Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu vi nấm kháng tuyến trùng trên cây Hồ tiêu Piper nigrum L. nhằm tạo chế phẩm sinh học

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:162

Thêm vào BST

Báo xấu

44
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án được thực hiện với mục tiêu nhằm tuyển chọn được một số chủng vi nấm có hoạt lực diệt tuyến trùng Meloidogyne sp. cao gây bệnh trên cây hồ tiêu Piper nigrum L. và tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng làm tăng năng suất cây hồ tiêu tối thiểu là 15%, tạo được chủng đột biến và đánh giá hoạt lực diệt tuyến trùng của chủng đột biến so với chủng tự nhiên. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu vi nấm kháng tuyến trùng trên cây Hồ tiêu Piper nigrum L. nhằm tạo chế phẩm sinh học

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _______________________ Chu Thanh Bình NGHIÊN CỨU VI NẤM KHÁNG TUYẾN TRÙNG TRÊN CÂY HỒ TIÊU Piper nigrum L. NHẰM TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2020
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _______________________ Chu Thanh Bình NGHIÊN CỨU VI NẤM KHÁNG TUYẾN TRÙNG TRÊN CÂY HỒ TIÊU Piper nigrum L. NHẰM TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9420101.07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. BÙI THỊ VIỆT HÀ 2. TS. HỒ TUYÊN Hà Nội - 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Bùi Thị Việt Hà và TS. Hồ Tuyên. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trong các Tạp chí Khoa học, phần còn lại chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội ngày 31 tháng 8 năm 2020 Tác giả luận án Chu Thanh Bình
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà, Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN, TS. Hồ Tuyên, Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ tôi tích cực nghiên cứu và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn tới tập thể cán bộ Phòng Genomic, đặc biệt là TS. Trần Văn Tuấn, Trưởng bộ môn Vi sinh vật học, Trưởng phòng Genomic, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian nghiên cứu tại phòng thí nghiệm. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã giảng dạy, truyền đạt những kiến thức mới và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành kết quả nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn Phương Nhuệ, TS. Đỗ Thị Tuyên phòng Công nghệ lên men, Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện luận án. Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học và Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Tôi mong muốn được gửi lời cảm ơn đến Ban Tổng giám đốc, Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga, Bộ Quốc phòng đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận án. Cuối cùng, tôi xin được gửi lòng biết ơn sâu sắc đến người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn luôn ở bên, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày 31 tháng 8 năm 2020 Tác giả luận án Chu Thanh Bình
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 5-FOA 5 fluoroorotic acid ATMT Agrobacterium tumefaciens-mediated tranformation (chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens) APS Ammonium Persulphate AS Acetosyringone BCAs Các tác nhân kiểm soát sinh học (Biocontrol Agents) Bp Base pair CD Czapeck Dox CMA Corn Meat Agar CYA Czapeck Yeast Autolysate DNA Deoxyribonucleic acid DNS 3, 5-Dinitrosalicylic acid DsRed Red fluorecent protein ĐC Đối chứng EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid GFP Green fluorecent protein HLCP Hiệu lực chế phẩm HLD Hiệu lực diệt HQPH Hiệu quả phục hồi IM Induction medium (môi trường cảm ứng) ITS Internal Transcribed Spacer KPH Không phát hiện LB Luria-Bertani MH Mô hình MM Minimal medium (môi trường tối thiểu) ORF Open Reading Frame (khung đọc mở)
PPN Plant-parasitic nematodes P. lilaciuns Paecilomyces lilacinus PCR Polymerase chain reaction PDB Potato Dextrose Broth PDA Potato Dextrose Agar SDS Sodium Dodecyl Sulfate TCA Tricloacetic acid UV Ultra violet TLC Tỷ lệ chết VOC Hợp chất hữu cơ dễ bay hơi WT Wild type (chủng tự nhiên)
