Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đánh giá đa dạng vi sinh vật, sàng lọc, thu nhận và xác định tính chất của cellulase suối nước nóng Bình Châu, Việt Nam bằng kỹ thuật Metagenomics

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:185

Thêm vào BST

Báo xấu

35
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài nghiên cứu nhằm thông qua kết quả giải trình tự DNA metagenome vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu bằng hệ thống giải trình tự gen thế hệ mới; đánh giá được nguồn đa dạng vi sinh vật ưa nhiệt và xây dựng được bộ dữ liệu các gen mã hóa cho cellulase; biểu hiện được các cellulase tái tổ hợp đồng thời; tinh sạch và xác định được tính chất của các cellulase tái tổ hợp này.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đánh giá đa dạng vi sinh vật, sàng lọc, thu nhận và xác định tính chất của cellulase suối nước nóng Bình Châu, Việt Nam bằng kỹ thuật Metagenomics

viÖn hµn l©m khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam viÖn c«ng nghÖ sinh häc TRẦN THANH THỦY NGHI£N CøU ®¸nh gi¸ ®a d¹ng vi sinh vËt, SµNG LäC, THU NHËN Vµ X¸C §ÞNH TÝNH CHÊT CñA CELLULASE SUèI N¦íC NãNG b×nh ch©u, VIÖT NAM b»ng kü thuËt metagenomicS luËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc Hµ néi - 2021
viÖn hµn l©m khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam viÖn c«ng nghÖ sinh häc TRẦN THANH THỦY NGHI£N CøU ®¸nh gi¸ ®a d¹ng vi sinh vËt, SµNG LäC, THU NHËN Vµ X¸C §ÞNH TÝNH CHÊT CñA CELLULASE SUèI N¦íC NãNG b×nh ch©u, VIÖT NAM b»ng kü thuËt metagenomicS Chuyªn ngµnh : Vi sinh vËt häc M· sè : 9 42 01 07 luËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Kim Thoa Viện Công nghệ sinh học 2. PGS. TS. Trần Đình Mấn Viện Công nghệ sinh học Hµ néi - 2021
LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Nguyễn Kim Thoa và PGS. TS. Trần Đình Mấn, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam – những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, phòng Công nghệ Vật liệu sinh học, các cán bộ tại cơ sở đào tạo thuộc Viện Công nghệ sinh học, phòng Hệ gen học chức năng thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất, máy móc, trang thiết bị cũng như các thủ tục cần thiết để tôi có thể hoàn thành luận án. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các đồng nghiệp tham gia đề tài ĐTĐLCN.15/14, các chú, anh, chị, em cán bộ phòng Công nghệ Vật liệu sinh học đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, những người thân đã luôn ở bên cạnh chia sẻ, động viên, khích lệ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi về mọi mặt để tôi có thể tập trung, yên tâm học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình. Hà Nội, ngày ... tháng ... năm 2021 Tác giả Trần Thanh Thủy i
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày … tháng … năm 2021 Tác giả Trần Thanh Thủy ii
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... i LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT....................................... vii DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................x DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ................................................................ xi MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3 1.1. Khu hệ vi sinh vật trong suối nước nóng....................................................3 1.2. Cellulase.........................................................................................................6 1.2.1. Phân loại .........................................................................................................6 1.2.2. Đặc điểm hóa sinh ..........................................................................................9 1.2.3. Ứng dụng công nghệ sinh học của cellulase ưa nhiệt ..................................21 1.3. Metagenomics trong nghiên cứu đa dạng vi sinh vật và khai thác các gen mới ........................................................................................................21 1.3.1. Các phương pháp khai thác gen mới bằng kỹ thuật Metagenomics .............22 1.3.2. Phương pháp đánh giá đa dạng vi sinh vật từ dữ liệu giải trình tự DNA metagenome .................................................................................................26 1.3.3. Ứng dụng kỹ thuật Metagenomics để đánh giá đa dạng vi sinh vật và khai thác các gen mã hóa cho enzyme mới ..............................................28 1.3.4. Tình hình ứng dụng metagenomics vào nghiên cứu đa dạng vi sinh vật và khai thác các gen mã hóa cho cellulase ở Việt Nam....................................32 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................35 2.1. Vật liệu .........................................................................................................35 2.1.1. Vi sinh vật.....................................................................................................35 iii
