Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu ứng dụng chitosan tan trong nước trong kháng nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên xoài, chuối, ớt sau thu hoạch

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:189

Thêm vào BST

Báo xấu

43
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của Luận án nhằm tạo được chitosan khối lượng phân tử thấp, tan trong nước và có khả năng kháng bệnh thán thư hại rau quả (xoài, chuối, ớt) từ chitosan bằng phương pháp cắt mạch bởi hydrogen peroxide. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu ứng dụng chitosan tan trong nước trong kháng nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên xoài, chuối, ớt sau thu hoạch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NHA TRANG TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÊ THANH LONG NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHITOSAN TAN TRONG NƯỚC TRONG KHÁNG NẤM COLLETOTRICHUM SPP. GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN XOÀI, CHUỐI, ỚT SAU THU HOẠCH LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHÁNH HOÀ - 2019
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LÊ THANH LONG NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHITOSAN TAN TRONG NƯỚC TRONG KHÁNG NẤM COLLETOTRICHUM SPP. GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN XOÀI, CHUỐI, ỚT SAU THU HOẠCH Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thuỷ sản Mã số : 9540105 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS Trang Sĩ Trung 2. PGS. TS Vũ Ngọc Bội KHÁNH HOÀ - 2019
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Khánh Hoà, 2019 Tác giả luận án Lê Thanh Long iii
LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành Luận án này, trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu, Lãnh đạo phòng Đào tạo Sau đại học và Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên cứu tại Trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho PGS. TS. Trang Sĩ Trung - Hiệu trưởng Trường Đại học Nha Trang và PGS. TS. Vũ Ngọc Bội - Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Xin chân thành cám ơn: các thầy cô trong hội đồng và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng. Xin cám ơn quý thầy cô giáo thuộc: Viện Tài nguyên và Công nghệ Sinh học - Đại học Huế, Phòng Thí nghiệm Sinh thái Vi sinh, Khoa Nông nghiệp - Đại học Kyoto Nhật Bản và Phòng thí nghiệm Trung tâm Thực hành Thí nghiệm - Trường Đại học Nha Trang đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án này. Xin chân thành cám ơn Lãnh đạo Trường Đại học Nông Lâm Huế, Ban Chủ nhiệm Khoa Cơ khí Công nghệ, các thầy cô giáo - Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, bộ môn Công nghệ Sau thu hoạch - Trường Đại học Nông Lâm Huế đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi được đi học và hoàn thành Luận án tiến sĩ. Đặc biệt, xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ, động viên của gia đình và bạn bè luôn luôn chia sẻ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu. iv
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN…………………………………………………………………iii LỜI CÁM ƠN……………………………………………………………………..iv MỤC LỤC ………………………………………………………………………...v DANH MỤC CÁC BẢNG ……………………………………………………….ix DANH MỤC CÁC HÌNH ………………………………………………………..xi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT …………………………………………….....xvii TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN………………………..xix MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 4 1.1. TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN VÀ CHITOSAN HÒA TAN TRONG NƯỚC ........... 4 1.1.1. Giới thiệu về chitosan và chitosan hoà tan trong nước ..................................... 4 1.1.2. Các phương pháp thuỷ phân cắt mạch chitosan ................................................ 5 1.1.3. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và kích kháng của chitosan....................... 9 1.2. KHÁI QUÁT VỀ NGUỒN GỐC, ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ BỆNH SAU THU HOẠCH THƯỜNG GẶP TRÊN XOÀI, CHUỐI VÀ ỚT .............................. 11 1.2.1. Xoài ................................................................................................................. 11 1.2.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm sinh học .................................................................. 11 1.2.1.2. Bệnh sau thu hoạch thường gặp trên xoài .................................................... 12 1.2.2. Chuối ............................................................................................................... 15 1.2.2.1. Nguồn gốc và đặc điểm sinh học .................................................................. 15 1.2.2.2. Bệnh sau thu hoạch thường gặp trên chuối .................................................. 16 1.2.3. Ớt ..................................................................................................................... 18 1.2.3.1. Nguồn gốc và đặc điểm sinh học .................................................................. 18 1.2.3.2. Bệnh sau thu hoạch thường gặp trên ớt ........................................................ 19 1.3. TỔNG QUAN VỀ NẤM COLLETOTRICHUM SPP. GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN XOÀI, CHUỐI VÀ ỚT SAU THU HOẠCH VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỪ ........................................................................................................................... 21 1.3.1. Đặc điểm sinh học ........................................................................................... 22 1.3.1.1. Colletotrichum trên xoài ............................................................................... 22 v