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Hệ thống phân loại nấm diệt tuyến trùng 10 Bảng 1.2. Các chế phẩm sinh học thương mại phòng trừ bệnh do tuyến trùng 31 Bảng 2.1. Thành phần gel cô và gel tách 43 Bảng 2.2. Thiết kế các biến bằng ma trận Plackett-Burman 52 Bảng 2.3. Đánh giá cấp độ biểu hiện bệnh 57 Bảng 2.4. Thiết kế thí nghiệm thử nghiệm mô hình nhà lưới 59 Bảng 2.5. Thiết kế thí nghiệm thử nghiệm mô hình đồng ruộng 60 Bảng 3.1. Khảo sát khả năng diệt tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp. 67 Bảng 3.2. Kết quả tinh sạch chitinase từ chủng P. lilacinus P1 72 Bảng 3.3. Kết quả phân tích hồi quy hoạt độ chitinase 81 Bảng 3.4. Đánh giá tính thực tế của mô hình 83 Bảng 3.5. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide và amino axit 89 Bảng 3.6. Khả năng sống sót của chủng P1 trong dịch bảo quản 101 Bảng 3.7. Khả năng sống sót của chủng P1 trong chế phẩm theo thời gian 103 Bảng 3.8. Mật độ tuyến trùng còn sống (MĐTT) và Hiệu lực diệt (HLD) tuyến 104 trùng sau khi xử lý bằng Chế phẩm sinh học trong chậu trồng ở nhà lưới Bảng 3.9. Tỷ lệ cây không phục hồi và năng suất của mô hình thử nghiệm 106
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hồ tiêu bị bệnh vàng lá và chết chậm 7 Hình 1.2. Sự tương tác giữa tuyến trùng, nấm và vi khuẩn 8 Hình 1.3. Hình thái của bẫy được tạo ra bởi nấm bẫy tuyến trùng 13 Hình 1.4. Vòng đời của nấm sợi Esteya vermicola 14 Hình 1.5. Sự biến đổi về hình thái của A. oligospora trên CMA và PDA 24 Hình 1.6. Cơ chế chuyển gen vào vi nấm thông qua A. tumefaciens 26 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu 39 Hình 3.1. Hình thái, cấu trúc sinh bào tử của các chủng nấm sợi 61 Hình 3.2. Hoạt độ chitinase và protease của NV01, NV20 và P1 71 Hình 3.3. Ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp chitinase 75 Hình 3.4. Ảnh hưởng của các nguồn các bon đến khả năng sinh chitinase 77 Hình 3.5. Ảnh hưởng của các nguồn ni tơ đến khả năng sinh chitinase 78 Hình 3.6. Ảnh hưởng của muối khoáng đến khả năng sinh chitinase 79 Hình 3.7. Bề mặt đáp ứng của từng cặp các yếu tố ảnh hưởng đến sinh chitinase 80 chủng P. lilacinus P1 Hình 3.8. Khả năng mẫn cảm với kháng sinh và 5-FOA của chủng P1 85 Hình 3.9. Kết quả chọn lọc thể đột biến bằng phương pháp chiếu UV 87 Hình 3.10. Nhân dòng đoạn gen ORFpyrG chủng P1 và thể đột biến 424 89 Hình 3.11. Hình thái khuẩn lạc chủng P1 và 424pyrG(-) ở các nồng độ 90 uracil/uridine khác nhau Hình 3.12. Điều kiện được lựa chọn tối ưu cho quá trình chuyển gen 92 Hình 3.13. Quy trình chuyển gen bằng phương pháp ATMT của thể đột biến 94 424pyrG(-) sử dụng vectơ nhị thể pEX2A với marker pyrG. Hình 3.14. Xác nhận thể chuyển gen biểu hiện huỳnh quang đỏ DsRed 95 Hình 3.15. Hoạt tính chitinase và protease của các thể chuyển gen 98 Hình 3.16. Tỷ lệ chết của tuyến trùng 99 Hình 3.17. Các yếu tổ ảnh hưởng thu hồi sinh khối ướt của P. lilacinus P1 100 Hình 3.18. Sơ đồ sản xuất dịch thể chế phẩm sinh học 102
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 Chương 1 ....................................................................................................................4 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .......................................................4 1.1. BỆNH GÂY RA BỞI TUYẾN TRÙNG Meloidogyne sp. TRÊN CÂY HỒ TIÊU ............................................................................................................................4 1.1.1. Bệnh gây ra bởi tuyến trùng Meloidogyne.................................................4 1.1.2. Phân bố của tuyến trùng Meloidogyne tại Tây Nguyên ........................4 1.1.3. Đặc điểm và cơ chế gây bệnh của tuyến trùng Meloidogyne sp...............5 Đặc điểm của tuyến trùng Meloidogyne sp. .........................................................5 Cơ chế gây bệnh của tuyến trùng Meloidogyne sp. .............................................6 1.2. GIỚI THIỆU VỀ NẤM DIỆT TUYẾN TRÙNG ................................................7 1.2.1. Vai trò của nấm diệt tuyến trùng trong kiểm soát sinh học ....................8 1.2.2. Phân loại nấm diệt tuyến trùng ................................................................10 1.2.2.1. Nấm bẫy tuyến trùng .............................................................................12 