Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu chuyển gen cry8Db có tính kháng côn trùng vào cây mía

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:167

Thêm vào BST

Báo xấu

35
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của luận án nhằm đánh giá thiệt hại bọ hung gây ra trên mía và thử hoạt tính kháng ấu trùng loài bọ hung điển hình của Cry8Db tái tổ hợp. Thiết kế vector chuyển gen thực vật pCAMBIA1300 chứa gen chuyển cry8Db. Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro hiệu quả ở cây mía. Tối ƣu hóa quy trình chuyển gen in vitro và ex vitro thông qua A. tumefaciens

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu chuyển gen cry8Db có tính kháng côn trùng vào cây mía

VIỆ ỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHAN THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN cry8Db T TR V Y Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾ SĨ SI ỌC Người hướng dẫn khoa học: 1.TS. PHẠM BÍCH NGỌC i n C ng ngh sinh họ 2. PGS.TS. CHU HOÀNG HÀ i n C ng ngh sinh họ I - 2018
LỜI Đ Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; Phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả Phan Thị Thu Hiền i
LỜI CẢ Ơ Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Phạm Bích Ngọc và PGS.TS Chu Hoàng Hà đã tận tình hƣớng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, các cán bộ Phòng Quản lý tổng hợp, bộ phận Quản lý đào tạo sau đại học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án. Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh-KTNN, Phòng Tổ chức cán bộ, Phòng khoa học và công nghệ và Hợp tác quốc tế, phòng Sau Đại học, Phòng tài vụ trƣờng Đại học Sƣ Phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi về mọi mặt trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Lê Trần Bình, TS Đ Xuân Đồng, ThS Lê Thu Ngọc, ThS Hồ Th Thƣơng, ThS Nguy n Thu iang Phòng ông nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu để tôi hoàn thành đề tài này. Trong thời gian thực hiện đề tài, tôi cũng nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình của tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng ông nghệ ADN ứng dụng và Phòng Th nghiệm trọng điểm ông nghệ gen, Viện ông nghệ sinh học Tôi xin chân thành cảm ơn mọi ngƣời đã tận tình chỉ bảo trong suốt quá trình tôi thực hiện luận án. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, ngƣời thân, các đồng nghiệp, những ngƣời đã luôn động viên và góp ý cho tôi trong thời gian vừa qua. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Nghiên cứu sinh Phan Thị Thu Hiền ii
MỤC LỤC Ở ĐẦU .......................................................................................................... 1 1 T nh cấp thiết của đề tài ................................................................................ 1 2 Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2 3 Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2 4. Ý nghĩa lý luận và thực ti n .......................................................................... 3 5 Đóng góp mới của luận án ............................................................................ 3 ƯƠ 1: TỔ QU T I IỆU........................................................ 4 1.1. YM V N TR N H M .................................................. 4 1 1 1 Nguồn gốc và v tr phân loại .......................................................... 4 1 1 2 Đặc điểm hình thái, sinh thái và di truyền ...................................... 5 113 iá tr của cây m a và tình hình sản xuất m a đƣờng ..................... 7 1 1 4 Bọ hung hại m a và biện pháp phòng trừ ..................................... 10 1.2. ỨN N N N H S NH H TRON H NT O Y M B NĐ N ............................................................................. 13 1 2 1 Hệ thống nuôi cấy in vitro của cây m a ....................................... 13 122 ác nghiên cứu tạo cây m a chuyển gen ....................................... 21 1.3. C NH M N BACILLUS THURINGIENSIS (BT T N TR N ........................................................................................ 26 1 3 1 Nguồn gen kháng côn trùng của Bt ............................................... 26 132 ơ chế gây độc của các độc tố Bt lên sâu hại ............................... 27 1.3.3. Nhóm gen cry8 và đặc t nh kháng bọ hung gây hại cây trồng ..... 28 ƯƠ 2: VẬT IỆU V P ƯƠ P P IÊ ỨU ............. 36 2.1. VẬT L U N H ÊN ỨU ..................................................................... 36 211 ác giống m a ............................................................................... 36 2 1 2 Vector và chủng khuẩn ................................................................. 36 iii
