Luận án Tiến sĩ Sinh học: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn bản địa có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA để canh tác rau ở Sóc Trăng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:215

Thêm vào BST

Báo xấu

34
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài nhằm nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn bản địa có hai chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA trong các hệ IMO thu thập từ đất canh tác các loại cây trồng khác nhau ở tỉnh Sóc Trăng nhằm kích thích sinh trưởng, tăng năng suất cây rau muống, cây cải xanh và giảm lượng phân bón đạm khuyến cáo ở điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn bản địa có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA để canh tác rau ở Sóc Trăng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ THỊ XÃ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BẢN ĐỊA CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM VÀ TỔNG HỢP IAA ĐỂ CANH TÁC RAU Ở SÓC TRĂNG LUẬN ÁN NGHIÊN CỨU SINH CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH 62420201 NĂM 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ THỊ XÃ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BẢN ĐỊA CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM VÀ TỔNG HỢP IAA ĐỂ CANH TÁC RAU Ở SÓC TRĂNG LUẬN ÁN NGHIÊN CỨU SINH CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH 62420201 NGƢỜI HƢỚNG DẪN PGS.TS. NGUYỄN KHỞI NGHĨA TS. PHẠM NGỌC TÚ NĂM 2021
PHẦN KÝ DUYỆT Cần Thơ, ngày tháng năm 2021 NGƢỜI HƢỚNG DẪN CHÍNH NGHIÊN CỨU SINH PGS.TS. NGUYỄN KHỞI NGHĨA LÊ THỊ XÃ
LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành luận án tốt nghiệp, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi còn nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của nhiều cá nhân và tập thể. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến tập thể và những cá nhân có tên dưới đây đã góp sức để giúp đỡ tôi hoàn thành các nghiên cứu trong luận án này. Đầu tiên và quan trọng nhất, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới gia đình và những người thân yêu vì sự đồng hành, chia sẻ, nhẫn nại, tình yêu và cả sự hỗ trợ về tinh thần, tài chính trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu của tôi trong bốn năm qua. Xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến hai cán bộ hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Khởi Nghĩa-Phó trưởng bộ môn Khoa học Đất, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ và TS. Phạm Ngọc Tú-Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu long. Đặc biệt là PGS.TS. Nguyễn Khởi Nghĩa- người Thầy đã tận tình hướng dẫn, đóng góp ý kiến quý báu, hỗ trợ phương tiện nghiên cứu, đồng thời truyền đạt kinh nghiệm và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án cũng như quá trình viết báo khoa học. Xin gửi lời cảm ơn đến các em Nguyễn Thị Kiều Oanh, Ngô Thị Phương Thảo, Đỗ Thành Luân, Đặng Thị Yến Nhung, Nguyễn Thị Thu Hà, Nguyễn Hoàng Kim Nương là cán bộ nghiên cứu thuộc phòng thí nghiệm Vi sinh vật Đất, bộ môn Khoa học đất, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ cùng các em sinh viên ngành Khoa học Đất khoá 41 thuộc bộ môn Khoa học Đất, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ gồm Giang Yến Anh, Thị Hạnh Nguyên, Nguyễn Thị Thuý Cầm và em học viên cao học Quách Thị Trúc Ly ngành Sinh thái học khoá 24 thuộc bộ môn Sinh học, khoa Khoa học tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ tôi thực hiện các thí nghiệm trong nghiên cứu này. Xin cảm ơn các em Nguyễn Thị Kiều Anh nghiên cứu viên phòng thí nghiệm vi sinh vật đất, bộ môn Khoa học đất, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ, em Trần Hoàng Ty học viên cao học lớp Sinh thái học khoá 25 thuộc bộ môn Sinh học, khoa Khoa học tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ, em Lâm Thanh Tâm sinh viên ngành khoa học đất khoá 41 bộ môn Khoa học đất, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ, cùng các em sinh viên lớp Bảo vệ Thực vật khoá 43 thuộc bộ môn Bảo vệ thực vật, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ tôi trong các thí nghiệm nhà lưới và ngoài đồng. Xin cảm ơn các anh chị em nghiên cứu sinh khoá 2016-2020 thuộc viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là em nghiên cứu sinh Trần Võ Hải Đường đã động viên, chia sẻ kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành quyển luận án nghiên cứu sinh cũng như các loại hồ sơ trong suốt quá trình học tập.
Xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc, quý Thầy/Cô thuộc viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu, động viên và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Xin cảm ơn tập thể cán bộ, giảng viên, nghiên cứu viên phòng thí nghiệm Vi sinh vật Đất và phòng thí nghiệm Hoá học Đất thuộc bộ môn Khoa học Đất, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ đã chia sẻ kinh nghiệm, hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành các nghiên cứu trong luận án. Xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo các Sở Giáo dục và Đào tạo, Sở Nội Vụ tỉnh Sóc Trăng và Uỷ ban Nhân dân tỉnh Sóc Trăng đã tạo điều kiện để tôi được học tập và nghiên cứu nâng cao trình độ. Xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Khoa Sau Đại học và Ban giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi được học tập và nghiên cứu trong suốt năm năm qua dưới mái trường thân yêu này. Xin cảm ơn Ban giám hiệu, tập thể giảng viên và cán bộ trường Cao đẳng Sư phạm Sóc Trăng, trường Cao đẳng Cộng đồng Sóc Trăng đã động viên và tạo điều kiện cho tôi học tập, nghiên cứu trong thời gian qua. Xin trân trọng cảm ơn với tấm lòng thành kính nhất!
LỜI BẢN QUYỀN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân nghiên cứu sinh dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Nguyễn Khởi Nghĩa và TS. Phạm Ngọc Tú. Các số liệu trình bày trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu hay luận văn nào trước đây. Cán bộ hƣớng dẫn 1 Cán bộ hƣớng dẫn 2 Tác giả luận án PGS.TS. Nguyễn Khởi Nghĩa TS. Phạm Ngọc Tú Lê Thị Xã
TÓM LƢỢC Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm đánh giá hai chức năng cố định đạm và tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) của một số hệ vi sinh vật bản địa (indigenous microorganism-IMO) thu thập từ các hệ thống canh tác cây trồng khác nhau ở Sóc Trăng đồng thời phân lập, tuyển chọn những dòng vi khuẩn có 2 chức năng này trong các IMO có khả năng kích thích sinh trưởng, làm tăng năng suất rau muống và cải xanh trồng ở Sóc Trăng. Môi trường Burks khuyết đạm đã được sử dụng để phân lập vi khuẩn cố định đạm và phương pháp so màu phản ứng với thuốc thử phenol nitroprusside và Salkowski lần lượt để xác định hàm lượng đạm và IAA trong môi trường lỏng ở bước sóng 636 nm và 530 nm. Khả năng kích thích hạt nảy mầm và kích sinh trưởng cây rau muống và cây cải xanh của các dòng vi khuẩn và IMO tuyển chọn được đánh giá ở các điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy các hệ IMO thu thập từ các hệ thống cây trồng khác nhau ở tỉnh Sóc Trăng có sự đa dạng vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn. Trong đó vi khuẩn là nhóm hiện diện với mật số cao và đa dạng hơn hai nhóm còn lại. Ngoài ra, kết quả đã chỉ ra rằng không có sự hiện diện của nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột cho người như Salmonella, Shigella, E. coli và Coliform trong các hệ IMO thu thập. Đặc biệt, tất cả các hệ IMO khảo sát còn cho thấy chúng có chức năng tổng hợp IAA và cố định đạm vì có sự hiện diện của nhóm vi khuẩn mang gen nifH với mật số vi khuẩn cố định đạm dao động từ 106-108 cfu.g-1. Trong đó, Luận án đã phân lập được 44 dòng vi khuẩn có 2 chức năng cố định đạm, tổng hợp IAA và đã tuyển chọn được 10 dòng vi khuẩn tốt nhất chúng thuộc 5 chi: Bacillus, Klebsiella, Paenibacillus, Paraburkholderia và Pseudomonas. Kết quả đánh giá ở điều kiện phòng thí nghiệm cho thấy 5 hệ IMO tuyển chọn và 5 dòng vi khuẩn tuyển chọn gồm Paraburkholderia tropica TP-1.3, Paenibacillus cineris TP-1.4, Bacillus megaterium MQ-2.5, Klebsiella pneumoniae MT-16.5, và Bacillus megaterium OM-17.5, cho hiệu quả tương đương nhau trong kích thích gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt rau muống (14-15%) và hạt cải xanh (3-5%), cũng như làm tăng chiều cao thân, chiều dài rễ và sinh khối tươi cây rau. Kết quả thí nghiệm nhà lưới cho thấy dòng vi khuẩn tuyển chọn cho hiệu quả kích thích sinh trưởng tốt hơn các hệ IMO và trong đó 3 dòng vi khuẩn TP-1.3, TP-1.4 và MQ-2.5 giúp giảm 25% lượng phân đạm bón theo khuyến cáo nhưng vẫn cho năng suất cây rau tương đương với nghiệm thức bón 100% NPK khuyến cáo. Đặc biệt, ở điều kiện ngoài đồng ba dòng vi khuẩn tuyển chọn giúp tăng năng suất rau muống và cải xanh từ 10- 20% dù bón giảm 25% lượng đạm theo khuyến cáo, đồng thời còn giúp giảm lượng nitrate lưu tồn trong rau từ 40-60% so với nghiệm thức đối chứng. Tóm lại, có thể ứng dụng 3 dòng vi khuẩn TP-1.3, TP-1.4, MQ-2.5 và hỗn hợp của chúng trong canh tác rau sạch và rau an toàn ở tỉnh Sóc Trăng. Từ khoá: cải xanh, kích thích sinh trưởng cây trồng, rau muống, vi khuẩn cố định đạm, vi khuẩn tổng hợp IAA, vi sinh vật bản địa