1.2.2.3. Nấm ký sinh trứng tuyến trùng ..............................................................15 Giới thiệu về Paecilomyces sp. .........................................................................16 Chitinase từ nấm diệt tuyến trùng ..................................................................16 Protease từ nấm diệt tuyến trùng ...................................................................20 1.2.2.4. Nấm sinh độc tố .....................................................................................20 1.2.3. Các giai đoạn diệt tuyến trùng của nấm ..................................................21 1.3. CẢI BIẾN DI TRUYỀN Ở NẤM DIỆT TUYẾN TRÙNG ..............................24 1.3.1. Các phương pháp chuyển gen ..................................................................24 1.3.2. Một số gen chỉ thị dùng cho chuyển gen ở nấm ......................................26 1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng quá trình chuyển gen ..........................................27 1.3.4. Một số nghiên cứu cải biến di truyền đối với nấm diệt tuyến trùng .....28 1.4. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT TUYẾN TRÙNG TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM ...................................................................31 1.4.1. Một số biện pháp sinh học phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne ...........31 1.4.2. Tình hình phòng trừ bệnh tuyến trùng cây hồ tiêu tại Việt Nam .........34
Chương 2 ..................................................................................................................37 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............................................37 2.1. VẬT LIỆU .........................................................................................................37 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................37 2.1.2. Hóa chất ......................................................................................................38 2.1.3. Thiết bị ........................................................................................................38 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................39 2.2.1. Phương pháp phân lập và quan sát hình thái .........................................39 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu enzym/protein ................................................41 2.2.3. Phương pháp điện di trên Gel polyacrylamid (SDS-PAGE) .................43 2.2.4. Tách chiết DNA hệ gen và phản ứng PCR ..............................................44 2.2.5. Phản ứng nối ghép gen ..............................................................................45 2.2.6. Biến nạp vector tái tổ hợp vào E. coli DH5α ...........................................46 2.2.7. Tách DNA plasmid ....................................................................................46 2.2.8. Đánh giá khả năng mẫn cảm với kháng sinh và 5 – FOA của chủng P. lilacinus P1 ............................................................................................................46 2.2.9. Phương pháp thu bào tử và hệ sợi nấm P. lilacinus P1 ..........................47 2.2.10. Phương pháp tạo chủng đột biến gen pyrG bằng UV sử dụng môi trường chọn lọc 5-fluoroorotic axit (5-FOA) từ chủng P. lilacinus P1 ...........47 2.2.11. Phương pháp chuyển gen vào nấm sợi thông qua Agrobacterium tumefaciens ...........................................................................................................48 2.2.11.1. Biến nạp vector pEX2A vào vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 ..............48 2.2.11.2. Tối ưu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen ở thể đột biến 424pyrG(-) ..........................................................................................................49 2.2.11.3. Xác nhận biểu hiện gen DsRed của các thể chuyển gen .....................50 2.2.11.4. Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chitinase và protease ngoại bào, khả năng diệt tuyến trùng của các thể chuyển gen. ...........................................51 2.2.12. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp chitinase của P. lilacinus P1 ................................................................................51 2.2.12.1. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm .................................................51 2.2.12.2. Sàng lọc các yếu tố bằng ma trận Plakett – Burman ..........................52 2.2.12.3. Phương pháp tối ưu hóa bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) ..........................................................................................52
