Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo, nhân phôi vô tính và rễ bất định cây ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla Lour. Harms)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:171

Thêm vào BST

Báo xấu

22
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Sinh học "Nghiên cứu tạo, nhân phôi vô tính và rễ bất định cây ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla Lour. Harms)" trình bày các nội dung chính sau: Tạo được phôi vô tính tái sinh trực tiếp, gián tiếp và nhân được phôi vô tính trên môi trường đặc và trong môi trường lỏng lắc. Tạo được rễ bất định tái sinh trực tiếp và nhân được rễ bất định trong môi trường lỏng lắc.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo, nhân phôi vô tính và rễ bất định cây ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla Lour. Harms)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ------------------------------- HUỲNH THỊ LŨY NGHIÊN CỨU TẠO, NHÂN PHÔI VÔ TÍNH VÀ RỄ BẤT ĐỊNH CÂY NGŨ GIA BÌ CHÂN CHIM (Schefflera octophylla Lour. Harms) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ------------------------------ HUỲNH THỊ LŨY NGHIÊN CỨU TẠO, NHÂN PHÔI VÔ TÍNH VÀ RỄ BẤT ĐỊNH CÂY NGŨ GIA BÌ CHÂN CHIM (Schefflera octophylla Lour. Harms) Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Mã số: 9 42 01 12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. Nguyễn Hữu Hổ 2. PGS.TS. Bùi Văn Lệ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2022
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án: “Nghiên cứu tạo, nhân phôi vô tính và rễ bất định cây Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla Lour. Harms)” là công trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hữu Hổ và PGS.TS. Bùi Văn Lệ. Nội dung nghiên cứu và các kết quả trong đề tài này hoàn toàn trung thực. Toàn bộ số liệu và kết quả nghiên cứu chưa từng được sử dụng để công bố trong các công trình nghiên cứu để nhận học vị, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được trích dẫn nguồn gốc rõ ràng. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về sự cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 05 năm 2022 Tác giả Huỳnh Thị Lũy
ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến PGS.TS. Bùi Văn Lệ và đặc biệt TS. Nguyễn Hữu Hổ, là những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ, truyền đạt những kiến thức quý báu để tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Phòng Đào tạo, Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Sinh học nhiệt đới đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và thực hiện nghiên cứu đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Sở Giáo dục và Đào tạo Phú Yên, Trường THPT chuyên Lương Văn Chánh Phú Yên, đã tạo điều kiện cho tôi học tập, nghiên cứu. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các anh chị em của phòng Công nghệ gen – Viện Sinh học nhiệt đới, đã rất tận tình tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất cũng như thời gian quý báu để tôi thực hiện nghiên cứu đề tài. Sự quan tâm và động viên của các Thầy Cô, anh chị em của Viện Sinh học nhiệt đới là động lực lớn cho tôi thực hiện đề tài nghiên cứu. Chân thành cảm ơn! Tp. Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 05 năm 2022 Tác giả Huỳnh Thị Lũy
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................... vii DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................ ix DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ ......................................................................... xi TÓM TẮT .................................................................................................................xv SUMMARY ........................................................................................................... xvii MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 1. Tính cấp thiết của đề tài ..........................................................................................1 2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................................2 2.1. Mục tiêu tổng quát .......................................................................................................... 2 2.2. Mục tiêu cụ thể ............................................................................................................... 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................................3 3.1. Ý nghĩa khoa học ............................................................................................................ 3 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................................................. 3 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ...........................................................................3 4.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................................... 3 4.2. Phạm vi nghiên cứu ........................................................................................................ 3 5. Tính mới của đề tài..................................................................................................4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................5 1.1. Giới thiệu về Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla Lour. Harms) ..........5 1.1.1. Nguồn gốc và phân bố ................................................................................................. 