ABSTRACT The main objective of this study was to evaluate some of basic functions of several indigenous microorganism (IMOs) collected from different crop farming systems in Soc Trang as well as to isolate and select indigenous bacteria capable of fixing nitrogen and synthesizing IAA from these IMOs for plant growth promotion, yield enhancement of water spinach, mustard green in Soc Trang province. N-free Burk’s medium was used to isolate nitrogen-fixing bacteria. Nitrogen and IAA concentrations in liquid media were determined by phenol nitroprusside and Salkowski's reagent method at a wavelength of 636 and 530 nm with the help of spectrophotometer, respectively. The seed germination rate, growth and yield performance testes were carried out under laboratory, greenhouse and field conditions. The results showed that all collected IMOs had a diversity of three main microbial groups including bacteria, fungi and actinomyces. In which, bacterial group was the most predominant one. Moreover, there was no presence of bacterial group causing human intestinal infections such as Salmonella, Shigella, E. coli and Coliform in all collected IMOs. Besides, all IMOs revealed their good abilities in biological nitrogen fixation, IAA synthesis. Especially, all IMOs were found the sequence of nifH gene with the number of N-fixing bacteria varied 106-108 cfu.g-1. Therefore, a total of 44 bacterial strains capable of both fixing nitrogen and synthesizing IAA were isolated and identified the most 10 outstanding bacteria, they belonged to 5 different genera including Bacillus, Klebsiella, Paenibacillus, Paraburkholderia, and Pseudomonas. The results of laboratory conditions test indicated that five selected IMO and the best 5 selected isolates included Paraburkholderia tropica TP-1.3, Paenibacillus cineris TP- 1.4, Bacillus megaterium MQ-2.5, Klebsiella pneumoniae MT-16.5 and Bacillus megaterium OM-17.5, equally effective in stimulating germination of water spinach seeds (14-15%) and mustard green seeds (3-5%), Besides, they also helped to increase stem height, root length and fresh biomass of water spinach and mustard green. The pot experiment showed that isolated strains were more effective than IMOs in stimulating growth, in which 3 strains, TP-1.3, TP-1.4, and MQ-2.5 were the best bacterial isolates identified as bio-stimulant agents in order to reduce 25% of the recommended chemical N fertilizer formula, but the yields, growth and development of vegetables were remained similar as 100% recommended NPK formula treatment. Particularly, in the field, three selected bacterial strains showed their benefit in increasing the vegetable yield by 10-20% and reducing of 25% chemical N fertilizer and also helped to reduce from 40 to 60% of the total nitrate in fresh vegetables. In short, these three outstanding bacterial isolates and their mixture can be exploited for safe and clean vegetable cultuvation in Soc Trang province. Key words: IAA synthesizing bacteria, indigenous microorganisms, mustard green, nitrogen fixing bacteria, plant growth promotion, water spinach
MỤC LỤC MỤC LỤC .......................................................................................................................i DANH SÁCH BẢNG ...................................................................................................vii DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................. .....x DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................................xii CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU ...................................................................................... .....1 1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1 1.2 Mục tiêu của đề tài .................................................................................................. 2 1.3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu .......................................................................... 2 1.4 Nội dung nghiên cứu................................................................................................ 3 1.5 Tính cấp thiết của luận án ...................................................................................... 3 1.6 Đóng góp mới của luận án ...................................................................................... 3 1.7 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án ........................................................... 4 CHƢƠNG 2 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ....................................................................... 6 2.1 Điều kiện địa lí và tự nhiên tỉnh Sóc Trăng .......................................................... 6 2.2 Định hƣớng phát triển cây rau ở Sóc Trăng ......................................................... 7 2.3 Tổng quan về cây rau .............................................................................................. 8 2.3.1 Giá trị dinh dưỡng .................................................................................................. 