2.2.12.4. Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................54 2.2.13. Các phương pháp thử nghiệm chế phẩm sinh học ...............................54 2.2.13.1. Phương pháp lấy mẫu đất và mẫu rễ ..................................................54 2.2.13.2. Tách lọc và đếm số lượng tuyến trùng trong mẫu đất và mẫu rễ .......54 2.2.13.3. Phương pháp lọc tĩnh thu tuyến trùng.................................................55 2.2.13.4. Phương pháp đếm tuyến trùng [3] ......................................................56 2.2.13.5. Phương pháp làm nhiễm nấm lên tuyến trùng theo Khan A. và cs., (2006)[94] ...........................................................................................................56 2.2.13.6. Phương pháp tạo chế phẩm sinh học và đánh giá khả năng sống sót của chủng trong dịch bảo quản ..........................................................................56 2.2.13.7. Các phương pháp thử nghiệm chế phẩm sinh học phòng bệnh bởi tuyến trùng gây ra ..............................................................................................56 2.2.13.8. Xác định hiệu lực của chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng trên đất trồng cây hồ tiêu trong nhà lưới.........................................................................58 2.2.13.9. Xây dựng mô hình, quy trình sử dụng chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh tuyến trùng quy mô 03 ha tại Đăk Lăk ......................................................60 Chương 3 ..................................................................................................................61 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................................61 3.1. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ NĂNG DIỆT TUYẾN TRÙNG Meloidogyne sp...........................................................................................61 3.1.1. Phân lập, sàng lọc các chủng nấm sợi ......................................................61 3.1.2. Định danh các chủng nấm sợi P1, NV01, NV20 dựa trên trình tự ITS1/ITS4 .............................................................................................................69 3.1.3. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chitinase, protease ngoại bào của chủng NV01, P1 và NV20 ....................................................................................71 3.1.4. Tinh sạch chitinase từ chủng P1 ...............................................................72 3.1.5. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chitinase từ P1 .......74 3.1.5.1 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên men......................................74 3.1.5.2. Ảnh hưởng của nguồn các bon ..............................................................76 3.1.5.3. Ảnh hưởng của nguồn ni tơ ...................................................................77 3.1.5.4. Phân tích ý nghĩa của mô hình với thí nghiệm ......................................80 3.1.5.5. Đánh giá tính thực tế của mô hình ........................................................83 3.2. NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN DI TRUYỀN CHỦNG Paecilomyces lilacinus P1 84