2.1.2. Vector ...........................................................................................................35 2.1.3. Cặp mồi sử dụng ...........................................................................................35 2.1.4. Gen nghiên cứu.............................................................................................36 2.1.5. Các hóa chất sử dụng ....................................................................................36 2.1.6. Môi trường nuôi cấy .....................................................................................36 2.2. Máy móc và thiết bị ....................................................................................36 2.3. Phương pháp nghiên cứu ...........................................................................36 2.3.1. Tách chiết DNA metagenome của mẫu suối nước nóng Bình Châu............36 2.3.2. Giải trình tự DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu .......................37 2.3.3. Các phương pháp tin sinh..............................................................................38 2.3.4. Khuếch đại gen endoglucanase_18736 và β-glucosidase_32768 ................40 2.3.5. Tạo vector biểu hiện pET-17b gắn các đoạn gen endoglucanase_18736/ β-glucosidase_32768 ....................................................................................41 2.3.6. Biến nạp vector biểu hiện pET-17b chứa các đoạn gen endoglucanase_18736/ β-glucosidase_32768 vào E. coli TOP10F’ bằng phương pháp xung điện ................................................................................42 2.3.7. Chọn lọc dòng E. coli mang vector pET17b-18736/ và pET17b-32768......43 2.3.8. Tạo chủng E. coli tái tổ hợp mang vector pET-17b_18736 và pET-17b_32768 ........................................................................................43 2.3.9. Biểu hiện gen denovogenes_18736 và denovogenes_32768 .......................44 2.3.10. Xác định trọng lượng sinh khối khô .............................................................44 2.3.11. Phương pháp thu nhận enzyme thô ..............................................................44 2.3.12. Phương pháp xác định hoạt tính endoglucanase ..........................................45 2.3.13. Phương pháp xác định hoạt tính -glucosidase ............................................45 iv
2.3.14. Ảnh hưởng của một số yếu tố lên mức độ biểu hiện endoglucanase_18736 và β-glucanase_32768 ..................................................................................46 2.3.15. Động thái sinh trưởng và sinh endoglucanase, β-glucosidase tái tổ hợp .....47 2.3.16. Tinh sạch endoglucanase và β-glucosidase tái tổ hợp ..................................47 2.3.17. Định lượng protein tổng số ...........................................................................48 2.3.18. Điện di protein SDS-PAGE ..........................................................................48 2.3.19. Kiểm tra hoạt tính endoglucanase bằng Zymogram (Điện di protein trên gel polyacrylamide có chứa cơ chất CMC) .................................................49 2.3.20. Kiểm tra hoạt tính β-glucosidase bằng Zymogram ......................................50 2.3.21. Nghiên cứu một số đặc tính của enzyme tái tổ hợp .....................................50 2.3.22. Xử lý thống kê ...............................................................................................51 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..............................................................52 3.1. Khai thác bộ dữ liệu giải trình tự DNA metagenome vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu, đánh giá đa dạng vi sinh vật và xây dựng bộ dữ liệu gen mã hóa cho cellulase ....................................52 3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA metagenome vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu ....................................................................................................52 3.1.2. Khai thác bộ dữ liệu DNA metagenome, đánh giá đa dạng vi sinh vật, xác định và tổng hợp gen mới mã hóa cho các enzyme thủy phân cellulose (enzyme chịu kiềm, chịu axit và chịu nhiệt) .................................54 3.2. Biểu hiện gen [denovogenes]_18736 và [denovogenes]_32768 ...............74 3.2.1. Thiết kế vector biểu hiện gen [denovogenes]_18736 và [denovogenes]_32768 trong E. coli .............................................................74 3.2.2. Lựa chọn một số điều kiện biểu hiện gen [denovogenes]_18736 và [denovogenes]_32768 trong E. coli .............................................................75 v