9 2.3.2 Giá trị kinh tế .......................................................................................................... 9 2.3.3 Yêu cầu về đất trồng, dinh dưỡng, phân bón và nước trong canh tác rau ............ 10 2.3.4 Nhu cầu đạm của rau ăn lá ................................................................................... 10 2.3.5 Cây rau muống ..................................................................................................... 11 2.3.6 Cây cải xanh ......................................................................................................... 11 2.4.Vai trò của vi sinh vật kích thích sinh trƣởng thực vật đối với cây trồng ....... 13 2.4.1 Vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật ............................................................. 13 2.4.2 Cố định đạm ......................................................................................................... 14 2.4.2.1 Định nghĩa quá trình cố định đạm .................................................................... 14 2.4.2.2 Enzyme nitrogenase trong quá trình cố định đạm ............................................ 15 2.4.2.3 Gen nif trong cố định đạm ................................................................................. 16 2.4.2.4 Cơ chế của quá trình cố định đạm .................................................................... 18 2.4.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định đạm ............................................ 19 2.4.2.6 Vi sinh vật cố định đạm ..................................................................................... 19 2.4.3 Tổng hợp indole-3-acetic acid .............................................................................. 26 2.4.3.1 Vai trò sinh lý của auxin .................................................................................... 26 2.4.3.2 Vi sinh vật tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) ................................................ 27 2.4.3.3 Các con đường tổng hợp IAA ở vi sinh vật ....................................................... 28 2.4.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp IAA........................................... 29 2.4.4 Các nghiên cứu, ứng dụng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA trong và ngoài nước .................................................................................................................... 31 2.4.4.1 Ngoài nước ........................................................................................................ 31 i
2.4.4.2 Trong nước ........................................................................................................ 32 2.5 Hệ vi sinh vật bản địa IMO .................................................................................. 34 2.5.1 Lịch sử nghiên cứu ............................................................................................... 34 2.5.2 Vai trò và chức năng của IMO đối với cây trồng ................................................. 34 2.5.3 Các nghiên cứu và ứng dụng IMO trong và ngoài nước ...................................... 36 2.5.3.1 Nghiên cứu và ứng dụng IMO ở các nước ........................................................ 36 2.5.3.2 Nghiên cứu và ứng dụng IMO ở Việt Nam ........................................................ 38 2.6 Đa dạng vi sinh vật ................................................................................................ 39 2.6.1 Khái niệm đa dạng vi sinh vật và vai trò đa dạng vi sinh vật trong đất ............... 39 2.6.2 Phương pháp đánh giá đa dạng vi sinh vật ........................................................... 40 2.6.2.1 Phương pháp truyền thống trong đánh giá đa dạng vi vinh vật ....................... 40 2.6.2.2 Phương pháp sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng vi sinh vật ................. 41 2.6.2.3 Phương pháp phân tích đa dạng vi sinh vật dựa vào giải trình tự acid nucleic đoạn gen mã hóa 16S-rRNA ............................................................................... 41 2.6.2.4 Phương pháp điện di theo gradient biến tính (DGGE và TGGE)..................... 42 CHƢƠNG 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP............................................... 45 3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu ........................................................................................ 45 3.1.1 Thời gian và địa điểm ........................................................................................... 45 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu............................................................................................... 45 3.1.3 Dụng cụ, thiết bị và hoá chất ................................................................................ 