5 1.1.2. Đặc điểm sinh học – sinh thái ...................................................................................... 6 1.1.3. Thành phần hóa học và công dụng .............................................................................. 7 1.1.3.1. Thành phần hóa học .................................................................................................. 7 1.1.3.2. Công dụng ............................................................................................................... 10 1.2. Tình hình nghiên cứu về phôi vô tính, rễ bất định ở một số loài thuộc các chi quan trọng ở họ Ngũ gia bì (Araliaceae) ...................................................................11 1.2.1. Chi Panax .................................................................................................................. 11 1.2.1.1. Phôi vô tính ............................................................................................................. 11 1.2.1.2. Rễ bất định .............................................................................................................. 14 1.2.2. Chi Acanthopanax...................................................................................................... 15 1.2.2.1. Phôi vô tính ............................................................................................................. 15 1.2.2.2. Rễ bất định .............................................................................................................. 16 1.2.3. Chi Polyscias ............................................................................................................. 17 1.2.4. Chi Schefflera ............................................................................................................ 18 1.2.4.1. Schefflera octophylla (Lour.) Harms ...................................................................... 18
iv 1.2.4.2. Schefflera arboricola (Hayata) Merr. ..................................................................... 18 1.2.4.3. Schefflera leucantha Viguier .................................................................................19` 1.2.4.4. Didymopanax morototoni (Aublet) Decaisne et Planchon. .................................... 19 1.3. Sự phát sinh phôi vô tính ...................................................................................20 1.3.1. Cơ sở khoa học của sự phát sinh phôi vô tính ........................................................... 20 1.3.2. Một số nghiên cứu về sự phát sinh phôi vô tính ........................................................ 22 1.4. Sự hình thành rễ bất định .............................................................................................. 29 1.4.1. Cơ sở khoa học của sự hình thành rễ bất định ........................................................... 29 1.4.2. Một số nghiên cứu về sự hình thành rễ bất định ........................................................ 31 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ......................................................35 2.1. Nguồn mẫu – Vật liệu nuôi cấy .................................................................................... 35 2.1.1. Nguồn mẫu ......................................................................................................35 2.1.2. Tạo vật liệu nuôi cấy ban đầu .........................................................................35 2.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................................... 36 2.2.1. Nội dung 1. Tạo phôi vô tính ..........................................................................36 2.2.2. Nội dung 2. Nhân phôi vô tính ........................................................................36 2.2.3. Nội dung 3. Tạo rễ bất định ............................................................................36 2.2.4. Nội dung 4. Nhân rễ bất định ..........................................................................36 2.3. Nội dung 1. Tạo phôi vô tính .............................................................................39 2.3.1. Tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá ............................................................................ 39 2.3.1.1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá ................................................................................................................................ 39 2.3.1.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp auxin và BA đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá ........... 39 2.3.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá .................................................................................................................................... 40 2.3.1.4. Ảnh hưởng của nước dừa đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá.................................. 40 2.3.1.5. Tạo cây con in vitro hoàn chỉnh từ phôi vô tính ..................................................... 40 2.3.1.6. Trồng cây con ở chậu đất ........................................................................................ 41 2.3.2. Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo từ nuôi cấy mô lá .......................................... 41 2.3.2.1. Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá (10 x 10 mm) ............................... 41 2.3.2.2. Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá (3 x 10 mm) ................................. 43 2.4. Nội dung 2. Nhân phôi vô tính ...........................................................................44 2.4.1. Nhân phôi trên môi trường đặc .......................................................................44 2.4.2. Nhân phôi trong môi trường lỏng .............................................................................. 44 2.4.2.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự tạo phôi thứ cấp qua nuôi lỏng lắc ............................................................................................................................................. 44 2.4.2.2. Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối phôi ....... 45 2.4.2.3. Ảnh hưởng của kích thước phôi nuôi cấy đến sự tạo phôi thứ cấp ......................... 45
v 2.4.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối phôi ....................... 45 2.4.2.5. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi.................. 45 2.4.2.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi thứ cấp ......................................... 46 2.4.2.7. Tạo cây con từ phôi nuôi lỏng lắc........................................................................... 46 2.4.3. Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi sơ cấp và thứ cấp ................................................... 46 2.4.4. Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp xác định ......................................................... 46 2.5. Nội dung 3. Tạo rễ bất định .......................................................................................... 46 2.5.1. Tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá .............................................................................. 46 2.5.1.1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá .................................................................................................................. 46 2.5.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá .............. 47 2.5.1.3. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá ...... 47 2.5.1.4. Khảo sát hình thái giải phẫu rễ tái sinh trực tiếp từ mô lá ...................................... 48 2.5.2. Tạo rễ bất định từ chồi ............................................................................................... 48 2.5.2.1. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc từ đốt thân cây vườn ươm ........................... 48 2.5.2.2. Tạo rễ bất định từ chồi đốt thân cây in vitro ........................................................... 49 2.5.2.3. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc phôi vô tính ................................................. 49 2.6. Nội dung 4. Nhân rễ bất định trong môi trường lỏng ........................................50 2.6.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự phân nhánh của rễ ....................... 50 2.6.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối rễ .............................. 50 2.6.3. Ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối rễ .................. 50 2.6.4. Khảo sát diễn biến tăng trưởng sinh khối rễ theo thời gian ....................................... 50 2.7. Điều kiện nuôi cấy in vitro ........................................................................................... 51 2.8. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu ......................................................................... 51 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................52 3.1. Tạo phôi vô tính .................................................................................................52 3.1.1. Tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá ............................................................................ 52 3.1.1.1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá .................................................................................................................. 52 3.1.1.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp NAA và BA đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá ............................................................................................................................................. 57 3.1.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá .................................................................................................................. 60 3.1.1.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá ............. 62 3.1.1.5. Tạo cây con hoàn chỉnh từ phôi vô tính.................................................................. 64 3.1.1.6. Trồng cây con ở chậu đất ........................................................................................ 66 3.1.2. Tạo phôi vô tính gián tiếp .......................................................................................... 66 3.1.2.1. Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá (10 x 10 mm) ............................... 66 3.1.2.2. Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá (3 x 10 mm) ................................. 76