213 ặp mồi sử dụng ........................................................................... 37 2.1.4. Hóa chất và thiết b máy móc ....................................................... 37 2 1 5 Đ a điểm và thời gian nghiên cứu ................................................. 37 2.2. PHƢƠN PH P N H ÊN ỨU............................................................ 38 2 2 1 Biểu hiện protein độc tố ry8 b trong vi khuẩn E.coli Rossetta amy- B và thử hoạt t nh kháng ấu trùng L. signata Fabricius ...................................................................................... 39 2 2 2 Thiết kế vector chuyển gen vào cây m a ....................................... 42 2 2 3 Thiết lập hệ thống tái sinh in vitro ở cây m a ............................... 43 2 2 4 Xây dựng và tối ƣu quy trình chuyển gen vào cây m a thông qua chuyển gen gus ..................................................................... 45 2.2.5. Phƣơng pháp tạo cây m a mang gen cry8Db thông qua A. tumefaciens................................................................................... 48 2 2 6 Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây chuyển gen bằng phản ứng P R .............................................................................. 48 2 2 7 Phân t ch sự t ch lũy protein ry8 b tái tổ hợp trong các dòng m a mang gen chuyển bằng kĩ thuật L S ............................... 48 2 2 8 Phƣơng pháp Western blot ............................................................ 49 2 2 9 Thử nghiệm sinh học đánh giá khả n ng kháng ấu trùng L. signata abricius của các dòng m a chuyển gen ........................ 49 CHƯƠ 3: ẾT QUẢ IÊ ỨU ................................................... 51 3.1. B ỂU H N PROT N ry8Db TRON V KHUẨN E.COLI ROSSETTA GAMY B VÀ THỬ HO T T NH T ẤU TRÙNG L. SIGNATA FABRICIUS ............................................................................ 51 3 1 1 Thiết kế vector biểu hiện p T -21a (+) mang gen cry8Db ........... 51 3 1 2 Biểu hiện gen cry8Db trong tế bào E.coli Rossetta Gamy B ....... 52 iv
3 1 3 Tối ƣu sự biểu hiện gen cry8Db trong vi khuẩn E.coli Rossetta gamy B .......................................................................................... 53 3.1.4. Tinh sạch và kiểm tra bằng Western Blot protein tái tổ hợp Cry8Db .......................................................................................... 54 3 1 5 Đánh giá tình hình phân bố của L. signata abricius thu đƣợc ở vùng nguyên liệu m a Sơn Nam, Tuyên Quang ........................ 56 3 1 6 Đánh giá hoạt lực kháng ấu trùng L. signata Fabricius của protein ry8 b tái tổ hợp ............................................................. 57 3.2 TH T K V TOR HUYỂN N cry8Db VÀO CÂY MÍA ........... 59 3 2 1 Thiết kế vector pB 121/35S/cry8 b/NOST ................................. 59 3 2 2 Thiết kế vector p MB 1300/ aMV35S/cry8 b/NOST ........ 61 3.3. TH T LẬP H THỐN TÁI SINH IN VITRO Ở YM ............... 63 3 3 1 Sự tái sinh in vitro qua chồi đỉnh .................................................. 63 3 3 2 Sự tái sinh in vitro qua chồi nách .................................................. 65 3 3 3 Sự tái sinh chồi in vitro trực tiếp từ cuộn lá non .......................... 67 3 3 4 Sự tái sinh chồi in vitro thông qua phôi soma cây m a ............. 72 3.4. TỐ ƢU QUY TR NH HUYỂN NV O YM ...................... 80 3 4 1 Quy trình chuyển gen gus in vitro vào cây mía ............................ 80 3 4 2 Quy trình chuyển gen gus ex vitro vào cây mía ............................ 86 3.5. Đ NH KHẢ NĂN KH N ẤU TR N B HUN Ủ ÒN M B ỂU H N N cry8Db ........................................ 91 3.5.1. Kết quả chuyển gen cry8Db vào cây m a trong điều kiện in vitro ...... 91 3.5.2. Kết quả chuyển gen cry8Db vào cây m a trong điều kiện ex vitro...... 96 3.5.3. Western blot .................................................................................. 99 3 5 4 Đánh giá khả n ng kháng ấu trùng L. signata abricius của các dòng m a chuyển gen .................................................................. 100 v