1.3.1.2. Colletotrichum trên chuối ............................................................................. 23 1.3.1.3. Colletotrichum trên ớt .................................................................................. 24 1.3.2. Sinh lý và cơ chế xâm nhập phát triển bệnh thán thư trên rau quả sau thu hoạch.......................................................................................................................... 25 1.3.3. Các biện pháp kiểm soát bệnh thán thư sau thu hoạch .................................... 27 1.3.3.1. Biện pháp phòng ngừa .................................................................................. 27 1.3.3.2. Biện pháp kiểm soát ..................................................................................... 27 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC LIÊN QUAN ĐẾN WSC VÀ BỆNH THÁN THƯ .................................................................................. 29 1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước .................................................................... 29 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước .................................................................... 33 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 36 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ........................................................................................ 36 2.1.1. Chitosan ........................................................................................................... 36 2.1.2. Nấm gây bệnh thán thư.................................................................................... 36 2.1.3. Rau quả sau thu hoạch ..................................................................................... 36 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 36 2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm ........................................................................ 36 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu WSC ....................................................................... 38 2.2.2.1. Phương pháp tinh sạch chitosan và cắt mạch thu hồi WSC ......................... 38 2.2.2.2. Phương pháp xác định phân tử lượng trung bình chitosan ........................... 39 2.2.2.3. Phương pháp xác định quang phổ hấp phụ hồng ngoại của sản phẩm WSC39 2.2.2.4. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình cắt mạch theo phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) .......................................................................................................... 39 2.2.3. Phương pháp phân lập, tuyển chọn và định danh nấm thán thư hại xoài, chuối, ớt ................................................................................................................................ 40 2.2.3.1. Phương pháp phân lập và giám định nấm thán thư hại xoài, chuối, ớt ........ 40 2.2.3.2. Phương pháp định danh ở cấp độ loài bằng phương pháp sinh học phân tử 42 2.2.4. Phương pháp thí nghiệm đánh giá khả năng kháng bệnh thán thư hại xoài, chuối, ớt của WSC ..................................................................................................... 43 vi
2.2.4.1. Xác định thời gian nảy mầm của bào tử nấm Colletotrichum spp. .............. 43 2.2.4.2. Đánh giá khả năng kháng bệnh thán thư hại xoài, chuối, ớt của WSC ở điều kiện in vitro................................................................................................................ 43 2.2.4.3. Đánh giá khả năng kháng bệnh thán thư hại xoài của WSC ở điều kiện in vivo ............................................................................................................................ 45 2.2.4.4. Đánh giá ảnh hưởng của WSC đến hoạt độ enzyme liên quan đến khả năng kích kháng ngoại bào và biến đổi polyphenol tổng số .............................................. 47 2.2.5. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của xử lý tạo màng WSC đến những biến sinh lý, hoá sinh của xoài, chuối, ớt trong quá trình bảo quản .................................. 50 2.2.5.1. Phương pháp xác định các chỉ tiêu hoá lý .................................................... 50 2.2.5.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh hoá ................................................ 