vi 3.2. Nhân phôi vô tính ...............................................................................................80 3.2.1. Nhân phôi trên môi trường đặc .................................................................................. 80 3.2.2. Nhân phôi trong môi trường lỏng .............................................................................. 82 3.2.2.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự tạo phôi thứ cấp ........................ 82 3.2.2.2. Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối phôi ....... 83 3.2.2.3. Ảnh hưởng của kích thước phôi đến sự tạo phôi thứ cấp ....................................... 86 3.2.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối phôi ....................... 88 3.2.2.5. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi.................. 90 3.2.2.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự hình thành phôi thứ cấp ............................. 91 3.2.2.7. Tạo cây con từ phôi nuôi lỏng lắc........................................................................... 92 3.2.3. Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi sơ cấp và phôi thứ cấp ........................................... 93 3.3. Tạo rễ bất định ...................................................................................................96 3.3.1. Tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá .............................................................................. 96 3.3.1.1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá .................................................................................................................. 96 3.1.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá ............ 104 3.1.1.3. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá .... 106 3.1.1.4. Minh họa sự tái sinh rễ trực tiếp và khảo sát hình thái giải phẫu rễ tái sinh trực tiếp ........................................................................................................................................... 109 3.3.2. Tạo rễ bất định từ chồi ............................................................................................. 111 3.3.2.1. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc từ đốt thân cây vườn ươm ......................... 111 3.3.2.2. Tạo rễ bất định từ chồi đốt thân cây in vitro ......................................................... 113 3.3.2.3. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc phôi vô tính ............................................... 115 3.4. Nhân rễ bất định trong môi trường lỏng ..........................................................117 3.4.1. Ảnh hưởng của NAA, IBA đến sự phân nhánh rễ ........................................117 3.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối rễ ............................ 121 3.4.3. Ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến tăng trưởng sinh khối của rễ ............... 123 3.4.4. Khảo sát diễn biến tăng trưởng sinh khối rễ theo thời gian ..................................... 124 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................127 KẾT LUẬN .............................................................................................................127 KIẾN NGHỊ ............................................................................................................128 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................130 PHỤ LỤC
vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AUX Auxin 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid 2-iP 6-dimethylallylamino purine ABA Abscisic acid BA Benzyl adenine CK Cytokinin ĐC Đối chứng ĐHST Điều hòa sinh trưởng GA3 Gibberellic acid HPLC High-Performance Liquid Chromatography IAA Indole-3-acetic acid IBA Indole-3-butyric acid IEDC Induced Embryogenic Determined Cell KNSP Khả năng sinh phôi KLP Khối lượng phôi KLTP Khối lượng tươi phôi LMTB Lát mỏng tế bào MS Murashige và Skoog MSSP Mô sẹo sinh phôi NAA α-Naphthaleneacetic acid NGBCC Ngũ gia bì chân chim NSC Ngày sau cấy PEDC Pre-Embryogenic Determined Cell RSV Respiratory Syncytial Virus RN Rễ nhánh RSC Rễ sơ cấp SCV Settled Cell Volume SEM Scanning Electron Microscope SH Schenk và Hildebrandt T_TCL transverse_Thin Cell layer
viii TDZ Thidiazuron TEM Transmission Electron Microscope TIBA 2,3,5-triiodobenzoic acid VDC Vein-Derived Cell WPM Woody Plant Medium
ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Ảnh hưởng của NAA và môi trường khoáng đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá ở 60 NSC .................................................. 55 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của kết hợp NAA và BA đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mảnh lá, ở môi trường SH, 60 NSC ................................. 58 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá, ở môi trường SH, 60 NSC .... 61 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mảnh lá (10 x 10 mm), ở môi trường SH, 60 NSC ................. 63 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của 2,4-D đến sự hình thành mô sẹo có khả năng sinh phôi, ở môi trường SH, 30NSC............................................. 68 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự tạo phôi từ mô sẹo mảnh lá (10 x 10 mm), ở môi trường SH, 30 NSC .................................. 70 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của NAA và BA đến tạo phôi từ mô sẹo mảnh lá (3 x 10 mm), ở môi trường SH, 30 NSC ......................................... 