3.2.3. Động thái sinh trưởng và biểu hiện endoglucanase và β-glucosidase của chủng E. coli C43(DE3) tái tổ hợp ..............................................................82 3.3. Tinh sạch và xác định tính chất của các cellulase tái tổ hợp ..................83 3.3.1. Tinh sạch enzyme tái tổ hợp .........................................................................83 3.3.2. N g h i ê n c ứ u mộ t s ố đ ặ c t í n h c ủ a e n do g l u c a n a s e _ 1 8 7 3 6 v à β - g l u c o s i d a s e _ 3 27 6 8 t á i t ổ h ợ p ......................................................85 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................95 4.1. Đa dạng vi sinh vật và tiềm năng khai thác các gen mới mã hóa cho cellulase suối nước nóng Bình Châu thông qua cách tiếp cận không phụ thuộc vào nuôi cấy. .............................................................................95 4.1.1. Đa dạng vi sinh vật .......................................................................................95 4.1.2. Tiềm năng khai thác các gen mới mã hóa cho cellulase ..............................99 4.2. Mối liên hệ giữa mô hình cấu trúc với các đặc điểm của endoglucanase_18736 và β-glucosidase_32768 ......................................104 4.2.1. Phân tích các do main ch ức năng c ủa endoglucana se_18 736 và β-glucos idase _3 2768 .....................................................................104 4.2.2. Mô hình cấu trúc 3D của endoglucanase_18736 và β-glucosidase_32768 tái tổ hợp ....................................................................................................104 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................................111 NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI .........................................................................................................113 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH ......................................................114 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................122 PHỤ LỤC ...................................................................................................................1 vi
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt APS Ammonium persulfate Ammonium persulfate BGI Beijing Genomics Institute Viện nghiên cứu hệ gen Bắc Kinh BLAST Basic Local Alignment Công cụ tìm kiếm các trình tự tương Search Tool đồng trực tuyến của NCBI Bp Base pair Cặp base BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò CAZy Carbohydrate – Active Enzyme thủy phân carbohydrate enzymes CBMs hay Carbohydrate Binding Module/Vùng liên kết với CBD modules/Domains carbohydrate CD Catalytic domain Vùng xúc tác CEs Carbohydrate esterases Carbohydrate esterases CMC Carboxymethyl cellulose Carboxymethyl cellulose CSDL Cơ sở dữ liệu dH2O Deionized water Nước deion DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic DNSA 3,5-Dinitrosalicylic acid Axit 3,5-Dinitrosalicylic dNTP 2’ – deoxyribonucleoside 2’ – deoxyribonucleoside 5’ - 5’ – triphosphate triphosphate DPPE 1,2-bis 1,2-bis (diphenylphosphino) ethylene (diphenylphosphino) ethylene EBI European Bioinformatics Viện nghiên cứu tin sinh Châu Âu Institute EDTA Ethylene diamine tetra Axit ethylene diamine tetra acetic acetic acid vii
EMBL European Molecular Phòng thí nghiệm sinh học phân tử Biology Laboratory Châu Âu ExPASY Expert Protein Analysis Hệ thống chuyên phân tích protein System GH Glycoside hydrolase Họ enzyme thủy phân glycoside GTs Glycosyl transferases Glycosyl transferases HTS High throughput Giải trình tự thông lượng cao Sequencing IPTG Isopropyl β- D-1- Isopropyl β- D-1- thiogalactopyranoside thiogalactopyranoside Kb Kilo base Đơn vị đo kích thước của axit nucleic KDa Kilo Dalton Đơn vị đo kích thước protein KEGG Kyoto Encyclopedia of Cơ sở dữ liệu về gen và hệ gen Genes and Genomes Kyoto. Km Michaelis constants Hằng số Michaelis LB Luria-Bertani Môi trường Luria-Bertani (LB) MEGAN MEtaGenomic ANalyser Phần mềm phân tích trình tự đa hệ gen NB Nutrient broth Môi trường Nutrient broth (NB) NCBI National Center for Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh Biotechnology Information học quốc gia (Mỹ) NGS Next Generation Giải trình tự gen thế hệ mới Sequencing NR Non - Redundant Cơ sở dữ liệu chứa các trình tự không dư thừa của NCBI ORF Open Reading Frame Khung đọc mở PBS Phosphate – Buffered Đệm muối phosphate saline PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng trùng hợp chuỗi viii