45 3.1.3.1 Dụng cụ.............................................................................................................. 45 3.1.3.2 Thiết bị ............................................................................................................... 45 3.1.3.3 Hoá chất ............................................................................................................ 46 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................................... 46 3.2.1 Nội dung 1: Khảo sát sự đa dạng nhóm vi sinh vật trong các hệ IMO thu thập .. 47 3.2.1.1 Thu thập nguồn vi sinh vật bản địa IMO........................................................... 47 3.2.1.2 Khảo sát sự đa dạng của các nhóm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong các hệ IMO bằng phương pháp PCR ............................................................................. 48 3.2.1.3 Đánh giá sự đa dạng vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong các hệ IMO thu thập bằng phương pháp nested-PCR kết hợp DGGE ................................................. 50 3.2.1.4 Khảo sát mật số vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong các hệ IMO thu thập ......... 52 3.2.1.5 Khảo sát sự hiện diện của một số vi khuẩn gây bệnh (Coliform, E. coli, Salmonella và Shigella) trong các hệ IMO thu thập .......................................... 53 3.2.2 Nội dung 2: Khảo sát và đánh giá một số chức năng kích thích sinh trưởng cây trồng của các hệ IMO thu thập ........................................................................... 54 3.2.2.1 Khảo sát khả năng tổng hợp hormone thực vật IAA của các hệ IMO thu thập 54 3.2.2.2 Khảo sát khả năng cố định đạm của các hệ IMO thu thập ............................... 55 3.2.3 Nội dung 3: Phân lập, tuyển chọn và định danh các dòng vi khuẩn bản địa có chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA từ các hệ IMO thu thập .................... 56 ii
3.2.3.1 Phân lập các dòng vi khuẩn bản địa có khả năng cố định đạm từ các hệ IMO thu thập ............................................................................................................... 56 3.2.3.2 Khảo sát khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn bản địa phân lập từ các hệ IMO trong môi trường nuôi cấy lỏng ............................................................ 57 3.2.3.3 Khảo sát sự hiện diện của gen nifH đối với các dòng vi khuẩn phân lập ......... 57 3.2.3.4 Khảo sát khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn cố định đạm đã tuyển chọn..................................................................................................................... 58 3.2.3.5 Giải trình tự gen 16S-rRNA của 10 dòng vi khuẩn có đồng thời hai chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA tuyển chọn ........................................................... 58 3.2.4 Nội dung 4: Đánh giá ảnh hưởng của một số dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA tuyển chọn và các hệ IMO chứa những dòng vi khuẩn tuyển chọn lên khả năng nảy mầm và sinh trưởng cây rau trong điều kiện phòng thí nghiệm .. 58 3.2.4.1 Ảnh hưởng của một số dòng vi khuẩn tuyển chọn lên khả năng nảy mầm và sinh trưởng cây rau muống và cây cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm ....... 59 3.2.4.2 Ảnh hưởng của một số hệ IMO tuyển chọn lên khả năng nảy mầm và sinh trưởng cây rau muống và cây cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm .............. 60 3.2.5 Nội dung 5: Đánh giá hiệu quả của 5 dòng vi khuẩn và 5 hệ IMO chứa những dòng vi khuẩn tuyển chọn lên khả năng sinh trưởng và năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện nhà lưới ............................................................................. 60 3.2.5.1 Chuẩn bị đất thí nghiệm .................................................................................... 60 3.2.5.2 Chuẩn bị nguồn vi sinh vật ................................................................................ 61 3.2.5.3 Bố trí thí nghiệm ................................................................................................ 62 3.2.5.4 Các chỉ tiêu theo dõi .......................................................................................... 64 3.2.6 Nội dung 6: Đánh giá hiệu quả của 3 dòng vi khuẩn và 2 IMO tuyển chọn lên sinh trưởng, năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện ngoài đồng ............ 64 3.2.6.1 Chuẩn bị nguồn vi sinh vật ................................................................................ 64 3.2.6.2 Chuẩn bị đất thí nghiệm .................................................................................... 65 3.2.6.3 Bố trí thí nghiệm ................................................................................................ 65 3.2.6.4 Các chỉ tiêu theo dõi .......................................................................................... 67 3.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu ..................................................................................... 