77 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự tạo phôi thứ cấp trên môi trường đặc SH, 30 NSC ............................................................... 80 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự tạo phôi thứ cấp trong môi trường lỏng SH, 30 NSC ............................................................. 82 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến tăng trưởng sinh khối phôi, trong môi trường lỏng SH, 45 NSC .......................... 84 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của kích thước phôi đến sự hình thành phôi thứ cấp, trong môi trường lỏng SH, 30 NSC ............................................ 87 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối phôi, trong môi trường lỏng SH, 30 NSC .................................. 89 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi trong môi trường lỏng SH, 30 NSC ................................... 90 Bảng 3.14. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi thứ cấp, trong môi trường lỏng SH, 21 NSC ...................................................... 91
x Bảng 3.15. Ảnh hưởng của NAA và môi trường khoáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mảnh lá (10 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC ............................................................................................ 98 Bảng 3.16. Ảnh hưởng của NAA và môi trường khoáng đến tạo rễ bất định trực tiếp từ mảnh lá (3 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC ..................................................................................................... 101 Bảng 3.17. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mảnh lá (10 x 10 mm) ở môi trường ½MS, 30 NSC ............. 104 Bảng 3.18. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mảnh lá (3 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC .............. 106 Bảng 3.19. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến tạo rễ bất định trực tiếp từ mảnh lá (10 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC ............... 107 Bảng 3.20. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mảnh lá (3 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC ......... 108 Bảng 3.21. Ảnh hưởng của NAA, IBA đến sự tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc từ đốt thân cây vườn ươm, ở môi trường ½MS, 60 NSC ............................................................................................ 111 Bảng 3.22. Ảnh hưởng của NAA và IBA đến sự tạo rễ bất định từ chồi đốt thân cây in vitro, ở môi trường ½MS, 60 NSC ............................ 113 Bảng 3.23. Ảnh hưởng của NAA và IBA đến sự tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc phôi vô tính, ở môi trường ½MS, 30 NSC ................ 115 Bảng 3.24. Ảnh hưởng của NAA, IBA đến sự phân nhánh rễ, ở môi trường ½MS, 21 NSC ............................................................................. 118 Bảng 3.25. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối rễ, ở môi trường ½MS, 30 NSC ........................................................ 121 Bảng 3.26. Ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối rễ, ở môi trường ½MS, 45 NSC .......................................... 123
xi DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Hình thái một số bộ phận của cây Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla) ............................................................. 5 Hình 2.1. Cây Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla) ................... 35 Hình 2.2. Lá kép Ngũ gia bì chân chim và vật liệu nuôi cấy ................... 35 Hình 2.3. Vật liệu đốt thân dùng nuôi cấy tạo chồi .................................. 48 Hình 3.1. Các dạng phát triển của phôi vô tính hình thành trực tiếp từ mô lá ............................................................................................... 52 Hình 3.2. Mảnh lá tạo phôi ở môi trường ½MS, MS, B5, SH có NAA, 60 NSC ..................................................................................... 56 Hình 3.3. Các giai đoạn phát triển của phôi vô tính và hình thái giải phẫu phôi tương ứng ......................................................................... 57 Hình 3.4. Mảnh lá tạo phôi trực tiếp ở môi trường SH có NAA kết hợp với BA, 60 NSC ....................................................................... 59 Hình 3.5. Phôi vô tính phát sinh trực tiếp từ mảnh lá ở môi trường SH, có đường và điều kiện sáng, tối, 60 NSC ................................. 62 Hình 3.6. Phôi vô tính phát sinh trực tiếp từ mảnh lá ở môi trường SH, có bổ sung nước dừa, 60 NSC .................................................. 64 Hình 3.7 Phôi bình thường và một số dạng bất thường của phôi vô tính ................................................................................................... 64 Hình 3.8. Tạo cây con từ phôi vô tính trên môi trường MS, ½MS không có chất ĐHST ........................................................................... 65 Hình 3.9. Trồng cây từ phôi vô tính ra chậu đất ở vườn ươm ................... 66 Hình 3.10. Ảnh hưởng của cách cấy mảnh lá đến hiệu quả tạo mô sẹo ...... 66 Hình 3.11. Tạo mô sẹo từ mảnh lá (10 x 10 mm)nuôi cấy trên môi trường SH ............................................................................................. 67 Hình 3.12. Ảnh hưởng của 2,4-D đến sự hình thành mô sẹo có khả năng sinh phôi ở môi trường SH, 30 NSC ......................................... 69 Hình 3.13. Tái sinh phôi từ mô sẹo có khả năng sinh phôi trên môi trường đặc SH, 30 NSC và hình thái giải phẫu phôi tái sinh từ mô sẹo ................................................................................................... 71