PDB Protein Data Bank Ngân hàng dữ liệu protein PEG Polyethylen glycol Polyethylen glycol PLs Polysaccharide lyases Polysaccharide lyases pNPG p-nitrophenyl-β-d- p-nitrophenyl-β-d-glucopyranoside glucopyranoside SDS Sodium dodecyl sulphate Sodium dodecyl sulphate SDS - SDS – Polyacrylamide gel Điện di trên gel polyacrylamide PAGE electrophoresis Swiss-Prot Swiss Protein Cơ sở dữ liệu protein Thụy Sĩ TB Terrific Broth Môi trường Terrific broth (TB) TEMED N,N,N′,N′-Tetramethyl N,N,N′,N′-Tetramethyl ethylenediamine ethylenediamine Tm Temperature Melting Nhiệt độ nóng chảy Vmax Maximum Velocity Vận tốc tối đa Uniprot Universal Protein Resource Nguồn dữ liệu phổ biến về trình tự và chức năng của protein ix
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phân bố của cellulase vào các họ GH khác nhau ....................................8 Bảng 1.2. Ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính cellulase của vi sinh vật ở suối nước nóng ....................................................................................14 Bảng 1.3. Đặc điểm của cellulase bền nhiệt ..........................................................20 Bảng 1.4. Cellulase bền nhiệt từ metagenome của vi sinh vật ở suối nước nóng........31 Bảng 3.1. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA metagenome mẫu nước và mẫu bùn suối nước nóng Bình Châu .....................................................................54 Bảng 3.2. Kết quả tinh sạch dữ liệu giải trình tự DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu ...............................................................................................54 Bảng 3.3. Kết quả lắp ráp de novo metagenome suối nước nóng Bình Châu .......55 Bảng 3.4. Thống kê phân loại học DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu đã được chú giải .....................................................................................56 Bảng 3.5. Tỉ lệ các gen đã được phân loại thuộc các Ngành vi khuẩn ở suối nước nóng Bình Châu ................................................................58 Bảng 3.6. Tỉ lệ các gen đã được phân loại thuộc các Lớp vi khuẩn ở suối nước nóng Bình Châu ...............................................................................................59 Bảng 3.7. Tóm tắt kết quả chú giải gen dựa vào các cơ sở dữ liệu mở .................61 Bảng 3.8. Phân bố của các ORF mã hóa cho cellulase được dự đoán từ bộ dữ liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu.................................... 64 Bảng 3.9. Đặc điểm của 5 ORF mã hóa cho endoglucanase và β-glucosidase thỏa mãn các tiêu chí lựa chọn gen/protein mới....................................68 Bảng 3.10. Kết quả tinh sạch endoglucanase và β-glucosidase tái tổ hợp bằng cột IMAC-Ni2+.............................................................................................85 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ ion kim loại lên hoạt tính enzyme tái tổ hợp .....90 x
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Nguyên tắc hoạt động của cellulase thủy phân cellulose ........................7 Hình 1.2. Cấu trúc 3D của endoglucanase thuộc họ GH7 thu nhận từ nấm Trichoderma reesei ...................................................................10 Hình 1.3. Cấu trúc cellulosome của A. cellulolyticus ............................................11 Hình 1.4. Ba dạng tâm hoạt động của các họ GH .................................................11 Hình 1.5. Hai cơ chế xúc tác của GHsa .................................................................13 Hình 1.6. Các phương pháp chính để phát hiện gen mới bằng cách sử dụng Metagenomics........................................................................................22 Hình 1.7. Các bước chính xây dựng thư viện Metagenomic .................................24 Hình 1.8. Các bước phân tích tin sinh điển hình cho cơ sở dữ liệu Metagenomic .........................................................................................26 Hình 2.1. Quy trình xử lý, phân tích dữ liệu DNA metagenome và sàng lọc gen mã hóa cho enzyme thủy phân cellulose tiềm năng ..............................38 Hình 3.1. Các vị trí lấy mẫu nước và mẫu bùn của suối nước nóng Bình Châu ...53 Hình 3.2. DNA metagenome mẫu nước và bùn suối nước nóng Bình Châu ........53 Hình 3.3. Phân bố độ dài contig sau khi lắp ráp bằng phần mềm SOAPdenovo2 .......................................................................................55 Hình 3.4. Phân bố độ dài các gen được dự đoán từ bộ dữ liệu D N A m e t a g e n o m e s u ố i n ư ớ c n ó n g B ì n h C h â u ....................56 Hình 3.5. Biểu đồ biểu thị 8 nhóm chiếm ưu thế cho từng cấp độ phân loại (Ngành, Lớp, Bộ, Họ, Chi, Loài) vi sinh vật ở suối nước nóng Bình Châu .............................................................................................57 Hình 3.6. Phân bố các họ enzyme được tìm thấy trong bộ dữ liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu khi so sánh với cơ sở dữ liệu CAZy ................62 Hình 3.7. Phân bố các ORF thuộc họ enzyme GH tham gia chuyển hóa lignocellulose trong bộ dữ liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu ..............................................................................................63 xi