ƯƠ 4: B UẬ ẾT QUẢ ....................................................... 104 4.1. B ỂU H N PROT N ĐỘ TỐ Cry8Db TRONG E.COLI ROSETTA GAMY B VÀ THỬ HO T T NH KH N ẤU TRÙNG L. SIGNATA FABRICIUS .................................................... 104 4.2. X Y ỰN H THỐN T I SINH IN VITRO MÍA......................... 105 4.3. TỐ ƢU H H QUY TR NH HUYỂN N IN VITRO VÀ EX VITRO V O ỐN M RO 22 TH N QU V KHUẨN A. TUMEFACIENS .................................................................................... 111 4.4 T O ÒN M B ỂU H N PROT N Cry8Db THEO QUY TR NH HUYỂN N IN VITRO VÀ EX VITRO Đ ĐƢ TỐ ƢU HO ....................................................................................... 115 4.5. W ST RN BLOT V THỬ N H M S NH H Đ NH KHẢ NĂN KH N ẤU TR N L. SIGNATA BR US Ở ÒN M HUYỂN N cry8Db ......................................... 117 ẾT UẬ V IẾ Ị .................................................................... 119 ẾT UẬ .................................................................................................. 119 Ữ TRÌ Ủ T IẢ ĐÃ BỐ LIÊN QU ĐẾ ĐỀ T I ................................................................................... 120 T TẮT UẬ BẰ TIẾ ........................................... 121 T I IỆU T Ả .......................................................................... 134 PHỤ LỤC vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, chữ viết tắt ghĩa đầy đủ 2,4 –D 2,4 – Dichlorophenoxyacetic acid A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6 – Benzylaminopurine bp base pair Bt Bacillus thuringiensis Cry Crystal -endotoxin CTAB Hexadecyltrimethyl ammonium bromide Cyt Cytolysin dNTP Deoxyribo nucleotide triphotphate Đtg, et al., Đồng tác giả E.coli Escherichia coli ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay FAO Food and Agriculture Organization (Tổ chức Liên Hợp Quốc về lƣơng thực và nông nghiệp) GM Genetically Modified Gus β –Glucuronidase gene Ha Hecta HPR Horseradish Peroxidase IBA Indol -3- butyric acid CaMV35S Cauliflower Mosaic Virus IgG Immunoglobulin G IPTG sopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Kb Kilo base KDa Kilo Dalton Kinetin 6 – fufuryl amino purin Mg Miligam mg/L; mg/mL; ng/g Miligam/l t; miligam/mililit; nanogam/gam vii
Môi trƣờng LB Môi trƣờng Luria và Bertani MS Môi trƣờng theo Murashige và Skoog NAA α – Napthyl acetic acid NOS Nopaline synthase gene NST Nhi m sắc thể OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction PEG Polyethylene Glycol Picloram 4 – amino – 3,5,6 tricloro pyridine – 2- carboxylic acid RNase Ribonuclease scFv single-chain variable fragment S. barberi Saccharum barberi S. edule Saccharum edule S. ofﬁcinarum Saccharum ofﬁcinarum S. robustum Saccharum robustum S. sinense Saccharum sinense S. spontaneum Saccharum spontaneum SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TAE Tris Acetate EDTA Taq ADN polymerase Thermus aquaticus ADN polymerase TDZ Thidiazuron TMB 3,3‟, 5,5‟-Tetramethylbenzidine Vip Vegetative Insecticidal Protein X – gluc 5- bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide viii
DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Đặc điểm di truyền của các loài m a là tổ tiên của các giống m a thƣơng mại ngày nay ............................................................................. 7 Bảng 1.2: iện t ch, n ng suất, sản lƣợng của m a trên thế giới n m 2013, 2014 ...... 9 Bảng 1.3: Tình hình sản xuất m a ở Việt Nam n m 2009 – 2014 ....................... 10 Bảng 1.4: Một số công trình nghiên cứu tái sinh in vitro ở cây m a (2001 – 2015) ...... 19 Bảng 1.5: Một số kết quả tạo cây m a chuyển gen (1992 – 2015) ...................... 21 Bảng 2.1: ác cặp mồi đƣợc sử dụng trong nghiên cứu ...................................... 37 Bảng 3.1: ác đặc điểm của ấu trùng L. signata Fabricius thu thập đƣợc ở Sơn ƣơng, Tuyên Quang .................................................................. 57 Bảng 3.2: iá tr L 50 khi bổ sung protein ry8 b vào thức n của ấu trùng L. signata Fabricius (sau 14 ngày ...................................................... 