xii Hình 3.14. Các dạng phát triển của phôi tái sinh từ mô sẹo mảnh lá, cây con hoàn chỉnh từ phôi ............................................................. 73 Hình 3.15. Tạo phôi từ mô sẹo có KNSP bằng phương pháp nuôi lỏng lắc, hình thái cụm tế bào phân chia, cụm mô tạo phôi ..................... 74 Hình 3.16. So sánh kết quả tái sinh phôi ở môi trường SH đặc và lỏng, 30 NSC .......................................................................................... 75 Hình 3.17. Mô sẹo hình thành từ mảnh lá (3 x 10 mm) ở môi trường SH có 2,4-D, 20 – 30 NSC .............................................................. 76 Hình 3.18. Tạo phôi gián tiếp từ mô sẹo mảnh lá (3 x 10 mm) trên môi trường SH, 30 NSC .................................................................. 78 Hình 3.19. Phôi tái sinh từ mô sẹo mảnh lá (3 x 10 mm) ở môi trường SH, 60 NSC ..................................................................................... 79 Hình 3.20. Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự nhân phôi trên môi trường đặc SH, 30 NSC ....................................................................... 81 Hình 3.21. Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự tạo phôi thứ cấp nuôi lỏng trong môi trường SH, 30 NSC ................................................. 83 Hình 3.22. Ảnh hưởng của khối lượng phôi (w/v) nuôi cấy đến tăng trưởng sinh khối phôi, trong môi trường lỏng SH, 45 NSC ....... 84 Hình 3.23. Nhân phôi qua nuôi cấy lỏng lắc trong môi trường SH, 30 – 60 NSC .......................................................................................... 85 Hình 3.24. Sự đa dạng của kích thước phôi từ quá trình nuôi lỏng lắc trong môi trường SH .......................................................................... 86 Hình 3.25. Ảnh hưởng của kích thước phôi đến sự tạo phôi thứ cấp trong môi trường lỏng SH, 30 NSC .................................................... 88 Hình 3.26. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng sinh khối phôi, trong môi trường lỏng SH, 30 NSC ........................................... 89 Hình 3.27. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi, trong môi trường lỏng SH, 30 NSC ......................... 91 Hình 3.28. Ảnh hưởng của nước dừa đến sự hình thành phôi thứ cấp, trong môi trường lỏng SH, 21 NSC ................................................... 92 Hình 3.29. Tạo cây con từ phôi vô tính nuôi lỏng lắc trong môi trường MS, ½MS ................................................................................. 93
xiii Hình 3.30. Hình thái giải phẫu của phôi sơ cấp và thứ cấp ....................... 94 Hình 3.31. Đĩa cấy mảnh lá trên môi trường ½MS có 3 mg/L NAA, 30 NSC .......................................................................................... 96 Hình 3.32. Tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá (10 x 10 mm) ở môi trường MS, có NAA, 30 NSC ..................................................................... 99 Hình 3.33. Tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá (10 x 10 mm) ở môi trường ½MS, có NAA, 30 NSC ..................................................................... 99 Hình 3.34. Tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá (10 x 10 mm) ở môi trường B5, có NAA, 30 NSC ........................................................................... 99 Hình 3.35. Tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá (10 x 10 mm) ở môi trường SH, có NAA, 30 NSC ........................................................................... 99 Hình 3.36. Tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá (3 x 10 mm) ở môi trường MS, có NAA, 30 NSC ........................................................................... 102 Hình 3.37. Tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá (3 x 10 mm) ở môi trường ½MS, có NAA, 30 NSC ...................................................................... 102 Hình 3.38. Tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá (3 x 10 mm) ở môi trường B5, có NAA, 30 NSC ........................................................................... 102 Hình 3.39. Tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá (3 x 10 mm) ở môi trường SH, có NAA, 30 NSC ........................................................................... 102 Hình 3.40. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá (10 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC ......................... 105 Hình 3.41. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ từ mảnh lá (3 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC ....................................... 106 Hình 3.42. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định từ mảnh lá (10 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC ................. 107 Hình 3.43. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định từ mảnh lá (3 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC ................. 108 Hình 3.44. Minh họa cận cảnh sự tái sinh trực tiếp rễ bất định từ mảnh lá nuôi cấy trên môi trường ½MS, 12 – 20 NSC ........................... 109 Hình 3.45. Hình thái giải phẫu sơ khởi rễ bất định hình thành trực tiếp từ mảnh lá ..................................................................................... 110