51 2.3. HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ CHỦ YẾU ĐÃ SỬ DỤNG ................................... 52 2.3.1. Hoá chất sử dụng ............................................................................................. 52 2.3.2. Các thiết bị chủ yếu sử dụng trong nghiên cứu ............................................... 52 2.4. PHƯƠNG PHÁP THU THẬP VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU ....................................... 53 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................. 54 3.1. NGHIÊN CỨU CẮT MẠCH CHITOSAN TẠO WSC BẰNG TÁC NHÂN H2O2 ........................................................................................................................... 54 3.1.1. Xác định các thông số biên cho quá trình tối ưu hóa cắt mạch chitosan tạo WSC .......................................................................................................................... 54 3.1.2. Tối ưu hoá quá trình cắt mạch chitosan tạo WSC theo phương pháp Box- Behnken ..................................................................................................................... 56 3.1.3. Xác định khối lượng phân tử trung bình của sản phẩm WSC ......................... 59 3.2. PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH NẤM THÁN THƯ GÂY HẠI XOÀI, CHUỐI, ỚT ................................................................................................... 61 3.2.1. Phân lập nấm gây bệnh thán thư trên xoài, chuối, ớt ...................................... 61 3.2.2. Định danh nấm C. gloeosporioides, C. musae và C. capsici ở cấp độ loài ..... 67 3.2.3. Đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các chủng nấm gây bệnh thán thư đã phân lập ..................................................................................................................... 70 3.3. KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH THÁN THƯ HẠI XOÀI, CHUỐI, ỚT CỦA vii
WSC .......................................................................................................................... 72 3.3.1. Đánh giá khả năng kháng bệnh thán thư hại xoài, chuối, ớt của WSC ở điều kiện in vitro................................................................................................................ 72 3.3.1.1. Ảnh hưởng của WSC đến sự sinh trưởng của C. gloeosporioides L2, C. musae D1 và C. capsici B4 trong môi trường PDA ................................................. 72 3.3.1.2. Ảnh hưởng của WSC đến sinh khối sợi nấm C. gloeosporioides L2, C. musae D1 và C. capsici B4 trong môi trường PDB................................................... 80 3.3.2. Đánh giá khả năng kháng bệnh thán thư hại xoài, chuối, ớt của WSC ở điều kiện in vivo ................................................................................................................ 96 3.3.2.1. Ảnh hưởng của WSC đến bệnh thán thư hại xoài, chuối, ớt ở điều kiện in vivo ...... 96 3.3.2.2. Đánh giá khả năng kích kháng của WSC đến bệnh thán thư hại quả xoài, chuối, ớt ở điều kiện in vivo .................................................................................... 115 3.4. ẢNH HƯỞNG CỦA WSC ĐẾN MỘT SỐ BIẾN ĐỔI CỦA QUẢ XOÀI, CHUỐI, ỚT TRONG QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN ................................................. 127 3.4.1. Ảnh hưởng của WSC đến một số biến đổi hoá lý của quả xoài, chuối, ớt trong quá trình bảo quản ................................................................................................... 127 3.4.2. Ảnh hưởng của WSC đến một số biến đổi sinh hoá của quả xoài, chuối, ớt trong quá trình bảo quản .......................................................................................... 134 3.5. ĐỀ XUẤT QUI TRÌNH ỨNG DỤNG WSC TRONG KHÁNG BỆNH THÁN THƯ TRÊN XOÀI, CHUỐI, ỚT SAU THU HOẠCH ........................................... 143 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................. 145 1. KẾT LUẬN ......................................................................................................... 145 2. KIẾN NGHỊ......................................................................................................... 146 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ............................................... 147 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 148 viii