3.2.1. Đánh giá khả năng mẫn cảm với 5-FOA và một số kháng sinh của chủng P. lilacinus P1 ............................................................................................84 3.2.2. Tạo chủng nấm P. lilacinus đột biến kháng 5-FOA và trợ dưỡng uridine/uracil ........................................................................................................87 3.2.2.1. Gây đột biến kháng 5-FOA và trợ dưỡng uridine/uracil bằng phương pháp chiếu UV ....................................................................................................87 3.2.2.2. Xác nhận thể đột biến 424 bằng giải trình tự vùng ORF gen PyrG .....88 3.2.3. Xây dựng quy trình chuyển gen tối ưu vào 424 pyrG(-) ........................91 3.2.4. Xác nhận biểu hiện gen DsRed ở các thể chuyển gen .............................94 3.2.5. Sàng lọc các thể chuyển gen có hoạt tính chitinase, protease và hoạt lực diệt tuyến trùng Meloidogyne sp. cao .................................................................97 3.3. NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VÀ THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT TUYẾN TRÙNG .................................................................................100 3.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy và các loại môi trường quá trình sinh trưởng của chủng P1 ...................................................100 3.3.2. Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng Meloidogyne sp. gây bệnh cây hồ tiêu ..........................................................................................101 3.3.3. Nghiên cứu khả năng phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. hại hồ tiêu trong điều kiện nhà lưới của chế phẩm sinh học .....................................103 3.3.4. Đánh giá năng suất của mô hình trình diễn sau khi sử dụng chế phẩm .............................................................................................................................105 KẾT LUẬN ............................................................................................................107 KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................108 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ ............................109 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................110
MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Tuyến trùng ký sinh thực vật (Plant-parasitic nematodes - PPN) gây bệnh trên hàng loạt các loại rau, cây nông nghiệp, cây công nghiệp. PPN gây thiệt hại trị giá ước tính hơn 157 tỷ USD/năm trên toàn thế giới. Trong nhiều thập kỷ, việc phòng trừ tuyến trùng phụ thuộc rất nhiều vào hóa chất bảo vệ thực vật như Furadan, Marshal, Oncol, Nokaph, Vimoca với hiệu quả làm giảm mật độ tuyến trùng nhưng vườn cây vẫn bị bệnh và phải áp dụng thuốc trong thời gian dài. Hơn nữa, sử dụng thuốc bảo vệ thực vật thường dẫn tới khả năng kháng thuốc, mất cân bằng giữa hệ vi sinh vật có lợi và vi sinh vật đất. Hơn nữa, một số thuốc bảo vệ thực vật hiện nay đã bị rút khỏi danh mục được sử dụng vì độc tính của chúng đối với động vật và ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Hiệu quả của luân canh cây trồng bị hạn chế trong một số loại cây trồng do phạm vi vật chủ rộng hoặc tỷ lệ sống lâu dài của hầu hết các PPN. Sự đa dạng di truyền cao trong/giữa các quần thể tuyến trùng làm hạn chế hiệu quả của các loại cây trồng kháng bệnh do tuyến trùng gây nên. Do đó, các loại cây công nghiệp và rau màu trên toàn cầu vẫn đang bị đe dọa nặng nề từ PPN. Cùng với việc phát triển các biện pháp phòng trừ sinh học, các vi sinh vật tiêu diệt tuyến trùng nói chung và nấm sợi nói riêng được coi như một cách tiếp cận đầy hứa hẹn để loại trừ các loài tuyến trùng. Một số chi nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp các enzym và độc tố nhằm ngăn cản sự sinh sản, nở trứng và khả năng sống sót của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne sp. Những chi nấm này được sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng, như chế phẩm sinh học Biocon có thành phần chính là nấm Paecilomyces lilacinus, đây là loài có khả năng ký sinh, tiêu diệt tuyến trùng và trứng của chúng. Tại Việt Nam, theo quy hoạch lý thuyết, diện tích trồng cây hồ tiêu của tỉnh Đăk Lăk đến năm 2020 đạt 15000 ha, tuy nhiên tháng 1 năm 2017 diện tích trồng hồ tiêu đã tăng lên tới 38616 ha, tỉnh Gia Lai đã có trên 6155 ha hồ tiêu bị nhiễm 1