Hình 3.8. Cây phát sinh chủng loại Maximum likelihood của trình tự axit amin mã hóa cho cellulase từ bộ dữ liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu ..............................................................................................66 Hình 3.9. Dự đoán tính chất của các protein tham gia vào quá trình thủy phân cellulose được mã hóa bởi các gen trong bộ dữ liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu ......................................................................67 Hình 3.10. Kết quả phân tích vùng bảo thủ trên trình tự axit amin của endoglucanase_18736............................................................................71 Hình 3.11. Kết quả phân tích vùng bảo thủ trên trình tự axit amin của β-glucosidase_32768 ...........................................................................71 Hình 3.12. Mô hình cấu trúc protein 3D được xây dựng bằng phần mềm Swissmodel của ExPASy. a) Cấu trúc của endoglucanase_18736 dựa theo khuôn mô hình cấu trúc của cellulase Cel6 giả định (1up3.1.A); b) Cấu trúc khuôn cellulase Cel6 giả định (1up3.1.A) . .. 72 Hình 3.13. Mô hình cấu trúc protein 3D được xây dựng bằng phần mềm Swissmodel của ExPASy. a) Cấu trúc của β-glucosidase_32768 dựa theo khuôn mô hình cấu trúc β-glucosidase (1vff.1.A); b) Cấu trúc của β-glucosidase khuôn (1vff.1.A). .....................................................73 Hình 3.14. Điện di đồ sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pET17b mang các đoạn gen ngoại lai bằng hai enzyme giới hạn HindIII và NdeI ..............................75 Hình 3.15. Hoạt tính endoglucanase_18736 (A) và β-glucosidase_32768 (B) trong pha tan của các chủng tái tổ hợp ..............................................76 Hình 3.16. Ảnh hưởng của chủng chủ lên quá trình sinh trưởng và biểu hiện enzyme tái tổ hợp ..................................................................................76 Hình 3.17. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sinh trưởng và sinh hoạt tính enzyme ở chủng E. coli C43(DE3) tái tổ hợp .......................................77 Hình 3.18. Ảnh hưởng độ thoáng khí lên sinh trưởng và sinh hoạt tính endoglucanase của chủng E. coli C43(DE3) tái tổ hợp .........................79 Hình 3.19. Ảnh hưởng độ thoáng khí lên sinh trưởng và sinh hoạt tính β-glucosidase của chủng E. coli C43(DE3) tái tổ hợp ............79 xii
Hình 3.20. Ảnh hưởng nồng độ IPTG cảm ứng lên sinh trưởng và biểu hiện endoglucanase_18736 của chủng tái tổ hợp ..........................................81 Hình 3.21. Ảnh hưởng nồng độ IPTG cảm ứng lên sinh trưởng và biểu hiện β-glucosidase của chủng E. coli C43(DE3) tái tổ hợp......................81 Hình 3.22. Động thái sinh trưởng và sinh endoglucanase của chủng E. coli C43(DE3) tái tổ hợp .................................................................................................82 Hình 3.23. Động thái sinh trưởng và sinh β-glucosidase của chủng E. coli C43(DE3) tái tổ hợp .................................................................................................83 Hình 3.24. Điện di đồ SDS-PAGE (a) và Zymogram (b) của endoglucanase tái tổ hợp ...............................................................................................84 Hình 3.25. Điện di đồ SDS-PAGE (a) và Zymogram (b) của β-glucosidase tái tổ hợp ...............................................................................................84 Hình 3.26. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme tái tổ hợp......................86 Hình 3.27. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính endoglucanase tái tổ hợp ..................87 Hình 3.28. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính β-glucosidase tái tổ hợp ....................87 Hình 3.29. Ảnh hưởng của một số ion kim loại lên hoạt tính endoglucanase_18736 ..........................................................................88 Hình 3.30. Ảnh hưởng của một số ion kim loại lên hoạt tính β- glucosidase_32768 ................................................................................88 Hình 3.31. Độ bền nhiệt của endoglucanase_18736 được khảo sát tại giá trị Topt và pHopt ..................................................................................................91 Hình 3.32. Độ bền nhiệt của β-glucosidase_32768 được khảo sát tại giá trị Topt và pHopt ..................................................................................................92 Hình 3.33. Khả năng thủy phân một số loại cơ chất của endoglucanase_18736 và β-glucosidase_32768 ..............................93 Hình 3.34. Động học enzyme tái tổ hợp ..................................................................94 xiii