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng có trong 100g xoài chín ..................................... 12 Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng có trong 100g chuối chín ................................... 16 Bảng 1.3. Thành phần dinh dưỡng có trong 100 g ớt cay tươi .................................. 19 Bảng 2.1. Mức thí nghiệm của các biến độc lập........................................................ 40 Bảng 3.1. Bảng ma trận quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp hai theo mô hình ..... 56 Box-Behnken và hiệu suất thu hồi WSC ................................................................... 56 Bảng 3.2. Phân tích phương sai mô hình bậc hai bề mặt đáp ứng............................. 58 Bảng 3.3. Kết quả gây bệnh nhân tạo trên quả bằng các chủng nấm thán thư đã phân lập .............................................................................................................................. 64 Bảng 3.4. Đặc điểm đại thể và vi thể của các chủng L2, D1 và B4 ........................... 66 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến ĐKTN của C. gloeosporioides L2 nuôi trên PDA ............................................................................................................ 73 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến ĐKTN của C. musae D1 nuôi trên PDA ........................................................................................................................... 75 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến ĐKTN của C. capsici B4 nuôi trên PDA ........................................................................................................................... 76 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến sự nảy mầm của bào tử nấm C. gloeosporioides L2 .................................................................................................... 88 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến sự nảy mầm của bào tử nấm C. musae D1 .............................................................................................................................. 90 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến sự nảy mầm của bào tử nấm C. capsici B4 .............................................................................................................. 92 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ bào tử C. gloeosporioides L2 đến tỷ lệ nhiễm bệnh thán thư trên xoài sau thu hoạch ....................................................................... 97 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ bào tử C. gloeosporioides L2 đến ĐKVB thán thư trên xoài sau thu hoạch ........................................................................................ 98 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ bào tử nấm C. musae D1 đến tỷ lệ nhiễm thán thư trên chuối sau thu hoạch .................................................................................... 100 ix
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của nồng độ bào tử nấm C. musae D1 đến ĐKVB thán thư trên chuối sau thu hoạch .......................................................................................... 100 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nồng độ bào tử C. capsici B4 đến tỷ lệ nhiễm bệnh ở ớt sau thu hoạch ........................................................................................................... 101 Bảng 3.16. Ảnh hưởng của nồng độ bào tử C. capsici B4 đến ĐKVB thán thư trên ớt sau thu hoạch ........................................................................................................... 102 Bảng 3.17. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến tỷ lệ bệnh và thời gian hình thành vết bệnh thán thư do C. gloeosporioides L2 gây nhiễm nhân tạo trên xoài .................. 105 Bảng 3.18. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến ĐKVB thán thư do nấm C. gloeosporioides L2 nhiễm nhân tạo trên xoài.......................................................... 106 Bảng 3.19. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến tỷ lệ bệnh và thời gian hình thành vết bệnh thán thư do C. musae D1 gây nhiễm nhân tạo trên chuối ............................... 108 Bảng 3.20. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến ĐKVB thán thư do nấm C. musae D1 gây nhiễm nhân tạo trên chuối................................................................................. 108 Bảng 3.21. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến tỷ lệ bệnh và thời gian hình thành vết bệnh thán thư do C. capsici B4 gây nhiễm nhân tạo trên ớt .................................... 110 Bảng 3.22. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến ĐKVB thán thư do nấm C. capsici B4 gây nhiễm nhân tạo trên ớt ...................................................................................... 111 x