58 Bảng 3.3: Khả n ng tái sinh và số chồi hình thành của các giống m a trên các môi trƣờng khác nhau từ chồi đỉnh ............................................... 64 Bảng 3.4: Khả n ng tái sinh và số chồi hình thành của các giống m a trên các môi trƣờng khác nhau từ chồi nách .............................................. 66 Bảng 3.5: Khả n ng tái sinh từ cuộn lá non và số chồi hình thành trung bình của các giống m a trên các môi trƣờng khác nhau .............................. 69 Bảng 3.6: Tỷ lệ tạo mô sẹo của 3 giống m a trên môi trƣờng MS có bổ sung 2,4 -D ......................................................................................... 72 Bảng 3.7: Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4– tới sự hình thành phôi soma từ mô sẹo của các giống m a sau 2 tuần nuôi cấy.......................................... 74 Bảng 3.8: Ảnh hƣởng của tổ hợp k ch th ch sinh trƣởng B P và kinetin đến tỷ lệ tái sinh tạo đa chồi từ phôi soma của các giống m a ................... 75 Bảng 3.9: Ảnh hƣởng của tổ hợp chất k ch th ch sinh trƣởng BAP và kinetin lên số lƣợng chồi hình thành (số chồi/0,5 g cụm phôi soma ch n của các giống m a ................................................................................ 76 Bảng 3.10: Ảnh hƣởng của N đến khả n ng ra r ............................................ 77 ix
Bảng 3.11: Khả n ng tái sinh từ cụm phôi soma giống m a RO 22 trên môi trƣờng tái sinh bổ sung hygromycin.................................................... 81 Bảng 3.12: Ảnh hƣởng của nồng độ hygromycin đến khả n ng tái sinh ex- vitro của giống m a RO 22 trong điều kiện tƣới................................ 86 Bảng 3.13: Ảnh hƣởng của nồng độ hygromycin đến khả n ng sống sót của giống m a RO 22 trong điều kiện phun ex vitro ................................ 87 Bảng 3.14: Hiệu quả chuyển gen trong điều kiện ex vitro thông qua A. tumefaciens giống m a RO 22 ........................................................... 89 Bảng 3.15: Kết quả chuyển cấu trúc p MB 1300/ aMV35S/cry8 b/NOST vào giống m a RO 22 thông qua A. tumefaciens trong điều kiện in vitro ............ 92 Bảng 3.16: Kết quả chuyển cấu trúc p MB 1300/ aMV35S/cry8 b/NOST vào giống m a RO 22 thông qua A. tumefaciens trong điều kiện ex vitro............ 96 Bảng 3.17: Đánh giá khả n ng tác động của m a chuyển gen biểu hiện protein ry8 b đến sự phát triển của ấu trùng (sau 14 ngày khảo sát ở nhà lƣới ............................................................................................ 103 x
DANH MỤC HÌNH Ả ĐỒ T Ị Hình 1.1: ác loài m a tổ tiên của các giống m a thƣơng mại ngày nay ............ 4 Hình 1.2: Sơ đồ hệ thống nuôi cấy in vitro ở m a ............................................. 15 Hình 1.3: Sự tái sinh trực tiếp các cơ quan của cây m a ................................... 16 Hình 1.4: Quá trình tái sinh in vitro thông qua phôi soma ở cây m a ............... 18 Hình 1.5: Mô hình phƣơng thức hoạt động của nội độc tố ry ........................ 28 Hình 1.6: Sơ đồ phát sinh chủng loại của protein ry8 đƣợc phân lập từ Bt chủng Q52-7 ...................................................................................... 31 Hình 1.7: ấu trúc 3- của protein có ba vùng độc của protein ry8 b ......... 33 nh 1.8: Hình thái loài L. signata abricius ở hai giai đoạn thu thập đƣợc ở vùng m a Sơn Nam, Sơn ƣơng, Tuyên Quang ............................ 35 Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát quá trình nghiên cứu ............................................... 38 Hình 3.1: Thiết kế vector biểu hiện p T -21a/cry8Db...................................... 51 Hình 3.2: Biểu hiện protein ry8 b tái tổ hợp ................................................. 52 Hình 3.3: Kết quả tối ƣu sự biểu hiện của protein ry8 b tái tổ hợp .............. 54 Hình 3.4: Đánh giá protein ry8 b tinh sạch bằng điện di S S-PAGE và Western blot ...................................................................................... 55 Hình 3.5: Khảo sát sơ bộ mức độ phá hại m a của ấu trùng L. signata Fabricius vùng nguyên liệu m a Sơn Nam, Sơn ƣơng, Tuyên Quang ................ 56 Hình 3.6: Ấu trùng L. signata Fabricius hại m a............................................... 57 Hình 3.7: Ấu trùng L. signata Fabricius chết sau 14 ngày cho n thức n nhân tạo có bổ sung protein ry8 b ................................................ 58 Hình 3.8: Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen p MB 1300/P- 35S/cry8Db/T-35S ............................................................................. 59 Hình 3.9: Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector pBI121/35S/cry8Db/NOST ................................................................. 60 Hình 3.10. Hình ảnh điện di kết quả thiết kế vector pCAMBIA1300/35S/cry8Db/NOST ................................................. 61 xi
