ORF5 sau 7 ngày gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 01 67 4.14. Kết quả phản ứng RT-PCR với mồi ORF5 sau 7 ngày gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 02 68 4.15. Thân nhiệt trung bình của lợn sau khi gây bệnh thực nghiệm bằng 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 (0C) 71 x
4.16. Hàm lƣợng kháng thể trung bình của lợn thí nghiệm đƣợc gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 73 4.17. Lợn mệt mỏi lƣời vận động 77 4.18. Lợn xuất huyết 77 4.19. Mí mắt sƣng, có nhiều rử mắt 77 4.20. Lợn thở nhƣ chó ngồi 77 4.21. Lợn chảy nhiềunƣớc mũi 77 4.22. Lợn chết 77 4.23. Phổi viêm, căng bóng 82 4.24. Phổi xuất huyết 82 4.25. Dạ dày xuất huyết 82 4.26. Hạch màng treo ruột sung huyết 82 4.27. Xoang bao tim tích nƣớc 82 4.28. Hạch bẹn nông xuất huyết 82 4.29. Phế quản có dịch viêm (HE.40X) 86 4.30. Phổi xuất huyết, vách phế nang bong tróc (HE.10X) 86 4.31. Xuất huyết kẽ thận, tế bào viêm tăng sinh (HE.10X) 86 4.32. Gan sung huyết (HE.10X) 86 4.33. Lách nhồi huyết (HE.10X) 86 4.34. Não sung huyết, hồng cầu tràn ngập lòng mạch quản (HE.40X) 86 4.35. Virus phân bố ở phổi (IHC.10X) 89 4.36. Virus phân bố ở phổi (IHC.20X) 89 4.37.. Virus phân bố ở hạch lympho (IHC.20X) 89 4.38. Virus phân bố ở hạch lympho (IHC.40X) 89 4.39. Kết quả phản ứng RT- PCR với mồi ORF7 (hình A) và ORF5 (hình B) 92 4.40. Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide của đoạn gene ORF7 nghiên cứu 93 4.41. Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide của đoạn gene ORF5 nghiên cứu 93 4.42. Kết quả so sánh trình tự gene ORF7 của các chủng virus PRRS nghiên cứu 94 4.43. Kết quả so sánh trình tự gene ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu 97 xi
4.44. So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene ORF7 của 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và các chủng tham chiếu 101 4.45. So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene ORF5 của 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và các chủng tham chiếu 101 4.46. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu 110 4.47. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene ORF7 của các chủng virus PRRS nghiên cứu 112 xii
TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Lê Thị Toan Tên Luận án: “Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam”. Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 62.64.01.02 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Mục đích của luận án nhằm chọn ra chủng virus PRRS tiềm năng có đặc tính sinh học, sinh học phân tử điển hình để làm phong phú nguồn quỹ gene nhằm phục vụ các nghiên cứu chuyên sâu nhƣ: sản xuất vắc-xin phù hợp có hiệu quả bảo hộ cao;chế kháng thể đạt chuẩn dùng trong phòng, trị PRRS; công cƣờng độc để đánh giá hiệu quả của vắc-xin; gây bệnh thí nghiệm để nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm bệnh lý PRRS; sử dụng làm chủng tham chiếu để nghiên cứu các virus mới phân lập và các biến chủng dùng trong dịch tễ học phân tử. Phƣơng pháp nghiên cứu: Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02. Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02. Máy PCR, thiết bị điện di, máy giải trình tự gene, máy đọc ELISA, máy chuyển đúc mẫu, máy cắt tổ chức, kính hiển vi quang học, kính hiển vi huỳnh quang. Môi trƣờng nuôi cấy tế bào, tế bào Marc 145, bộ kít tách chiết RNA, bộ kít RT-PCR, bộ kít giải trình tự gene, Hematoxylin-Eosin, kháng thể sơ cấp và kháng thể thứ cấp của PRRSV. Để kiểm tra các đặc tính sinh học của virus cần sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy tế bào, gây nhiễm virus lên môi trƣờng tế bào, xác định hiệu giá của virus, xác định đƣờng cong sinh trƣởng của virus trên môi trƣờng tế bào, nghiên cứu khả năng gây bệnh của virus bằng phƣơng pháp gây bệnh thực nghiệm, khám lâm sàng, mổ khám, kiểm tra bệnh tích đại thể và làm tiêu bản vi thể của lợn thí nghiệm. Kiểm tra hàm lƣợng kháng thể bằng phƣơng pháp ELISA. Nghiên cứu sự phân bố của virus bằng phƣơng pháp hóa mô miễn dịch. Phƣơng pháp RT- PCR để xác định sự có mặt của virus. Xác định hàm lƣợng virus bằng phƣơng pháp Realtime PCR. Giải trình tự gene để xác định đặc điểm sinh học phân tử của virus. Kết quả chính và kết luận: Kết quả nghiên cứu đặc tính sinh học của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02: Biến đổi bệnh tích tế bào bắt đầu quan sát thấy sau 24 giờ gây nhiễm chủng PRRS HUA 01, và sau 36 giờ chủng PRRS HUA 02. Bệnh tích tế bào đƣợc biểu hiện là các tế bào co cụm lại với nhau chồi lên ở đáy bình. Chủng virus PRRS HUA 01, xiii
CPE đạt 100% tại 60 giờ. Chủng virus PRRS HUA 02, CPE đạt 100% tại 72 giờ. Quy luật nhân lên của 2 chủng virus nghiên cứu trong môi trƣờng tế bào là giống nhau. Virus giải phóng ra ngoài tế bào có hiệu giá cao hơn virus ở trong tế bào. Hiệu giá virus tƣơng đối cao chủng PRRS HUA 01 (3,16x105 TCID50/25µl) và PRRS HUA 02 (1,74 x106 TCID50/25µl), thời điểm hiệu giá virus đạt cao nhất trong khoảng 60 giờ đến 84 giờ sau gây nhiễm. Kết quả khả năng gây bệnh của 02 chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02: Chủng PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 đƣợc gây nhiễm trên lợn thí nghiệm có triệu chứng và bệnh tích rất điển hình của lợn mắc PRRS. Triệu chứng lâm sàng: sốt, ho, khó thở, giảm ăn, phát ban, sƣng phù mí mắt. Sau gây nhiễm 03 ngày virus PRRS xuất hiện trong máu và sau 05 ngày xuất hiện ở dịch ngoáy mũi. Virus tồn tại trong máu đến hết thời gian theo dõi thí nghiệm (21 ngày). Bệnh tích đại thể chủ yếu của các lợn thí nghiệm: phổi viêm, xuất huyết, hạch lympho sƣng, xuất huyết, thận xuất huyết. Bệnh tích vi thể chủ yếu của lợn mắc PRRS ở thí nghiệm: Phổi xuất huyết, phế quản - phế viêm, tế bào viêm tràn lan trong phổi. Hạch lympho xuất huyết, thâm nhiễm tế bào viêm, các nang lympho, thận xuất huyết, viêm kẽ thận. Sự phân bố của virus đƣợc nghiên cứu qua phƣơng pháp nhuộm hóa mô miễn dịch cho thấy ở lợn gây nhiễm thực nghiệm, virus PRRS tập trung chủ yếu ở hạch lympho và phổi. Kết quả nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 2 chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02: Đoạn gene ORF5 có kích thƣớc 603 bp mã hóa cho 200 amino acid của Glycoprotein 5 (GP5). Đoạn gene ORF7 có kích thƣớc 372 bp mã hóa cho 123 amino acid của protein N. Mức độ tƣơng đồng nucleotide ở gene ORF7 và ORF5 giữa 2 chủng PRRS nghiên cứu đạt tỷ lệ lần lƣợt là 98,64% và 97,29%. Mức độ tƣơng đồng về nucleotide ở gene ORF7 và gene ORF5 giữa 2 chủng PRRS nghiên cứu với các chủng virus tham chiếu đạt tỷ lệ lần lƣợt là 93,13%-99,73% và 87,41%-99,67%. Mức độ tƣơng đồng về amino acid tƣơng ứng ở gene ORF7 và gene ORF5 giữa 02 chủng PRRS nghiên cứu đạt tỷ lệ lần lƣợt là 100,0% và 94,26%-100%. Mức độ tƣơng đồng về amino acid tƣơng ứng ở gene ORF7 và gene ORF5 giữa 2 chủng PRRS nghiên cứu với các chủng virus tham chiếu đạt tỷ lệ dao động lần lƣợt