bệnh. Việc tăng nhanh diện tích trồng hồ tiêu cũng kèm theo số diện tích bị sâu, dịch hại tăng nhanh. Theo Chi cục Bảo vệ thực vật tỉnh Đăk Lăk, từ đầu năm 2016 đến đầu năm 2017 có hơn 2776 ha trồng hồ tiêu bị sâu bệnh gây hại, chiếm 10% tổng diện tích hồ tiêu toàn tỉnh: Trong đó, hơn 579 ha bị bệnh chết nhanh, 1113 ha bệnh chết chậm, 1083 ha bị các loại sâu bệnh khác gây hại. Diện tích trồng hồ tiêu bị bệnh tập trung tại các huyện Buôn Đôn (515 ha), Ea H’leo (183 ha), Ea Kar (hơn 156 ha), Krông Năng (45,5 ha), thị xã Buôn Hồ (216 ha)… Để ngăn chặn dịch bệnh lây lan và bùng phát, Chi cục Bảo vệ thực vật tỉnh đã hướng dẫn người dân thực hiện nhiều biện pháp phòng trừ dịch bệnh như thường xuyên thăm vườn để nắm bắt tình hình sinh trưởng của cây trồng, thực hiện bón phân hợp lý, quản lý sâu bệnh hại tổng hợp (Integrated Pests Management – IPM). Nhằm giải quyết nhu cầu cấp thiết tạo chế phẩm sinh học một mặt vừa thân thiện với môi trường mặt khác lại tăng hiệu quả phòng trừ bệnh gây ra bởi tuyến trùng từ chủng nấm sợi diệt tuyến trùng hại hồ tiêu, đề tài: “Nghiên cứu vi nấm kháng tuyến trùng trên cây Hồ tiêu Piper nigrum L. nhằm tạo chế phẩm sinh học” đã được thực hiện với thời gian nghiên cứu từ tháng 3 năm 2016 đến tháng 12 năm 2019. 2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI  Tuyển chọn được một số chủng vi nấm có hoạt lực diệt tuyến trùng Meloidogyne sp. cao gây bệnh trên cây hồ tiêu Piper nigrum L. và tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng làm tăng năng suất cây hồ tiêu tối thiểu là 15%.  Tạo được chủng đột biến và đánh giá hoạt lực diệt tuyến trùng của chủng đột biến so với chủng tự nhiên. 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU * Tuyển chọn, thử nghiệm khả năng diệt tuyến trùng Meloidogyne sp. của các chủng nấm phân lập từ đất trồng hồ tiêu tỉnh Đăk Lăk. Xác định hoạt tính chitinase, protease của chủng nấm diệt tuyến trùng tiềm năng. * Nghiên cứu tạo chủng vi nấm đột biến có hoạt lực diệt tuyến trùng cao bằng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 2
* Tạo chế phẩm sinh học và thử nghiệm ở quy mô nhà lưới và quy mô 3 ha tại Đăk Lăk. 4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI - Ý nghĩa khoa học Trong ba chủng nấm sợi có khả năng diệt tuyến trùng phân lập được trên đất trồng hồ tiêu, Paecilomyces lilacinus P1 (hay còn gọi là Purpureocillium lilacinum) là chủng được quan tâm nghiên cứu bởi hoạt lực diệt tuyến trùng cao nhất. Chủng đột biến có hoạt lực diệt tuyến trùng cao gấp 7 lần so với chủng tự nhiên trong vòng 48 giờ. Sử dụng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sẽ mở ra những triển vọng về nghiên cứu vai trò, chức năng của các gen liên quan đến cơ chế diệt tuyến trùng của chi Paecilomyces. - Ý nghĩa thực tiễn Chế phẩm sinh học được thử nghiệm trên quy mô 3 ha/mô hình tại tỉnh Đăk Lăk đã có tác dụng điều hòa tăng năng suất lên 20% so với đối chứng là vườn tiêu cấp độ cây hoàn toàn khỏe mạnh; 48% so với đối chứng là vườn tiêu nhiễm bệnh cấp độ nặng nhất. Chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng sẽ góp phần bảo vệ môi trường và phát triển bền vững ngành sản xuất hồ tiêu ở nước ta. 5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN +) Tuyển chọn được 1 chủng vi nấm bản địa (P1) từ đất trồng hồ tiêu tỉnh Đăk Lăk có hoạt lực diệt tuyến trùng cao nhất; Chế phẩm sinh học từ chủng P1 được thử nghiệm ở quy mô 3 ha/mô hình cho năng suất tăng 20% đối với vườn hồ tiêu hoàn toàn khỏe mạnh. +) Đã xây dựng quy trình chuyển gen mới bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens dựa trên cơ chế trợ dưỡng uridine/uracil đạt hiệu suất cao gấp 10 lần so với nghiên cứu trước đây. Thể chuyển gen PE858 được sàng lọc từ thư viện các thể chuyển gen có hoạt lực diệt tuyến trùng cao gấp 7 lần so với chủng tự nhiên. Ngoài ra, đề tài mở ra những hướng nghiên cứu như điều tra vai trò chức năng của một số gen liên quan đến cơ chế diệt tuyến trùng. 3