Hình 3.11: Quá trình tái sinh chồi trực tiếp in vitro từ chồi đỉnh cây m a .......... 64 Hình 3.12: Quá trình tái sinh chồi in vitro trực tiếp từ chồi nách cây m a ......... 66 Hình 3.13: Quá trình tái sinh chồi in vitro trực tiếp từ cuộn lá non .................... 70 nh 3.14: Hiện tƣợng r mọc ƣu thế so với sự tái sinh chồi khi nuôi cấy mảnh cắt cuộn lá non ở m a ............................................................. 71 Hình 3.15: ác dạng mô sẹo khác nhau thu đƣợc sau khi nuôi cấy ................... 73 Hình 3.16: Tái sinh tạo đa chồi từ cụm phôi soma ............................................. 75 Hình 3.17: Kết quả tạo r cây m a in vitro .......................................................... 77 Hình 3.18: Tái sinh cây mía in vitro qua các giai đoạn khác nhau ..................... 79 Bảng 3.11: Khả n ng tái sinh từ cụm phôi soma giống m a RO 22 trên môi trƣờng tái sinh bổ sung hygromycin ................................................. 81 Hình 3.20: Biểu đồ phân t ch ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn (O 600 nm , nồng độ cetosyringone đến hiệu quả chuyển gen vào giống m a ROC22............................................................................................... 83 nh 3.21: Biểu đồ phân t ch ảnh hƣởng thời gian lây nhi m đến hiệu quả chuyển gen vào giống m a RO 22 ................................................... 84 Hình 3.22: Quá trình biểu hiện gen gus các giai đoạn tái sinh m a in vitro khác nhau .......................................................................................... 84 Hình 3.23: Sơ đồ các bƣớc chuyển gen in vitro vào giống m a RO 22 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ............................................................. 85 Hình 3.24: Quá trình chuyển gen gus trong điều kiện ex vitro thông qua A. tumefaciens ........................................................................................ 88 Hình 3.25: Kiểm tra cây chuyển gen gus ............................................................ 89 Hình 3.26: Sơ đồ các bƣớc chuyển gen ex vitro vào giống m a RO 22 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ................................................... 91 Hình 3.27: Quá trình tái sinh các dòng m a chuyển gen cry8Db thông qua A. tumefaciens trong điều kiện in vitro ............................................. 92 Hình 3.28: Hình ảnh điện di kiểm tra một số dòng m a chuyển gen cry8Db bằng kĩ thuật P R trên gel agarose 0,8%.......................................... 93 xii
Hình 3.29: Kết quả L S đ nh lƣợng tƣơng đối sự biểu hiện của protein ry8 b của các dòng m a chuyển gen trong điều kiện in vitro........ 95 Hình 3.30: ác dòng m a mang gen chuyển cry8Db trong điều kiện ex vitro trồng ở nhà lƣới ................................................................................. 96 Hình 3.31: Kết quả điện di sản phẩm P R kiểm tra sự có mặt của gen cry8Db các dòng m a chuyển gen trong điều kiện ex vitro............... 97 Hình 3.32: Kết quả L S đ nh lƣợng tƣơng đối sự biểu hiện của protein ry8 b của các dòng m a chuyển gen ex vitro ................................ 98 nh 3.33: Sự biểu hiện của protein ry8 b trong một số dòng m a chuyển gen ........................................................................................ 99 nh 3.34: Kết quả thử nghiệm sinh học kiểm tra tính kháng ấu trùng L. signata abricius của các dòng m a trong điều kiện nhà lƣới sau 14 ngày ............................................................................................ 101 nh 3.35: Biểu đồ đánh giá khả n ng kháng ấu trùng L. signata abricius của các dòng m a chuyển gen cry8Db (sau 14 ngày trong điều kiện nhà lƣới ............................................................... 102 xiii