1 MỞ ĐẦU Cellulase là nhóm enzyme thủy phân các liên kết β-1,4-glucoside trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tương tự khác. Cellulase được tổng hợp bởi cổ khuẩn, vi khuẩn, nấm mốc, động vật nguyên sinh, thực vật và động vật. Enzyme này được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, lên men rượu, thức ăn gia súc, dệt may, giặt ủi, trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy,... Khi nguồn nguyên liệu hóa thạch dần cạn kiệt thì nhu cầu sử dụng các nguồn năng lượng thay thế, có thể tái tạo và thân thiện với môi trường ngày càng tăng. Một trong những nguồn năng lượng thay thế được quan tâm nhất hiện nay là nhiên liệu sinh học từ sinh khối lignocellulose. Quá trình chuyển hóa lignocellulose thành các sản phẩm có giá trị như nhiên liệu sinh học, nhựa sinh học, axit hữu cơ và các cụm hóa chất kiến tạo khác thường được thực hiện ở các điều kiện đặc biệt như ở nhiệt độ cao, tiền xử lý bằng kiềm hoặc axit hoặc trong dung môi hữu cơ… Do đó đòi hỏi các nhà khoa học phải nghiên cứu tìm kiếm các cellulase mang những đặc tính mới (như bền với nhiệt độ cao, chịu được áp suất cao, chịu được pH axit/kiềm, dung môi …) để đáp ứng được các yêu cầu của quá trình chuyển hóa lignocellulose và hạ được giá thành sản xuất. Một trong những nguồn địa nhiệt có thể thu nhận cellulase bền nhiệt là nhóm vi sinh vật ưa nhiệt ở suối nước nóng. Tuy nhiên, sử dụng các phương pháp phân lập, nuôi cấy vi sinh vật truyền thống không thể khai thác hết được tiềm năng của vật liệu di truyền trong hệ sinh thái này vì có tới 99% các loài vi sinh vật sống trong môi trường là các loài không nuôi cấy được. Hơn nữa, do đặc tính riêng của hệ sinh thái suối nước nóng có mật độ vi sinh vật thấp hơn rất nhiều so với các môi trường bình thường khác, vì vậy việc thu nhận được các loài vi sinh vật mới để khai thác nguồn gen của chúng bằng phương pháp nuôi cấy thông thường gặp nhiều khó khăn. Ngày nay, nhờ sự tiến bộ của công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới, việc tách dòng các gen mới có thể được thực hiện bằng cách tiếp cận cơ sở dữ liệu metagenome kết hợp với các phần mềm tin sinh để dự đoán tính chất của protein tiềm năng trước khi biểu hiện và nghiên cứu đặc tính của enzyme tái tổ hợp. Thông qua cách tiếp cận
2 này, các nhà nghiên cứu không chỉ đánh giá được mức độ đa dạng vi sinh vật ở trong một hệ sinh thái mà còn bảo tồn và khai thác được các gen mới hoặc các protein có tính chất đặc biệt từ các vi sinh vật đó. Với mong muốn có thể đánh giá đa dạng vi sinh vật, đồng thời tiếp cận và khai thác được nguồn cellulase bền nhiệt mới từ suối nước nóng Bình Châu - suối nước nóng có nhiệt độ cao thứ hai ở Việt Nam không thông qua nuôi cấy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu, thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đánh giá đa dạng vi sinh vật, sàng lọc, thu nhận và xác định tính chất của cellulase suối nước nóng Bình Châu, Việt Nam bằng kỹ thuật Metagenomics”. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Thông qua kết quả giải trình tự DNA metagenome vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu bằng hệ thống giải trình tự gen thế hệ mới, (i) Đánh giá được nguồn đa dạng vi sinh vật ưa nhiệt và xây dựng được bộ dữ liệu các gen mã hóa cho cellulase; ii) Biểu hiện được các cellulase tái tổ hợp đồng thời (iii) Tinh sạch và xác định được tính chất của các cellulase tái tổ hợp này. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Khai thác bộ dữ liệu giải trình tự DNA metagenome vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu, đánh giá đa dạng vi sinh vật và xây dựng bộ dữ liệu các gen mã hóa cho cellulase. - Biểu hiện gen mới mã hóa cho cellulase (endoglucanase và β-glucosidase) chịu nhiệt tiềm năng được lựa chọn từ bộ dữ liệu DNA metagenome. - Tinh sạch và xác định tính chất của các cellulase tái tổ hợp. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Đã xây dựng được bộ dữ liệu DNA metagenome của vi khuẩn và cổ khuẩn suối nước nóng Bình Châu với kích thước 9,4 Gb độ bao phủ trên 60%. Qua phân tích đã xác định được đa dạng vi sinh vật và gen mã hóa enzyme thủy phân cellulose, lựa chọn được hai gen mới (có độ tương đồng thấp 50,35% và 53,94%) mã hóa cho hai enzyme tương ứng là endoglucanase và beta-glucosidase. - Đã biểu hiện, tinh sạch và nghiên cứu tính chất sinh học của endoglucanase và beta-glucosidase. Đã xác định được Vmax và Km của hai enzyme này.