là 93,99%-100% và 84,24%-98,97%. Hai chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 có cùng nhánh với chủng độc lực cao của Trung Quốc và thuộc PRRS type 2 (Bắc Mỹ). Chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 có đặc tính sinh học và sinh học phân tử điển hình, ổn định, có khả năng gây bệnh cao nên có thể lựa chọn làm chủng tiềm năng phục vụ cho việc chọn chủng giống gốc để sản xuất vắc-xin PRRS, đánh giá hiệu lực của các loại vắc-xin, hoặc các chế phẩm sinh học nhƣ kít chẩn đoán nhanh, kháng nguyên dùng trong chẩn đoán,… nhằm phòng, trị PRRS. xiv
THESIS ABSTRACT PhD candidate: Le Thi Toan Thesis title: Study of biological and molecular biological characteristics of PRRSHUA 01 andPRRS HUA 02 virus strains isolated from some northern provinces in Vietnam. Major: Veterinary pathology and Therapeutics of the diseases of domestic animals Code: 62.64.01.02 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture Research Objectives: The purpose of this thesis is to find promising PRRS virus strains with typical biological and molecular biologicalcharacteristics to diversify gene bank and for further research such as: Production of effective vaccine and PRRS; assessment of vaccine effectiveness; experimental infection for further study on pathological characteristics of PRRS; to be used as reference in study on new isolated virus and modified strain in molecular epidemiology. Materials and Methods: Study on biological characteristics of 02 virus strains: PRRS HUA 01 and PRRS HUA 02. Research on the molecular biological characteristics of 02 virus strains: PRRS HUA 01 and PRRS HUA 02. PCR machine, electrophoresis equipment, sequencing machine, ELISA reader, automatic paraffin dispenser embedding, microtome, microscopes, fluorescence microscopes, Marc 145 cell culture environment, RNA extraction Kit, RT-PCR Kit, sequencing Kit, Hematoxylin – Eosin, PRRSV primary and secondary antibodies. In order to identify biological features of the virus, cell culture and virus title, viral replication curve in cell culture environment were performed. Viral virulence was determined through experimental infection, clinical test, necropsy, macro-lesions, and micro-lesions observation. ELISA was carried out to identify Antibody titer. Immunohistochemistry method was used to study the viral distribution. RT-PCR was implemented to identify the presence of virus. Realtime PCR showed the quantity of virus. Sequencing was conducted to identify molecular biological characteristics of virus. Main findings and conclusions: Result of study on biological characteristics of PRRS HUA 01 and PRRS HUA 02: cellular lesions began to be observed at 24 hours post-infection with PRRS HUA 01, and after 36 hours post-infection with PRRS HUA 02. Cellular lesions observed are the cells clumping together, creating clusters in the bottom of the jar. In PRRS HUA 01, CPE reached to 100% at 60 hours. CPE reached to 100% at 72 hours post-inoculation xv