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cây mía (Saccharum officinarum L.) là một trong những cây công nghiệp đƣợc trồng rộng rãi nhất trên thế giới (Dotaniya, Datta, 2014; Choudhary et al., 2017) đƣợc canh tác ở 109 quốc gia với diện tích 26,9 triệu ha, sản lƣợng đạt 1,91 tỷ tấn (Factfish, 2015) ây m a đƣợc sử dụng vào nhiều mục đ ch: cung cấp thực phẩm: sucrose, fructose, mật m a; làm sợi: cung cấp vật liệu cenlullose, thức n gia súc: lá, thân đã đƣợc ép đƣờng; tạo n ng lƣợng: n ng lƣợng sinh học tái tạo từ rỉ đƣờng…; công nghiệp hóa chất: ethanol sinh học, chất mùn (Dotaniya et al., 2016). Việc cải thiện các đặc t nh nông sinh học ở cây m a đã đƣợc nghiên cứu trong những n m qua nhằm t ng trữ lƣợng đƣờng, t ng khả n ng chống ch u các điều kiện stress nhƣ: hạn hán, ngập, mặn, kháng sâu hại, thuốc diệt cỏ, nấm gây bệnh… Tuy nhiên do một số đặc thù của cây m a nhƣ: k ch thƣớc hệ gen lớn (985 Mbp), bộ nhi m sắc thể phức tạp (2n 70-140 , và sự tƣơng tác phức tạp của cây mía với các điều kiện môi trƣờng (Zhang et al., 2012)… khiến cho thời gian để tạo ra một giống mía mới theo phƣơng pháp truyền thống lên tới 10-12 n m Kỹ thuật chuyển gen có thể xem là phƣơng pháp tối ƣu nhất để tạo ra giống mía mới trong thời gian ngắn nhất. ây m a đƣợc biết là vật chủ của hơn 1500 loài côn trùng và 80 bệnh hại, trong đó đặc biệt gây hại trên diện rộng và khó kiểm soát là các loài bọ cánh cứng (bọ hung, xén tóc , sâu đục thân, rệp nhƣng phần lớn chúng thƣờng b giới hạn bởi sự phân bố đ a lý. Tuy nhiên, hiện nay sự phát triển của du l ch, thƣơng mại giữa các nƣớc cùng với thay đổi điều kiện khí hậu làm t ng nguy cơ sâu bệnh hại xâm nhập và bùng phát trong nhiều hệ thống nông nghiệp, trong đó sâu bệnh gây hại trên mía ngày càng khó kiểm soát. Khả n ng th ch ứng của một số loài gây hại và xâm nhập vào các khu vực trồng mía rất nhanh, gây thiệt hại đặc biệt nghiêm trọng. ôn trùng bọ cánh cứng ảnh hƣởng xấu đến n ng suất cây mía vì chúng phá hoại m a ở giai đoạn ấu trùng và trƣởng thành Các nghiên cứu tạo cây chuyển gen biểu hiện protein độc tố diệt côn trùng gây hại của Bt đã phát triển trên khắp thế giới từ n m 1996. Việc tạo ra cây trồng biến đổi
2 gen là bƣớc đột phá nhằm: (i): giảm thiểu tác hại của thuốc trừ sâu hóa học, (ii): t ng cƣờng hiệu quả, t nh đặc hiệu trong diệt trừ sâu đ ch; (iii): giảm chi phí, ít ảnh hƣởng tới môi trƣờng, sức khỏe con ngƣời và các loài sinh vật khác (James, 2014). Ở Việt Nam, cây m a cũng là một trong số các cây trồng ch u sự phá hoại lớn từ côn trùng thuộc Bộ cánh cứng trong đó có họ bọ hung Scarabaeidae. Ấu trùng bọ hung thƣờng đục thân, phá hoại r , còn giai đoạn trƣởng thành chúng n các bộ phận nhƣ thân, lá cây m a Sự phá hại do bọ hung gây ra có thể làm chết cây hoặc giảm đáng kể n ng suất cây m a (Shu et al., 2009a). Kết quả nghiên cứu cho thấy, không có giống mía nào hệ gen tự nhiên mang gen biểu hiện t nh kháng côn trùng gây hại (James, 2014). Vì vậy, việc tạo giống m a chuyển gen có khả n ng kháng côn trùng nói chung và bọ hung nói riêng đang là vấn đề cấp thiết hiện nay Nhóm protein ry8 là một trong những nhóm protein độc tố Bt đƣợc mã hóa bởi các gen thuộc họ cry8 đã đƣợc chứng minh có độc t nh với ấu trùng của bọ cánh cứng trong đó có bọ hung (Zhang et al., 2013). ho đến nay, cây mía chuyển gen chủ yếu đƣợc tạo ra nhờ sử dụng hai phƣơng pháp ch nh là súng bắn gen và chuyển gen đ ch thông qua A. tumefaciens. Với điều kiện thực tế ở Việt Nam, sử dụng A. tumefaciens để chuyển gen thực vật là phƣơng pháp đơn giản và mang lại hiệu quả cao Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực ti n, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hu n g n r D t nh kháng n tr ng v o m ”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Tạo đƣợc các dòng m a chuyển gen cry8Db có hoạt t nh kháng ấu trùng bọ hung hại m a 3. Nội dung nghiên cứu 1. Đánh giá thiệt hại bọ hung gây ra trên mía và thử hoạt tính kháng ấu trùng loài bọ hung điển hình của Cry8Db tái tổ hợp. 2. Thiết kế vector chuyển gen thực vật pCAMBIA1300 chứa gen chuyển cry8Db. 3. Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro hiệu quả ở cây m a 4. Tối ƣu hóa quy trình chuyển gen in vitro và ex vitro thông qua A. tumefaciens. 5. Đánh giá khả n ng kháng ấu trùng bọ hung của các dòng mía biểu hiện gen cry8Db.