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Một số bệnh sau thu hoạch điển hình trên xoài ......................................... 14 Hình 1.2. Một số bệnh sau thu hoạch điển hình trên xoài ......................................... 17 Hình 1.3. Một số bệnh sau thu hoạch điển hình trên ớt ............................................. 21 Hình 1.4. Đặc điểm nấm C. gloeosporioides trên xoài .............................................. 23 Hình 1.5. Đặc điểm nấm C. musae trên chuối ........................................................... 24 Hình 1.6. Đặc điểm nấm C. capsici trên ớt................................................................ 25 Hình 1.7. Xâm nhập bán sinh dưỡng của nấm C. lindemuthianum .......................... 27 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát .............................................................. 37 Hình 2.2. Qui trình phân lập và giám định nấm từ mẫu bệnh ................................... 41 Hình 2.3. Mẫu xoài, chuối, ớt có vết bệnh thán thư điển hình .................................. 42 Hình 3.1. Biến đổi hiệu suất thu hồi WSC theo thời gian, ở nồng độ H2O2 5% và nhiệt độ phản ứng 40oC............................................................................................... 54 Hình 3.2. Biến đổi hiệu suất thu hồi WSC theo nhiệt độ, ở nồng độ H2O2 5% và thời gian phản ứng 3 giờ .................................................................................................... 54 Hình 3.3. Biến đổi hiệu suất thu hồi WSC theo nồng độ, ở nhiệt độ thuỷ phân 40oC và thời gian phản ứng 3 giờ ............................................................................................. 55 Hình 3.4. Mô hình 3D ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ H2O2 đến hiệu suất thu hồi WSC, thời gian phản ứng 3h ............................................................................... 57 Hình 3.5. Mô hình 3D ảnh hưởng của thời gian và nồng độ H2O2 đến hiệu suất thu hồi WSC, nhiệt độ phản ứng ở 45oC ......................................................................... 57 Hình 3.6. Mô hình 3D ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến hiệu suất thu hồi WSC, ở nồng độ H2O2 5%......................................................................................... 57 Hình 3.7. Sản phẩm WSC.......................................................................................... 59 Hình 3.8. Phổ hồng ngoại FT-IR của các loại chitosan ............................................. 60 Hình 3.9. Đặc điểm hình thái nấm thán thư phân lập từ vết bệnh trên xoài .............. 62 Hình 3.10. Đặc điểm hình thái nấm thán thư phân lập từ vết bệnh trên chuối .......... 63 Hình 3.11. Đặc điểm hình thái nấm thán thư phân lập từ vết bệnh trên ớt ............... 63 xi
Hình 3.12. Hình thái khuẩn lạc của chủng L2 phân lập từ trái xoài trên môi trường PDA ........................................................................................................................... 64 Hình 3.13. Đặc điểm vi thể của chủng L2 phân lập từ trái xoài ................................ 65 Hình 3.14. Hình thái khuẩn lạc của chủng D1 phân lập từ chuối trên môi trường PDA .... 65 Hình 3.15. Đặc điểm vi thể của chủng D1 phân lập từ chuối .................................... 65 Hình 3.16. Hình thái khuẩn lạc của chủng B4 phân lập từ chuối trên môi trường PDA..... 65 Hình 3.17. Đặc điểm vi thể của chủng B4 phân lập từ ớt ......................................... 66 Hình 3.18. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của gen mã hoá vùng ITS tách chiết từ tế bào nấm L2, D1, B4 trên gel agarose .................................................................... 68 Hình 3.19. Kết quả so sánh mức độ tương đồng của chủng định danh L2 và chủng C. gloeosporioides AJ301909 trong ngân hàng gen....................................................... 68 Hình 3.20 Kết quả so sánh mức độ tương đồng của chủng định danh D1 và chủng C. musae AJ301409 trong ngân hàng gen ................................................................. 69 Hình 3.21. Kết quả so sánh mức độ tương đồng của chủng định danh B4 và chủng C. capsici DQ286159 trong ngân hàng gen ............................................................... 69 Hình 3.22. Cây quan hệ phát sinh loài của nấm mốc (3 mẫu nấm thán thư trên xoài, chuối, ớt và 3 mẫu nấm thán thư thu thập từ nho, thanh long) dựa trên trình tự ITS .................... 71 Hình 3.23. Hình ảnh nấm C. gloeosporioides L2 sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA bổ sung WSC ở nhiệt độ 25 - 28oC ....................................................... 73 Hình 3.24. Hình ảnh nấm C. musae D1 sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA, bổ sung WSC ở nhiệt độ 25 - 28oC ........................................................................... 75 Hình 3.25. Hình ảnh nấm C. capsici B4 sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA bổ sung WSC ở nhiệt độ 25 - 28oC ........................................................................... 76 Hình 3.26. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến sinh khối nấm C. gloeosporioides L2 sau 10 ngày nuôi cấy ở 25 - 28oC .............................................................................. 81 Hình 3.27. Hình ảnh nấm C. gloeosporioides L2 sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường PDB bổ sung WSC ở 25 - 28oC ..................................................................... 81 Hình 3.28. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến sinh khối nấm C. musae D1 sau 10 ngày nuôi cấy ở 25 - 28oC ......................................................................................... 82 xii