Chương 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. BỆNH GÂY RA BỞI TUYẾN TRÙNG Meloidogyne sp. TRÊN CÂY HỒ TIÊU 1.1.1. Bệnh gây ra bởi tuyến trùng Meloidogyne Hầu hết tuyến trùng thuộc chi Meloidogyne là nhóm tuyến trùng ký sinh thực vật quan trọng nhất đối với nền nông nghiệp trên toàn thế giới [52]. Trên cây hồ tiêu, tuyến trùng Meloidogyne gây ra bệnh sần rễ, vàng lá, chết chậm. Ở các nước Đông Nam Á như Malaysia, M. incognita và M. javanica được công bố là nguyên nhân gây hai loại bệnh chính là bệnh chết chậm và bệnh vàng lá trên cây hồ tiêu. Các loài này cũng đã được ghi nhận trên hồ tiêu ở Ấn Độ, Thái Lan, Campuchia, Indonesia, Brunei, Philipin, Braxil và Việt Nam [149]. Tuyến trùng Meloidogyne tấn công sẽ làm cho bề mặt rễ cây hồ tiêu có dạng sần sùi hoặc tạo thành các u cục và sau đó là các vi sinh vật cơ hội gây bệnh xâm nhập. Tuy nhiên, khi nhổ bỏ những cây hồ tiêu bị nhiễm bệnh thì trứng tuyến trùng Meloidogyne vẫn tồn tại trong đất. Đây là vấn đề khó khăn vì khi trồng hồ tiêu sẽ lại mắc bệnh. Qua khảo sát các loài tuyến trùng này có khả năng tồn tại trong đất không có cây chủ sau 1 năm loại bỏ cây hồ tiêu bị bệnh. Điều đó chứng tỏ rằng ngoài phổ ký chủ rộng rãi Meloidogyne còn có khả năng tồn tại trong đất rất lâu ngay cả trong điều kiện khắc nghiệt như mùa khô tại Tây Nguyên. Do vậy, những vùng đất này thường bị bỏ hoang hoặc trồng những loại cây ngắn ngày hoặc những cây có giá trị kinh tế thấp [170]. Khi trồng lại hồ tiêu, với mật độ lớn tuyến trùng có thể gây chết cây, đồng thời sự có mặt của tuyến trùng làm giảm khả năng kháng bệnh của cây do tác nhân khác gây nên [36]. 1.1.2. Phân bố của tuyến trùng Meloidogyne tại Tây Nguyên Tây Nguyên có hơn 2 triệu hecta đất bazan màu mỡ, tức là chiếm đến 60% tổng diện tích đất bazan trên cả nước, đất bazan giàu chất dinh dưỡng, tầng phong hoá sâu, phân bố tập trung kết hợp với khí hậu Tây Nguyên được chia làm hai mùa: mùa mưa từ tháng 5 đến hết tháng 10 và mùa khô từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau. Đây là yếu tố thuận lợi cho việc hình thành các vùng chuyên canh qui mô lớn. Chính 4
vì thế Tây Nguyên đứng đầu cả nước về diện tích cây công nghiệp với các cây trồng xuất khẩu chủ lực là cà phê và hồ tiêu. Năm 2000, Việt Nam công bố có 5 loài thuộc Meloidogyne và cả 5 loài này đều phân bố ở Tây Nguyên. Các nghiên cứu sau này cho thấy sự hiện diện và gây hại của Meloidogyne là rất lớn, chủ yếu tập trung cây hồ tiêu, cà phê [3]. Lê Đức Khánh và cs. (2013) ghi nhận trên hồ tiêu 3 loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne, trong đó 2 loài M. incognita, Meloidogyne sp. ghi nhận tại Gia Lai, Đăk Lăk, Đăk Nông và 1 loài M. javanica tại tỉnh Đăk Lăk với tần suất xuất hiện Meloidogyne trong đất là 92,5% và 62,5% trong rễ [4]. Trịnh Thu Thủy (2010) phân tích 240 mẫu thu ở 36 vườn hồ tiêu tại 3 tỉnh Đắk Lắk, Gia Lai, Kon Tum ghi nhận 97,1% mẫu hồ tiêu bị nhiễm M. incognita, trong đó tỷ lệ bị nhiễm M. incognita cao nhất là ở Gia Lai [166]. Như vậy, tuyến trùng gây hại cây hồ tiêu khu vực Tây Nguyên chủ yếu thuộc chi Meloidogyne và dưới đây tập trung tổng quan về đặc điểm, cơ chế gây bệnh đồng thời cũng như nấm sợi diệt tuyến trùng chi Meloidogyne. Theo thống kê của Cục Bảo vệ Thực vật/Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, tính đến tháng 10 năm 2016, cây hồ tiêu bị bệnh với diện tích lên đến hàng ngàn ha tập trung ở một số địa phương như Gia Lai, Đăk Nông, Đăk Lăk. Theo báo cáo của 3 tỉnh trọng điểm trồng cây hồ tiêu của Tây Nguyên là Đăk Lăk, Gia Lai và Đăk Nông, hàng năm, mỗi tỉnh đều có vài ngàn ha hồ tiêu bị nhiễm bệnh vàng lá, tuyến trùng … [1]. 1.1.3. Đặc điểm và cơ chế gây bệnh của tuyến trùng Meloidogyne sp. Đặc điểm của tuyến trùng Meloidogyne sp. Tuyến trùng Meloidogyne sp. là tuyến trùng gây bệnh sần rễ và được coi là nhóm tuyến trùng gây hại nhiều nhất với 3 nghìn loài thực vật trên thế giới bao gồm các cây trồng quan trọng như đậu đỗ, ngũ cốc, cây ăn quả và nhiều loại cây công nghiệp khác [153]. Các công bố cho thấy có khoảng gần 80 loài ký sinh thuộc Meloidogyne; trong đó có bốn loài ký sinh gây hại quan trọng nhất là: M. incognita, M. arenaria, M. javanica và M. hapla. Đây là các loài phân bố rộng và gây hại lớn ở các nước nông nghiệp trên thế giới. Tuyến trùng Meloidogyne sp. thuộc nhóm động vật không xương 5