3 4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn Kết quả đạt đƣợc của luận án có giá tr khoa học và thực ti n trong tiếp cận nghiên cứu t ng cƣờng khả n ng kháng bọ hung hại m a bằng kỹ thuật chuyển gen thông qua A. tumefaciens. 4.1.Ý nghĩ lý luận Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu và thực nghiệm tạo giống mía kháng bọ hung bằng chuyển gen Bt. 4.2. Ý nghĩ thực tiễn 1. Tạo đƣợc protein tái tổ hợp Cry8Db quy mô phòng thí nghiệm thông qua vi khuẩn E.coli Rosetta - amy B, chứng minh đƣợc protein tinh sạch có khả n ng kháng ấu trùng Lepidiota signata abricius – một loài thuộc họ bọ hung hại m a thu đƣợc ở Sơn Nam, Sơn ƣơng, Tuyên Quang. 2. Tạo đƣợc các dòng mía chuyển gen cry8Db có khả n ng biểu hiện độc tố có tính kháng ấu trùng bọ hung thu thập đƣợc ở Sơn Nam, Sơn ƣơng, Tuyên Quang Kết quả này là cơ sở khoa học vững chắc cho hƣớng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm nâng cao khả n ng kháng côn trùng gây hại ở cây m a, mở ra triển vọng ứng dụng mới trong thực ti n tạo giống m a kháng côn trùng hại m a 5. Đóng góp mới của luận án 1. Đã chứng minh đƣợc protein ry8 b k ch thƣớc phân tử khoảng 73 K a có khả n ng diệt ấu trùng Lepidiota signata Fabricius ở các giai đoạn khác nhau. Đối với ấu trùng tuổi 1, nồng độ gây chết 50% số cá thể là LC50 = 183,5 ng/g, ấu trùng tuổi 2 LC50 = 270,8 ng/g và ấu trùng tuổi 3 nồng độ này ở ngƣỡng cao nhất với giá tr LC50 = 345,4 ng/g. 2. Đây là công trình đầu tiên sử dụng song song 2 quy trình chuyển gen vào cây m a (trong điều kiện in vitro và ex vitro để tạo ra các dòng mía chuyển gen cry8Db. ông trình đã tạo đƣợc 13 dòng m a chuyển gen cry8Db. Protein Cry8Db ở các dòng mía chuyển gen đã đƣợc kiểm tra bằng phản ứng ELISA cho thấy nồng độ protein tái tổ hợp ở các dòng mía chuyển gen dao động từ 1.62 - 21,73 ng/µg protein tổng số. Thử nghiệm sinh học cho thấy dòng m a chuyển gen S3 có khả n ng kháng ấu trùng Lepidiota signata abricius tốt nhất với tỷ lệ b phá hại thấp (12,91% , khối lƣợng ấu trùng b giảm 2,85 lần sau 14 ngày.
4 ƯƠ 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Y V TR ẠI 1.1.1. guồn gốc và vị trí phân loại Cây mía (Saccharum ofﬁcinarum Linn.) trồng hiện nay thuộc chi Saccharum, họ Gramineae, lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), ngành thực vật hạt kín (Magnoliophyta) (Đ N ng V nh, 2006). Việc phân loại cây mía gặp rất nhiều vấn đề phức tạp, vì ngoài chi Saccharum còn có các chi khác thuộc cùng một nhóm giao phấn gọi là „„phức hợp Saccharum” bao gồm: Erianthus, Ripidium, Miscanthus, Diandra, Narenga và Sclerostachya (Office of Gene Technology Regulator, 2011). Chi Saccharum gồm có sáu loài khác nhau: S. barberi L., S. edule L., S. ofﬁcinarum L., S. robustum L., S. sinense L., và S. spontaneum L. Trong số này, S. ofﬁcinarum L. (loài đƣợc thuần hóa để canh tác và cung cấp đƣờng) và S. spontaneum L. (loài hoang dại với bộ NST thể d bội đƣợc cho là tổ tiên của mía trồng ngày nay (Sandhu et al., 2012). Các giống m a thƣơng mại ngày nay là con lai giữa S. ofﬁcinarum L. (chiếm 80 – 90% hệ gen) và S. spontaneum L. (chiếm 10–20% hệ gen) (Hoarau et al., 2002) (Hình 1.1). Hình 1.1: C c loài mía tổ ti n của c c giống mía th ng mại ngày nay A: Loài S. ofﬁcinarum L.; B: loài S. spontaneum L. (Nguồn: Aditya, Jitendra, 2014)