Hình 3.29. Hình ảnh nấm C. musae D1 sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường PDB bổ sung WSC ở 25 - 28oC ......................................................................................... 83 Hình 3.30. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến sinh khối nấm C. capsici B4 sau 10 ngày nuôi cấy ở 25 - 28oC ......................................................................................... 83 Hình 3.31. Hình ảnh nấm C. capsici B4 sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường PDB bổ sung WSC 25 - 28oC............................................................................................. 84 Hình 3.32. Hình ảnh bào tử nấm C. gloeosporioides L2 dưới kính hiển vi vật kính 40X sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau.................................................... 86 Hình 3.33. Hình ảnh bào tử nấm C. musae D1 dưới kính hiển vi vật kính 40X sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau .................................................................. 87 Hình 3.34. Hình ảnh bào tử nấm C. capsici B4 dưới kính hiển vi vật kính 40X sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau .................................................................. 87 Hình 3.35. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến sự nảy mầm của bào tử nấm C. gloeosporioides L2 sau 5 giờ nuôi ở 25 - 28oC ......................................................... 89 Hình 3.36. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến sự nảy mầm của bào tử nấm C. gloeosporioides L2 sau 7 giờ nuôi ở 25 - 28oC ......................................................... 89 Hình 3.37. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến sự nảy mầm của bào tử nấm C. musae D1 sau 5 giờ nuôi ở 25 - 28oC ................................................................................... 91 Hình 3.38. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến sự nảy mầm của bào tử nấm C. musae D1 sau 12 giờ nuôi ở 25 - 28oC ................................................................................. 91 Hình 3.39. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến sự nảy mầm của bào tử nấm C. capsici B4 sau 5 giờ nuôi ở 25 - 28oC ................................................................................... 93 Hình 3.40. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến sự nảy mầm của bào tử nấm C. capsici B4 sau 12 giờ nuôi ở 25 - 28oC ................................................................................. 94 Hình 3.41. Hình ảnh vết bệnh thán thư trên quả xoài do nấm C. gloeosporioides L2 sau 4 ngày gây nhiễm nhân tạo với nồng độ bào tử khác nhau ................................. 97 Hình 3.42. Hình ảnh vết bệnh thán thư trên quả chuối do nấm C. musae D1 sau 5 ngày gây nhiễm nhân tạo với nồng độ bào tử khác nhau ........................................ 101 Hình 3.43. Hình ảnh vết bệnh thán thư trên quả ớt do nấm C. capsici B4 sau 5 ngày gây nhiễm nhân tạo với nồng độ bào tử khác nhau ................................................. 103 xiii
Hình 3.44. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến sự hình thành vết bệnh thán thư do nấm C. gloeosporioides L2 trên quả xoài sau 6 ngày gây nhiễm nhân tạo ở 25-28oC ...... 107 Hình 3.42. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến sự hình thành vết bệnh thán thư do nấm C. musae D1 trên quả chuối sau 6 ngày gây nhiễm nhân tạo ở 25 - 28oC....... 109 Hình 3.43. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến sự hình thành vết bệnh thán thư do nấm C. capsici B4 trên quả ớt sau 6 ngày gây nhiễm nhân tạo ở 25 - 28oC............ 112 Hình 3.47. Ảnh hưởng của lây nhiễm nhân tạo bệnh thán thư và xử lý WSC đến hoạt độ chitinase trên vỏ xoài bảo quản ở 25 - 28oC ....................................................... 116 Hình 3.48. Ảnh hưởng của lây nhiễm nhân tạo bệnh thán thư và xử lý WSC đến đến hoạt độ β-1,3-glucanase trên vỏ quả xoài bảo quản ở 25 - 28oC ............................. 117 Hình 3.49. Ảnh hưởng của lây nhiễm nhân tạo bệnh thán thư và xử lý WSC đến hoạt độ chitinase trên vỏ quả chuối bảo quản ở 25 - 28oC .............................................. 117 Hình 3.50. Ảnh hưởng của lây nhiễm nhân tạo bệnh thán thư và xử lý WSC đến hoạt độ của β-1,3-glucanase trên vỏ quả chuối bảo quản ở 25 - 28oC ............................ 118 Hình 3.51. Ảnh hưởng của lây nhiễm nhân tạo bệnh thán thư và xử lý WSC đến đến hoạt độ chitinase trên vỏ quả ớt bảo quản ở 25 - 28oC ............................................ 118 Hình 3.52. Ảnh hưởng của lây nhiễm nhân tạo bệnh thán thư và xử lý WSC đến hoạt độ β-1,3-glucanase trên vỏ quả ớt bảo quản ở 25 - 28oC ........................................ 119 Hình 3.53. Ảnh hưởng của lây nhiễm nhân tạo bệnh thán thư và xử lý WSC đến hàm lượng polyphenol tổng số trên vỏ quả xoài bảo quản ở 25 - 28oC .......................... 120 Hình 3.54. Ảnh hưởng của lây nhiễm nhân tạo bệnh thán thư và xử lý WSC đến hàm lượng polyphenol tổng số trên vỏ quả chuối bảo quản ở 25 - 28oC ........................ 