with PRRS HUA 02. Two strains multiply in the same way in the cell culture. Virus released out of the cells has a higher titer than those inside the cells.The viral titer reached to the highest levelat 60 hours to 84 hours post-infection, PRRS HUA 01 (3,16x105 TCID50/25µl) và PRRS HUA 02 (1,74 x106 TCID50/25µl). PRRS HUA 01 and PRRS HUA 02 experimentally infected in pigs are virulent and able to cause respiratory and reproductive syndrome (PRRS) in pigs with typical symptoms and lesions of PRRS. Clinical symptoms in infected pigs were: fever, cough, anorexia, hives, swelling of the eyelids. The presence of PRRS virus in the blood appears on the 3rd day post-inoculation, and the virus found in swab in the 5th day post-inoculation. Virus presented in blood until the end the experiment (21st day). Main macroscopic lesions of PRRS infected pigs are: pneumonia, hemorrhage, pulmonary incarnate, lymphadenopathy: hemorrhage, infiltration, renal hemorrhage, interstitial nephritis. Study on viral distribution using IHC shows that in infected pigs, accumulation of virus in lymph nodes and lungs. Results of the study molecular biological characteristics of PRRS HUA 01 and PRRS HUA 02: ORF5 gene has fragment size of 603 bp encoding 200 amino acids of Glycoprotein 5 (GP5). ORF7 gene has fragment 372 bp in size 123 amino acids encoding the protein of N. The degrees of similarity of nucleotide in the gene ORF5 and ORF7 between 2 PRRS strains are at high rate 98.64% and 97.29%, respectively. The degrees of similarity nucleotide in the gene ORF7 and ORF5 between 2 PRRS strains and reference strain are of 93.13%-99.73% and 87.41%-99.67%, respectively. The degree of similarity of amino acid in the gene ORF7 and ORF5 between 2 PRRS strains are at high rate 100% and 94.26% -100.0%, respectively.The degree of similarity of amino acid in the gene ORF7 and ORF5 between 2 PRRS strains and reference strain are 93.99% - 99.20% and 84.24% - 98.97%, respectively. This suggests that the similarity between the results of comparing the degree of similarity between nucleotide sequences and amino acid sequences.PRRS HUA 01 and PRRS HUA 02 have the same branch with highly pathogenic strain of China and belong to PRRS virus type 2 (North America). PRRS HUA 01 and PRRS HUA 02 strains have stable, typical, biological and molecular biological characteristics and high pathogenic which could be used for PRRS vaccine production, assessment of vaccine effectiveness or biotic products such as rapid test Kits, Antigens for diagnosis with the arm of prevention and treatment of PRRS. xvi
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Bệnh tai xanh hay hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome – PRRS) là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của lợn mọi nòi giống, mọi lứa tuổi. Bệnh tai xanh do một loại virus gây ra, virus tấn công là các đại thực bào dẫn đến hiện tƣợng suy giảm miễn dịch ở lợn, tạo điều kiện cho các virus, vi khuẩn gây bệnh khác tấn công. Bệnh tai xanh gây thiệt hại nặng nề đối với ngành chăn nuôi lợn, đối với lợn nái, bệnh gây hậu quả nghiêm trọng nhƣ: sảy thai, lợn con sơ sinh yếu ớt, giảm số con sơ sinh/ổ, tình trạng bệnh kéo dài âm ỉ, rối loạn sinh sản, động dục kéo dài, chậm động dục trở lại. Đối với đực giống, số lƣợng tinh dịch giảm, chất lƣợng tinh dịch kém, ảnh hƣởng đến tỷ lệ thụ thai và chất lƣợng đàn con. Bệnh xuất hiện đầu tiên ở Mỹ năm 1987 (Keffaber, 1989), rất nhanh chóng sau đó bệnh lan sang Canada và sau đó lan sang các nƣớc châu Âu. Năm 1991, virus đƣợc tìm thấy tại Hà Lan (Terpstra et al., 1991). Năm 1998, bệnh đƣợc phát hiện ở Hàn Quốc, Nhật Bản thuộc khu vực châu Á. Từ năm 2005 trở lại đây, bệnh lây lan khắp các nƣớc trên toàn thế giới. Tác nhân gây bệnh - virus PRRS (PRRSV) là một thành viên của giống Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirale (Collins et al., 1992). PRRSV