5 Loài S. spontaneum L. đƣợc phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới đến cận nhiệt đới ở châu và châu Phi, có môi trƣờng sống đa dạng Đây là một loài trong tự nhiên có hình thái biến đổi, có thể rậm ngắn hoặc cao lớn (có thể cao tới 5 m Hầu hết loài S. spontaneum L có lá và cuống lá mỏng, hàm lƣợng đƣờng thấp, và tỷ lệ xơ cao (Aditya, Jitendra, 2014) ác ngành công nghiệp m a đƣờng trên thế giới đã thuần hóa và phát triển các giống m a thuộc loài S. ofﬁcinarum L , đặc trƣng của loài này là hàm lƣợng đƣờng cao, lƣợng xơ thấp, dày cuống và lá rộng và có nguồn gốc từ New uinea hoặc Melanesian (Grivet et al., 1996). 1.1.2. Đặc điểm h nh th i sinh th i và di truyền Đặc điểm hình thái M a là cây một lá mầm, thân thảo Thân m a là nguyên liệu chế biến đƣờng và làm giống cho vụ sau Trên biểu bì thân m a có chứa nhiều chlorophin và xantophin hợp thành màu sắc đặc trƣng của từng giống m a iữa các dóng thân là các đốt m a chứa bốn bộ phận gồm đai sinh trƣởng, r , chồi bên và sẹo lá Trên thân có các bẹ lá bao bọc, lá mọc thành hai hàng so le, đối nhau hoặc theo đƣờng vòng trên thân m a Là thực vật thuộc nhóm 4, lá m a dài 1-2 m, rộng 5 -7 cm (Taparia et al., 2012) Lá m a có hai bộ phận ch nh: phiến lá và bẹ lá h tiếp giáp giữa bẹ lá và phiến lá gọi là cổ lá, thƣờng thì khi cây phát triển đến lá thật thứ 12 -15, mới đạt đến độ to và chiều dài tiêu chuẩn tƣơng ứng với m i giống Ngoài ra, còn có lớp phấn và lông nơi bẹ lá M a thuộc loại r chùm R m a nói chung đƣợc chia thành hai loại: r sơ cấp và r thứ cấp R sơ cấp còn gọi là r tạm thời, là loại r mọc từ hom giống hoặc hạt giống, đây là loại r đƣờng k nh bé, phân nhánh nhiều, t n sâu, chỉ đảm bảo nuôi cây đến khoảng 4-7 tuần đầu R thứ cấp còn gọi là r vĩnh cửu, xuất hiện khi cây con có từ 3-5 lá thật Loại này tồn tại lâu hơn và n sâu hơn trong đất và có ba dạng (r hấp thu, r n sâu và r chống đổ , m i dạng có vai trò khác nhau trong việc cung cấp chất dinh dƣỡng và đảm bảo sự sinh tồn của cây m a khi có điều kiện bất lợi về thời tiết xảy ra (Trần V n Sỏi, 2003) Khi kết thúc thời kỳ sinh trƣởng, cây m a sẽ chuyển sang giai đoạn sinh thực (ra hoa Mầm hoa đƣợc hình thành từ đỉnh sinh trƣởng và đƣợc bao bọc bởi chiếc
6 lá cuối cùng của bộ lá (lá đòng Bông hoa m a gồm trục ch nh và các nhánh cấp 1, cấp 2, có chứa nhiều hoa nhỏ Hoa m a lƣỡng t nh, có ba nh đực và một bầu noãn, quá trình thụ tinh đƣợc tiến hành nhƣ cây thuộc họ Hòa thảo khác (lúa, ngô… Hạt m a rất bé, k ch thƣớc khoảng 1-1,25 mm, chỉ nặng 0,15 – 0,25 mg, hình thoi, bên trong có chứa albumin, tinh bột và phôi mầm Trong công tác cải tạo giống m a, lai hữu t nh là một phƣơng pháp truyền thống đã đƣợc áp dụng (Trần V n Sỏi, 2003 . Đặc điểm sinh thái M a thuộc nhóm thực vật 4 th ch nghi với kh hậu vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Nhiệt độ tối th ch cho phát triển của m a là từ 30-34o Nếu trên 38oC thì sự sinh trƣởng của m a b đình trệ vì quá trình đồng hóa cao hơn d hóa òn nhiệt độ thấp dƣới 0o kéo dài, cây m a sẽ b chết và đông nhựa Tuy nhiên, nhiệt độ tối th ch cho việc phát triển cây m a còn tùy thuộc vào từng giai đoạn phát triển và bản chất giống Trong thân cây m a, nƣớc chiếm tỷ lệ 70% Tùy từng thời kỳ sinh trƣởng, cây m a th ch nghi với độ ẩm nhất đ nh Thời kì đẻ nhánh, m a tiêu hao nƣớc nhiều hơn, độ ẩm th ch hợp tối đa trong đất là 55–70% Thời kì vƣơn lóng, cây m a đòi hỏi tiêu hao nƣớc nhiều nhất (60-80% Đến thời kỳ t ch lũy đƣờng, yêu cầu nƣớc giảm xuống và độ ẩm tối th ch trong đất chỉ còn 50-60%. Đất phù hợp để trồng m a là đất cát pha, đất th t nhẹ và trung bình, trong đất có chất hữu cơ, chất mùn Độ pH 5,5-7,5, không b nhi m mặn (Trần V n Sỏi, 2003 . Đặc điểm di truyền Bộ gen của cây m a hiện nay đƣợc cho là phức tạp nhất trong tất cả các loài cây trồng và đƣợc hình thành từ những loài đa bội thuộc chi m a Số lƣợng nhi m sắc thể của các loài m a hiện nay biến đổi từ 36 đến 200 (Office of Gene Technology Regulator, 2011) Trong khi đó, Zhang và đtg (2012 cho rằng hai loài S. ofﬁcinarum L có số lƣợng NST 2n 70–140 và S. spontaneum L có số lƣợng NST 2n 40–128 (Bảng 1 1 . Bộ nhi m sắc thể của các loài thuộc chi Saccharum không chỉ đa bội cùng loài autopolyploid (mang hơn hai bộ nhi m sắc thể đồng hợp từ một loài mà còn đa bội khác loài allopolyploid (mang hai hoặc hơn hai bộ nhi m sắc thể từ các loài khác nhau, vì vậy hệ gen m a rất phức tạp ây m a có bộ nhi m sắc thể