xiv Hình 3.46. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc từ đốt thân, ở môi trường ½MS, 60 NSC .......................................................................... 112 Hình 3.47. Tạo rễ bất định từ chồi đốt thân cây in vitro, ở môi trường ½MS, 60 NSC ........................................................................... 114 Hình 3.48. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc phôi vô tính, ở môi trường 116 ½MS, 30 NSC ........................................................................... Hình 3.49. Vật liệu rễ bất định sơ cấp ở 20 NSC ....................................... 117 Hình 3.50. Ảnh hưởng của NAA, IBA đến hình thành rễ nhánh từ rễ đơn, ở môi trường ½MS .................................................................... 119 Hình 3.51. Rễ tăng trưởng sinh khối liên tục qua quá trình phân nhánh của rễ đơn ........................................................................................ 120 Hình 3.52. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối rễ, ở môi trường ½MS, 30 NSC ................................................ 122 Hình 3.53. Ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến tăng trưởng sinh khối rễ, ở môi trường ½MS, 45 NSC ........................................ 124 Hình 3.54. Diễn biến tăng trưởng sinh khối rễ bất định theo thời gian, 7 – 49 NSC ..................................................................................... 126 Biểu đồ 3.1. Tăng trưởng sinh khối rễ bất định theo thời gian ...................... 125
xv TÓM TẮT Đề tài: “Nghiên cứu tạo, nhân phôi vô tính và rễ bất định cây Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla Lour. Harms)” được thực hiện tại Viện Sinh học nhiệt đới –Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam từ tháng 9 năm 2015 đến tháng 9 năm 2019. Mục tiêu tổng quát của đề tài là tạo được phôi vô tính tái sinh trực tiếp, gián tiếp và nhân được phôi vô tính trên môi trường đặc và trong môi trường lỏng lắc. Tạo được rễ bất định tái sinh trực tiếp và nhân được rễ bất định trong môi trường lỏng lắc. Mục tiêu cụ thể của đề tài là: (1) Xác định được một số yếu tố ảnh hưởng (môi trường khoáng, chất điều hòa sinh trưởng, đường,…) đến tái sinh trực tiếp hoặc/và gián tiếp phôi vô tính và rễ bất định từ mô lá nuôi cấy in vitro; (2) Xác định được một số yếu tố ảnh hưởng (môi trường khoáng, chất điều hòa sinh trưởng, số/khối lượng phôi/rễ, đường,…) đến nhân phôi vô tính và rễ bất định có nguồn gốc từ mô lá nuôi cấy in vitro; (3) Tạo được cây con in vitro hoàn chỉnh từ phôi vô tính; (4) Tạo được rễ bất định từ chồi có nguồn gốc đốt thân/phôi vô tính; (5) Xác định được hình thái giải phẫu của phôi vô tính ở một số giai đoạn phát triển khác nhau, nguồn gốc tế bào phát sinh phôi vô tính và rễ bất định thông qua kỹ thuật nhuộm hai màu. Đề tài gồm có các nội dung cơ bản như: (i) Tạo phôi vô tính trực tiếp và gián tiếp từ mô lá; (ii) Nhân phôi vô tính trên môi trường đặc và trong môi trường lỏng lắc; (iii) Tạo cây con hoàn chỉnh từ phôi vô tính; (iv) Tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá, từ chồi có nguồn gốc đốt thân/phôi vô tính; (v) Nhân rễ bất định trong môi trường lỏng lắc; (vi) Khảo sát hình thái giải phẫu phôi vô tính và rễ bất định. Qua nghiên cứu, kết quả cho thấy môi trường thích hợp cho sự hình thành phôi vô tính trực tiếp từ nuôi cấy in vitro mô lá cây Ngũ gia bì chân chim là SH có bổ sung 5 mg/L NAA, 0,25 mg/L BA; 50 g/L sucrose, 10% (v/v) nước dừa kết hợp với nuôi mô ở điều kiện chiếu sáng 4.000 lux. Môi trường thích hợp cho tạo mô sẹo từ mô lá là môi trường SH có 2 mg/L 2,4-D. Phôi vô tính tái sinh (gián tiếp) từ mô sẹo trên môi trường SH có 2 mg/L NAA, 0,25 mg/L BA, 30 g/L sucrose. Đã nhân in vitro thành công phôi vô tính trên môi trường đặc và trong môi trường lỏng thông qua sự hình thành phôi thứ cấp theo cơ chế bất định. Nhân phôi trong môi trường lỏng hiệu quả hơn so với môi trường đặc. Môi trường lỏng thích hợp dùng nhân nhanh phôi vô
xvi tính là môi trường SH có bổ sung 2 mg/L NAA, 0,25 mg/L BA, 50 g/L sucrose, 10% (v/v) nước dừa; khối lượng phôi nuôi cấy ban đầu thích hợp là 2% (w/v), kích thước phôi thích hợp dùng nuôi cấy ~ 10 mm, điều kiện chiếu sáng ~ 4.000 lux. Phôi vô tính phát triển thành cây con có khả năng sinh trưởng bình thường trong điều kiện in vitro và ex vitro. Môi trường thích hợp cho tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá là môi trường đặc ½MS có 3 mg/L NAA, 30 g/L sucrose; cường độ ánh sáng ~ 4.000 lux. Đã nhân thành công sinh khối rễ bất định thông qua sự hình thành rễ thứ cấp bằng phương pháp nuôi lỏng lắc dùng môi trường ½MS có bổ sung 2 mg/L NAA, 30 g/L sucrose. Khối lượng rễ nuôi cấy ban đầu thích hợp là 2% (w/v), sinh khối rễ phát triển rất nhanh ở giai đoạn 21–35 ngày, đạt mức cao nhất ở giai đoạn 42 ngày sau cấy. Cũng đã tạo được rễ bất định cho chồi có nguồn gốc đốt thân (cây vườn ươm, cây in vitro) và phôi vô tính (đã cắt bỏ rễ trụ), ghi nhận được hình thái giải phẫu phôi vô tính và rễ bất định bằng phương pháp nhuộm hai màu.