3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khu hệ vi sinh vật trong suối nước nóng Suối nước nóng đã được nghiên cứu từ thế kỷ XIX. Các nghiên cứu đầu tiên về suối nước nóng chỉ tập trung vào nghiên cứu tính chất hóa lý và đặc điểm địa chất, còn nghiên cứu về vi sinh vật sống trong hệ sinh thái này chỉ mới bắt đầu vào giữa thế kỷ XX (Marsh và Larsen, 1953). Nhiệt độ trong suối nước nóng thường vượt quá giới hạn phát triển của sinh vật nhân thật. Do đó, vi sinh vật trong hệ sinh thái này chủ yếu là nhóm vi khuẩn, cổ khuẩn và virus (López-López và cs., 2013). Vi sinh vật sống ở nhiệt độ cao được phân vào hai nhóm chính là vi sinh vật ưa nhiệt - thermophiles (nhiệt độ sinh trưởng tối ưu > 50ºC) và vi sinh vật siêu ưa nhiệt - hyperthermophiles (nhiệt độ sinh trưởng tối ưu > 80ºC). Các vi sinh vật này đóng vai trò trung tâm trong chu trình phân hủy các hợp chất hữu cơ và chu trình hóa sinh địa (Merino và cs., 2019). Vi sinh vật trong suối nước nóng thường không đa dạng và phong phú bằng các môi trường thủy vực khác. Để nghiên cứu khu hệ vi sinh vật trong suối nước nóng, các nhà khoa học có thể tiếp cận bằng phương pháp nuôi cấy và/ hoặc không thông qua nuôi cấy. Sử dụng phương pháp nuôi cấy, nhiều loài vi khuẩn và cổ khuẩn đã được phân lập từ các suối nước nóng khác nhau trên thế giới. Từ các suối nước nóng nằm trong công viên quốc gia Yellowstone (Mỹ), các nhà khoa học đã phân lập được nhiều loài vi khuẩn và cổ khuẩn: Achnanthes exigua, Archaeoglobus spp, Bacillus coagulans, Clostridium thermoautotrophicum, Sulfolobus acidocaldarius, Thermoleophilum album, Thiobacillus thiooxidans (Resources, 1997). Đây là các loài có nhiệt độ sinh trưởng cao hoặc cực cao. Sử dụng phương pháp này, nhiều loài vi khuẩn và cổ khuẩn mới cũng đã được phát hiện như Caldivirga maquilingensis gen. nov., sp. nov đã được phân lập từ suối nước nóng ở Phillipines (Itoh và cs., 1999); Vulcanisaeta distribute gen. nov., sp. nov. và Vulcanisaeta souniana sp. nov. đã được tìm thấy trong suối nước nóng ở Nhật Bản (Itoh và cs., 2002); Fervidicoccus fontis gen. nov., sp. nov. đã được thu nhận ở suối nước nóng tại vùng Kamchatka Peninsula, Nga (Perevalova và cs., 2010).
4 Mặc dù nhiều chủng, loài vi sinh vật khác nhau từ các suối nước nóng trên Thế giới đã được phân lập và phân loại, nhưng số lượng những loài chưa thể phân lập được vẫn còn rất lớn, do đó không thể tiếp cận được các vi sinh vật bản địa, nắm bắt được vai trò của chúng trong các chu trình chuyển hóa vật chất cũng như thu nhận được các chất có hoạt tính sinh học từ hệ sinh thái này. Sự ra đời của máy giải trình tự gen thế hệ mới được đánh giá là một công nghệ tiên tiến của ngành công nghệ sinh học, khi kết hợp với các công cụ tin sinh sẽ tạo thành kỹ thuật Metagenomic (kỹ thuật phân tích hệ gen môi trường), cho phép các nhà khoa học có điều kiện tiếp cận, bảo tồn và khai thác nguồn vi sinh vật một cách đầy đủ và toàn diện hơn. Hiệu quả của phương pháp này đã được chứng minh rõ rệt khi phân tích về số lượng, thành phần chủng loại của quần xã vi khuẩn trong suối nước nóng Comano Terme (Ý) so với phương pháp nuôi cấy thông thường (Pedron và cs., 2019). Kết quả đánh giá đa dạng không thông qua nuôi cấy có thể bao phủ toàn bộ số liệu về chủng loại vi khuẩn phân lập được, do vậy bức tranh về quần xã vi sinh vật trong các hệ sinh thái suối nước nóng trở lên phong phú và đa dạng hơn. Trong các nghiên cứu trước đây, hầu hết các vi khuẩn phân lập được từ suối nước nóng Ma'in và Afra ở Jordanian thuộc chi Bacillus, Geobacillus và Anoxybacillus (Malkawi