121 Hình 3.55. Ảnh hưởng của lây nhiễm nhân tạo bệnh thán thư và xử lý WSC đến hàm lượng polyphenol tổng số trên vỏ quả ớt bảo quản ở 25 - 28oC .............................. 122 Hình 3.56. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến HHKL của quả xoài sau 9 ngày bảo quản ở 25 - 28oC ...................................................................................................... 127 Hình 3.57. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến HHKL của quả chuối sau 10 ngày bảo quản ở 25 - 28oC ............................................................................................... 128 Hình 3.58. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến HHKL của quả ớt sau 12 ngày bảo quản ở 25 - 28oC ...................................................................................................... 128 xiv
Hình 3.59. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến biến đổi độ cứng của quả xoài sau 9 ngày bảo quản ở 25 - 28oC ...................................................................................... 129 Hình 3.60. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến độ cứng của quả chuối sau 10 ngày bảo quản ở 25 - 28oC ............................................................................................... 129 Hình 3.61. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến độ cứng của quả ớt sau 12 ngày bảo quản ở 25 - 28oC ...................................................................................................... 130 Hình 3.62. Ảnh hưởng của WSC đến biến đổi cường độ màu của vỏ quả xoài sau 9 ngày bảo quản ở 25 - 28oC ...................................................................................... 130 Hình 3.63. Ảnh hưởng của WSC đến biến đổi cường độ màu của vỏ quả chuối sau 10 ngày bảo quản ở 25 - 28oC ................................................................................. 131 Hình 3.64. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến thay đổi độ sáng của vỏ quả ớt bảo quản ở 25 - 28oC ...................................................................................................... 131 Hình 3.65. Hình ảnh quả xoài xử lý bằng WSC với nồng độ khác nhau sau 9 ngày bảo quản ở 25 - 28oC ............................................................................................... 132 Hình 3.66. Hình ảnh quả chuối xử lý bằng WSC với nồng độ khác nhau sau 10 ngày bảo quản ở 25 - 28oC ...................................................................................... 132 Hình 3.67. Hình ảnh quả ớt xử lý bằng WSC với nồng độ khác nhau sau 12 ngày bảo quản ở 25 - 28oC ............................................................................................... 133 Hình 3.68. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến sự thay đổi hàm lượng chất khô của quả xoài bảo quản ở 25 - 28oC ................................................................................ 134 Hình 3.69. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến sự thay đổi acid tổng số của quả xoài bảo quản ở 25 - 28oC ............................................................................................... 135 Hình 3.70. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến sự thay đổi hàm lượng chất khô của chuối bảo quản ở 25 - 28oC ..................................................................................... 135 Hình 3.71. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến sự thay đổi acid tổng số của quả chuối bảo quản ở 25 - 28oC ..................................................................................... 136 Hình 3.72. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến sự thay đổi hàm lượng chất khô của quả ớt bảo quản ở 25 - 28oC .................................................................................... 136 Hình 3.73. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến sự thay đổi acid tổng số của quả ớt bảo quản ở 25 - 28oC ............................................................................................... 137 xv
Hình 3.74. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến cường độ hô hấp của quả xoài bảo quản ở 25 - 28oC ...................................................................................................... 138 Hình 3.75. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến cường độ sinh etylen của quả xoài bảo quản ở 25 - 28oC ............................................................................................... 139 Hình 3.76. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến cường độ hô hấp của quả chuối bảo quản ở 25 - 28oC ...................................................................................................... 140 Hình 3.77. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến cường độ sinh etylen của quả chuối bảo quản ở 25 - 28oC ............................................................................................... 140 Hình 3.78. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến cường độ hô hấp của quả ớt bảo quản ở 25 - 28oC .............................................................................................................. 141 Hình 3.79. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến cường độ sinh etylen của quả ớt bảo quản ở 25 - 28oC ...................................................................................................... 141 Hình 3.80. Qui trình ứng dụng WSC trong kháng bệnh thán thư trên quả xoài, chuối, ớt sau thu hoạch ....................................................................................................... 143 xvi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT KÝ HIỆU TIẾNG ANH TIẾNG VIỆT AUDPC Area Under Disease Đường cong tiến triển bệnh Progress Curve CA Controlled Atmosphere Môi trường khí quyển được điều chỉnh CT Công thức CĐM Cường độ màu DD Degree of Deacetylation Độ deacetyl hóa ĐC Đối chứng ĐKTN Đường kính tản nấm ĐKVB Đường kính vết bệnh ĐVT Đơn vị tính DNA Deoxyribonucleic Acid EC50 The Effective Concentration Nồng độ ức chế 50% sự phát Inhibiting Growth by 50% triển tản nấm FAOSTAT Food and Agriculture Dữ liệu thống kê của Tổ chức Organization of the United Nông lương thế giới Nations Statistics h Giờ HHKL Hao hụt khối lượng IC50 The Concentration Inhibiting Nồng độ ức chế đến 50% sự Growth by 50% phát triển sợi nấm MA Modified Atmosphere Môi trường không khí được điều chỉnh MIC90 The Minimum Nồng độ ức chế tối thiểu 90% Concentration Showing over sự phát triển tản nấm 90% Inhibition of Mycelial Growth MW Molecular Weight Khối lượng phân tử mRNA Messenger Ribonucleic Acid PAL Phenylalanine Ammonia Lyase PDA Potato Dextrose Agar xvii
PDB Potato Dextrose Broth PISG Percentage Inhibition of Tỷ lệ phần trăm ức chế sự nảy Spore Growth mầm bào tử PIRG Percentage Inhibition of Tỷ lệ phần trăm ức chế sự phát Radial Growth triển đường kính tản nấm PTN Phòng thí nghiệm STT Số thứ tự TN Thí nghiệm VK/VSV Vi khuẩn/vi sinh vật WSC Water-soluble Chitosan xviii
TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đề tài luận án: Nghiên cứu ứng dụng chitosan tan trong nước trong kháng nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên xoài, chuối, ớt sau thu hoạch. Ngành/Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản Mã số: 9540105 Nghiên cứu sinh: Lê Thanh Long Khoá: 2012 Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. Trang Sĩ Trung 2. PGS.TS. Vũ Ngọc Bội Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang Nội dung: Luận án đã đạt được một số kết quả mới đóng góp vào lĩnh vực nghiên cứu: 1) Luận án đã xác định điều kiện cắt mạch chitosan thương mại độ deacetyl 85 - 90% bằng H2O2 thu hồi chitosan hòa tan trong nước (WSC) đạt hiệu suất cao nhất: nồng độ H2O2 5,4%, nhiệt độ 47,1oC và thời gian 3,4 giờ với hiệu suất thu hồi đạt 85,6 ± 2,5%. WSC có khối lượng phân tử trung bình là 31,5 KDa và cấu trúc có cấu trúc mạch phân tử hầu như không thay đổi so với chitosan ban đầu. 2) Luận án đã phân lập và định danh được 3 loài nấm: C. gloeosporioides L2 từ xoài, C. musae D1 từ chuối và C. capsici B4 từ ớt gây bệnh thán thư điển hình. Trong đó, 2 chủng C. gloeosporioides L2 từ xoài và C. musae D1 từ chuối có mối quan hệ di truyền gần. 3) Luận án đã đánh giá khả năng kháng nấm C. gloeosporioides L2, C. musae D1 và C. capsici B4 gây bệnh thán thư điển hình tương ứng trên xoài, chuối và ớt sau thu hoạch ở điều kiện in vitro của WSC. Kết quả cho thấy WSC ức chế mạnh sự phát triển 3 chủng C. gloeosporioides L2, C. musae D1 và C. capsici B4 trên môi trường rắn PDA và môi trường lỏng PDB. WSC đã gây ức chế và biến đổi hình thái rõ rệt sự nãy mầm các bào tử nấm C. gloeosporioides L2 C. musae D1 và C. capsici B4. 4) Luận án đã đánh giá khả năng kháng bệnh thán thư điển hình tương ứng trên xoài, chuối và ớt sau thu hoạch ở điều kiện in vivo của WSC. WSC có tác dụng khống chế rõ rệt sự hình thành và phát triển vết bệnh bệnh thán thư sau thu hoạch do nấm C. gloeosporioides L2, C. musae D1 và C. capsici B4 lây bệnh nhân tạo tương ứng trên xoài, chuối và ớt. Đồng thời, việc xử lý WSC cho biểu hiện kích kháng rõ rệt thông qua sự thay đổi hoạt tính chitinase, β-1,3-glucanase và tích lũy các hợp chất xix
phenolic trên mô vỏ quả. 5) Luận án đã đánh giá tác dụng bảo quản bằng xử lý tạo màng bởi WSC với nồng độ 0,5 - 2% trên xoài, chuối và 0,25 - 1% trên ớt sau thu hoạch. Màng WSC đã thể hiện khả năng làm chậm các biến đổi hoá lý (hao hụt khối lượng, biến đổi độ cứng và cường độ màu), sinh hoá (chất khô hoà tan, acid tổng số, cường độ hô hấp và sinh etylen) giúp kéo dài thời gian bảo quản sau thu hoạch xoài, chuối và ớt ở nhiệt độ 25 - 28oC. Kết quả nghiên cứu là cơ sở đề xuất ứng dụng dẫn xuất chitosan tan trong nước trong bảo quản xoài, chuối và ớt sau thu hoạch và cơ sở khoa học cho các nghiên cứu hoạt tính kháng nấm của chitosan và các dẫn xuất. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN NGHIÊN CỨU SINH PGS.TS. Trang Sĩ Trung PGS.TS. Vũ Ngọc Bội Lê Thanh Long xx