xvii SUMMARY The study “In vitro induction and multiplication of somatic embryos and adventitious roots of Schefflera octophylla Lour. Harms” was carried out at the Institute of Tropical Biology (ITB) – Vietnam Academy of Science and Technology (VAST) from September of 2015 to September of 2019. The general objective of this study was to generate directly/indirectly somatic embryos and multiply somatic embryos on solid and shaking liquid media, to generate directly adventitious roots and mutiply adventitious roots in shaking liquid medium. The specific objectives of the study were to identify: (1) The optimal culture conditions for inducing direct and indirect formation of somatic embryos and adventitious roots from leaf explants cultured in vitro; (2) The optimal culture conditions for multiplication of somatic embryos and adventitious roots originated from leaf explants on solid and/or shaking liquid media; (3) The condition for generation of in vitro plantlets from somatic embryos; (4) The condition for induction of adventitious roots from shoots originated from nodal explants/somatic embryos (5) The morphological and histological properties of somatic embryos at many different stages of development, cellular origin of somatic embryo and adventitious root formation through double staining with carmine alum and iodine green. The study comprised of four contents: (i) To generate directly/indirectly somatic embryos from leaf explants; (ii) To multiply somatic embryos on the solid and liquid media; (iii) To generate the plantlets originated from somatic embryos; (iv) To generate directly adventitious roots from leaf explants, from shoots originated from nodal explants/somatic embryos; (v) To multiply adventitious roots in liquid medium; (vi) To examine the morphology and histology of somatic embryo and adventitious root. The results showed that the suitable medium for the direct induction of somatic embryos from the leaf explants cultured in vitro was SH + 5 mg/L NAA + 0.25 mg/L BA + 10% (v/v) coconut water, 50 g/L sucrose, in light condition ~ 4,000 lux. The suitable media for callus induction from the leaf explants, for regeneration of somatic embryos from callus, were SH + 2 mg/L 2,4-D; SH + 2 mg/L NAA + 0.25 mg/L BA, 30 g/L sucrose, respectively. Successfully in vitro multiplied somatic embryos on
xviii solid and shaking liquid media through secondary embryogenesis by an adventitious mechanism. Somatic embryo multiplication in liquid medium was more efficient than on solid media. The suitable liquid medium for multiplication of somatic embryos was SH + 2 mg/L + 0.25 mg/L BA + 10% (v/v) coconut water, 50 g/L sucrose; the suitable somatic embryo inoculum density/size for culture was 2% (w/v), the suitable size of somatic embryos for multiplication in liquid medium was ~ 10 mm, light condition was 4,000 lux. The somatic embryos developed into plantlets with normal growth under in vitro/ex vitro conditions. The suitable medium for direct adventitious roots from leaf explants was ½MS + 3 mg/L NAA, 30 g/L sucrose, light condition was ~ 4,000 lux. Through secondary rhizogenesis by an adventitious mechanism, successfully in vitro multiplied adventitious roots in liquid medium ½MS + 2 mg/L NAA, 30 g/L sucrose; suitable root inoculum density for culture was 2% (w/v), root biomass developed quickly at the period of 21-35 days, reaching the highest level at 42 days after culturing. The adventitious roots from shoots originated from nodal explants (greenhouse and in vitro plants) and somatic embryos (with the tap roots removed), the morphology and anatomy of somatic embryos and adventitious roots via double staining method were also achieved.