và Al-Omari, 2010; Al-Batayneh và cs., 2011), tuy nhiên sử dụng kỹ thuật Metagenomics cho thấy vi sinh vật trong hai suối nước nóng này đa dạng hơn rất nhiều với sự có mặt của các loài thuộc ngành Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Deinococcus, Verrucomicrobia, Planctomycetes và Chloroflexi (Hussein và cs., 2017). Sự phân bố và thành phần vi sinh vật trong mỗi suối nước nóng mang các đặc trưng riêng biệt, thường bị tác động bởi các yếu tố như nhiệt độ, thành phần hóa học và pH của suối nước nóng (López-López và cs., 2013). Nhiệt độ được coi là yếu tố chính ảnh hưởng đến số lượng và thành phần của quần xã vi sinh vật ở các vị trí khác nhau trong suối nước nóng. Nhiệt độ trong suối nước nóng giới hạn sự sống sót của các sinh vật nhân thật (nhiệt độ giới hạn của chúng thường < 60ºC) và các sinh vật quang hợp (70°C). Ví dụ quần thể vi sinh vật ở suối nước nóng ven biển Iceland chịu tác động mạnh mẽ của sự thay đổi nhiệt độ và độ mặn do ảnh hưởng của thủy triều cao định kỳ. Nhóm vi khuẩn siêu ưa nhiệt chiếm ưu thế tại các vị trí có thời gian nóng
5 kéo dài nhất, trong khi nhóm vi sinh vật ưa nhiệt vừa phải, các vi sinh vật biển, các Proteobacteria ưa ấm được tìm thấy ở các khu vực có thời gian nóng ngắn nhất (Hobel và cs., 2005). Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phân bố vi sinh vật dọc theo dòng chảy của suối nước nóng Octopus (suối nước nóng kiềm với pH=8,5, có nồng độ sulfide thấp) nằm trong công viên quốc gia Yellowstone cũng được nghiên cứu. Ở vị trí cách miệng giếng phun 2 m có nhiệt độ khoảng 88°C chỉ tìm thấy các loài vi khuẩn thuộc chi Aquifex - tế bào có màu tím hồng, hóa tự dưỡng vô cơ. Dọc theo dòng chảy, càng ra xa miệng giếng phun, nhiệt độ càng giảm. Ở nhiệt độ khoảng 45-72oC, các loài vi khuẩn lam Cyanobacteria phát triển tạo thành các đám trên mặt nước. Trong số các chi vi khuẩn lam, Synechococcus có khả năng chịu nhiệt cao nhất (~ 72oC) tạo thành quần thể bên trên che phủ cho tầng dưới là quần thể của chi Chloroflexus - một loại vi khuẩn lam màu xanh lá cây, quang hợp không thải khí oxy. Ngoài ra, các chi vi khuẩn lam khác như Phormidium và Calothrix cũng được tìm thấy trong dòng chảy của suối nước nóng Octopus ở các vị trí có nhiệt độ thấp hơn (Rothschild và Mancinelli, 2001). Ngoài yếu tố nhiệt độ, cấu trúc các quần xã vi sinh vật suối nước nóng có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác như đặc điểm địa hóa, hoặc sự kết hợp giữa hai yếu tố nhiệt độ và pH. Ngoài các yếu tố nhiệt độ, thành phần hóa học, pH, quần xã vi sinh vật trong suối nước nóng còn có thể chịu sự tác động của khoảng cách địa lý. Một số loài vi sinh vật có thể có mặt ở tất cả các suối nước nóng. Tuy nhiên, bên cạnh đó cũng có những loài được cho là đặc hữu của một khu vực suối nước nóng. Vai trò của khoảng cách địa lý còn gây tranh cãi, nhưng có thể là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quần thể xạ khuẩn và vi khuẩn lam theo một số nghiên cứu nhưng không đại diện cho các quần thể vi sinh vật khác (Valverde và cs., 2012; López-López và cs., 2013). Mỗi suối nước nóng thường đặc trưng bởi một vài nhóm vi sinh vật chiếm ưu thế. Các nghiên cứu từ trước cho đến nay đều thấy Proteobacteria là ngành chiếm ưu thế trong các suối nước nóng ở Châu Phi (Tekere và cs., 2011), trong khi đó nhóm cổ khuẩn thuộc bộ Thermoplasmatales (chiếm 39%) thuộc ngành Euryarchaeota, và một nhóm cổ khuẩn khác (chiếm 33%) thuộc ngành Crenarchaeota lại là các nhóm ưu thế trong hệ sinh thái nước ngầm ở những vùng địa nhiệt ở Nga. Cả hai ngành này đều là