sống, có đặc điểm sinh thái thích nghi với đời sống ký sinh ở thực vật. Nhóm tuyến trùng này có một số đặc trưng quan trọng so với nhóm ký sinh ở động vật và các nhóm sinh thái khác như: phần miệng có cấu tạo kim hút chuyển hóa để tiêm vào mô thực vật và hút chất dinh dưỡng, kích thước của trứng lớn so với kích thước cơ thể, đời sống của chúng bắt buộc lệ thuộc vào cơ thể thực vật, trong đó phần kim chích là phần quan trọng nhất của tuyến trùng. Tuyến trùng tập trung nhiều nhất ở vùng rễ. Sau khi xâm nhập vào rễ, ấu trùng sẽ di chuyển và cư trú tại mô phân sinh, tấn công vào đỉnh sinh trưởng của chóp rễ, làm phân hóa tế bào đỉnh sinh trưởng. Các nốt sần rễ thường được tạo thành trong vòng 1-2 ngày sau khi bị tuyến trùng xâm nhập. Vị trí phân loại của giống Meloidogyne hiện tại theo hệ thống Karsen và cs., (2013) [89] như sau: Ngành: Nematoda Potts, 1932 Lớp: Chromadorea Inglis, 1983 Phân lớp: Chromadoria Pearse, 1942 Bộ: Rhabditida Chitwood, 1933 Phân bộ: Tylenchina Thorne, 1949 Họ: Meloidogynidae Skarbilovich, 1959 Phân họ: Meloidogyninae Skarbilovich, 1959 Giống: Meloidogyne Göldi, 1887 Cơ chế gây bệnh của tuyến trùng Meloidogyne sp. Chu kỳ sống của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne bao gồm 5 giai đoạn phát triển: trứng, ấu trùng tuổi 1(J1), ấu trùng tuổi 2 (ấu trùng cảm nhiễm - J2), ấu trùng tuổi 3, 4 (J3, J4) và giai đoạn trưởng thành với con cái và con đực. Trứng sau khi thụ tinh sẽ hình thành giai đoạn đầu tiên của ấu trùng J1 nằm trong trứng. Khi đạt điều kiện thuận lợi trứng chứa J1 sẽ nở ra thành ấu trùng tuổi 2 (J2). Sau khi xâm nhập vào trong rễ, tuyến trùng di chuyển giữa các tế bào vỏ rễ, tách dọc tế bào và định vị tại vùng mô phân sinh của vỏ rễ bắt đầu quá trình dinh dưỡng. Trong quá trình dinh dưỡng, tuyến trùng cố định phần đầu vào các tế bào mô mạch của rễ, tiết men tiêu hóa làm thay đổi quá trình sinh lý sinh hóa của tế bào rễ cây chủ và hình thành các điểm dinh dưỡng 6
cho tuyến trùng. Vùng này gồm 5-6 tế bào khổng lồ (tế bào đa nhân) được tạo thành trong vùng nhu mô hoặc hoặc mô libe. Cùng với sự hình thành tế bào khổng lồ các mô rễ xung quanh nơi tuyến trùng ký sinh cũng bị phình to ra và tạo thành các nốt sần rễ (gall hoặc root-knot) [22]. Những cây hồ tiêu bị nhiễm tuyến trùng thường mắc hai bệnh chính là vàng lá và chết chậm. Chiều dài vòng đời tuyến trùng phụ thuộc nhiều yếu tố, quan trọng nhất là nhiệt độ môi trường và loại đất. Ở nhiệt độ 27 ºC, một chu kỳ của tuyến trùng Meloidogyne từ 21-25 ngày, trong khi tại nhiệt độ 19 ºC cần ít nhất là 29 ngày để hoàn thành chu kỳ sống [22]. Hình 1.1. Hồ tiêu bị bệnh vàng lá và chết chậm. A. Vàng lá B. Chết chậm (Nguồn: Hiệp hội hồ tiêu Việt Nam) 1.2. GIỚI THIỆU VỀ NẤM DIỆT TUYẾN TRÙNG Nấm diệt tuyến trùng là loại vi sinh vật có thể bắt, tiêu diệt và tiêu hóa tuyến trùng. Các nhà khoa học đã tìm ra hơn 200 loài nấm sợi có khả năng diệt tuyến trùng [138]. Những chi nấm này có khả năng diệt tuyến trùng ở tất cả các giai đoạn: trưởng thành, ấu trùng và trứng, đồng thời sử dụng tuyến trùng là nguồn dinh dưỡng. Một số loại nấm diệt tuyến trùng có khả năng hình thành bẫy như Arthrobotrys, Dactylaria, một số vừa có khả năng ký sinh trứng tuyến trùng và có cả khả năng bẫy như Nematoctonus, một số chi nấm khác ký sinh trứng của tuyến trùng như Drechmeria, Hirsutella, Haptoglossa, Catenaria, Paecilomyces [138]. Hình 1.2 khái quát sự tương tác giữa nấm sợi diệt tuyến trùng và tuyến trùng, các phương thức thu hút và diệt 7
tuyến trùng. Khi cảm nhận được tuyến trùng, nấm diệt tuyến trùng có thể phát triển các thiết bị bẫy khác nhau để bắt tuyến trùng. Nấm có thể trực tiếp lây nhiễm tuyến trùng bằng cách sử dụng bào tử dính. Ngoài ra, tuyến trùng cũng có phương thức chống lại nấm diệt tuyến trùng. Hình 1.2. Sự tương tác giữa tuyến trùng, nấm và vi khuẩn Chú thích: Nấm và vi khuẩn được coi là tác nhân gây bệnh cho tuyến trùng. SMP - sản phẩm trao đổi chất thứ cấp; UPR, đáp ứng protein; AMP - peptide kháng khuẩn [110]. 1.2.1. Vai trò của nấm diệt tuyến trùng trong kiểm soát sinh học Theo Cook và cs., (1993) kiểm soát sinh học là việc con người sử dụng các vi sinh vật đối kháng không gây bệnh để ức chế mầm gây bệnh theo cách thân thiện với môi trường [41]. Theo Hội đồng Nghiên cứu Quốc gia Hoa Kỳ, kiểm soát sinh học được định nghĩa là việc sử dụng các sinh vật biến đổi theo chọn lọc tự nhiên hoặc biến đổi gen hoặc các sản phẩm biến đổi gen của chúng để làm giảm tác hại của mầm bệnh [97]. 8