rất nhỏ, hệ gene của virus gồm một sợi RNA đơn dƣơng có kích thƣớc khoảng 15 kb. Bộ gene gồm có 9 khung đọc mở (ORF) (Lee and Yoo, 2005). Khung đọc mở ORF 1a và ORF1b mã hoá các polymerase protein liên quan đến sự nhân lên của virus, có thể chia thành ít nhất 13 protein phi cấu trúc (NSP). Nsp1α, Nsp1β, Nsp2-6, Nsp7α, Nsp7β, Nsp8-Nsp12. Mặc dù các Protein phi cấu trúc chiếm ¾ genome của PRRSV nhƣng vẫn chƣa biết nhiều về chức năng của các protein này. Vai trò của Nsp1α, Nsp1β là quan trọng cho sự tổng hợp mRNA (Nspα) và tái tạo hệ gene (Nspβ) (Krocse et al., 2008). Hai protein này cũng cản trở sự tổng hợp interferon loại 1. ORF2 - ORF7 đặt tại vị trí đầu 3’ của genome mã hoá cho GP5 và protein màng M (Matrix protein), protein màng nhân N (Nucleocapsid). Tuy nhiên chỉ có 6 phân tử protein chính có khả năng trung hòa kháng thể bao gồm 4 phân tử glycoprotein, 1 phân tử protein màng (M) và 1 protein màng nhân (N), nhƣng hoạt động trung hòa xảy ra mạnh với các protein có khối lƣợng 45, 31 và 25 KD. 1
Trong đó, N là loại protein có số lƣợng nhiều nhất trong cấu trúc hạt virus và đồng thời nó có tính kháng nguyên rất cao vì thế nó là dấu hiệu nhận biết của kháng thể đặc hiệu và là dấu hiệu dùng trong chẩn đoán bệnh (Done et al., 1996). ORF3 mã hoá glycoprotein cấu trúc nhỏ - GP3 và ORF5 mã hoá glycoprotein vỏ GP5 là các đoạn gene thƣờng đƣợc chọn để khảo sát về sự đa dạng và phân tích cây phả hệ nhằm tìm hiểu về sự đa dạng di truyền. Gần đây phát hiện thêm protein ORF5a nhƣng vẫn chƣa hiểu biết rõ về chức năng và vị trí của nó trong cấu trúc virus. GP2 đƣợc mã hóa bởi ORF2 ở virus PRRSV type I có 249 amino acid và 256 amino acid ở type II. GP2 có liên quan đến việc cởi vỏ và giải phóng hệ gene của virus. Protein E đƣợc tổng hợp từ khung đọc mở ORF2 cùng với GP2 có chiều dài 70 amino acid đối với PRRSV type I và 73 amino acid với PRRSV type II. ORF3 mã hóa cho protein GP3 có chiều dài 265 amino acid đối với PRRSV type I và 254 amino acid đối với PRRSV type II. GP3 có cấu trúc luôn thay đổi, GP3 mang epitope B cell và epitope trung hòa thƣờng mang lại dƣơng tính huyết thanh học với các mẫu kháng huyết thanh PRRSV. GP4 đƣợc mã hóa bởi ORF4 có độ dài 183 amino acid và 178 amino acid tƣơng ứng cho PRRSV type I và type II. Phần đuôi 3’ của ORF3 chính là phần đầu 5’ của ORF4 do vậy thiếu amino acid sẽ xảy ra đồng thời tại protein GP3 và GP4. GP5 là glycoprotein đƣợc thấy nhiều nhất trên bề mặt virion của PRRSV, là phân tử protein đƣợc mã hóa bởi ORF5, là một trong những vùng thƣờng thay đổi nhất trong genome của PRRSV và là đoạn gene đƣợc xét đến nhiều nhất trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền (Shi et al., 2010). Dựa vào phân tích cấu trúc gene, PRRSV đƣợc chia thành 2 nhóm genotype: Nhóm I (châu Âu) đại diện bởi virus Lelystad và nhóm II (Bắc Mỹ) đại diện bởi virus VR – 2332 (Nelson et al., 1993). Mặc dù PRRSV thuộc cả hai nhóm này đều có thể gây ra hội chứng tƣơng tự nhau trên lợn, chúng chỉ giống nhau 55-70% về nucleotide và khoảng 50-80% về amino acid. Tại thực địa, sự đa dạng cả về đặc tính di truyền và đặc tính kháng nguyên của các chủng PRRSV là nguyên nhân dẫn đến việc sử dụng vắc-xin không hiệu quả và đôi khi xảy ra những ổ dịch PRRS lớn. Từ năm 2005 trở lại đây, 25 nƣớc và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châu lục trên thế giới đã báo cáo cho Tổ chức Thú y thế giới (OIE) là có dịch PRRS lƣu hành (trừ châu Úc và Newzeland). 2