69 CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN ..................................................................... 70 4.1 Nội dung 1: Sự đa dạng về nhóm vi sinh vật trong các hệ IMO thu thập........ 70 4.1.1 Đặc điểm sinh hóa của các hệ vi sinh vật bản địa thu thập .................................. 70 4.1.2 Sự hiện diện của vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong các hệ IMO thu thập ............ 70 4.1.3 Sự đa dạng hệ vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong IMO ......................................... 72 4.1.3.1 Đa dạng quần thể vi khuẩn ................................................................................ 72 4.1.3.2 Đa dạng quần thể nấm ...................................................................................... 74 4.1.3.3 Đa dạng quần thể xạ khuẩn ............................................................................... 75 4.1.4 Mật số vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong các hệ IMO thu thập............................ 76 4.1.4.1 Mật số vi khuẩn ................................................................................................. 77 iii
4.1.4.2 Mật số nấm ....................................................................................................... 78 4.1.4.3 Mật số xạ khuẩn ................................................................................................ 78 4.1.5 Sự hiện diện của vi khuẩn gây bệnh trong hệ IMO thu thập ................................ 79 4.2 Nội dung 2: Chức năng kích thích sinh trƣởng cây trồng của các hệ IMO thu thập..................................................................................................................... 81 4.2.1 Tổng hợp IAA ...................................................................................................... 81 4.2.2 Cố định đạm ......................................................................................................... 84 4.2.2.1 Gen chức năng nifH trong các hệ IMO ............................................................. 84 4.2.2.2 Khả năng cố định đạm sinh học của 20 hệ IMO trong môi trường Burk's lỏng85 4.3 Nội dung 3: Phân lập tuyển chọn và định danh các dòng vi khuẩn bản địa có chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA từ các hệ IMO thu thập ............. 87 4.3.1 Mật số vi khuẩn cố định đạm trong các hệ IMO .................................................. 87 4.3.2 Kết quả phân lập vi khuẩn cố định đạm từ các hệ IMO thu thập ......................... 88 4.3.3 Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn cố định đạm phân lập ................. 90 4.3.3.1 Hàm lượng đạm tổng số (Nts) ............................................................................ 90 4.3.3.2 Hàm lượng đạm hữu dụng (NH4+) .................................................................... 91 4.3.4 Gen nifH trong cấu trúc di truyền của một số dòng vi khuẩn cố định đạm tuyển chọn..................................................................................................................... 93 4.3.5 Khả năng tổng hợp IAA của 50 dòng vi khuẩn cố định đạm phân lập được tuyển chọn..................................................................................................................... 95 4.3.6 Kết quả giải trình tự gen 16S-rRNA của 10 dòng vi khuẩn tuyển chọn .............. 98 4.4 Nội dung 4: Ảnh hƣởng của một số dòng vi khuẩn tuyển chọn và các IMO chứa các dòng vi khuẩn này lên khả năng kích thích nảy mầm và sinh trƣởng rau muống và cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm .................. 102 4.4.1 Khả năng kích thích nảy mầm và sinh trưởng cây rau muống của 8 dòng vi khuẩn tuyển chọn ......................................................................................................... 102 4.4.1.1 Ảnh hưởng của mật số vi khuẩn lên khả năng nảy mầm hạt rau muống ........ 102 4.4.1.2 Ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn tuyển chọn lên khả năng kích thích sinh trưởng rau muống ............................................................................................. 104 4.4.2 Khả năng kích thích nảy mầm và sinh trưởng cây cải xanh của 5 dòng vi khuẩn106 4.4.2.1 Ảnh hưởng của các mức mật số vi khuẩn khác nhau lên khả năng nảy mầm hạt cải xanh ............................................................................................................. 106 4.4.2.2 Ảnh hưởng của 5 dòng vi khuẩn thử nghiệm lên sinh trưởng cây cải xanh .... 107 4.4.3 Khả năng kích thích nảy mầm và sinh trưởng cây rau muống của 5 hệ IMO tuyển chọn................................................................................................................... 109 4.4.3.1 Ảnh hưởng của mức pha loãng lên tỷ lệ nảy mầm hạt rau muống.................. 109 4.4.3.2 Ảnh hưởng của 5 hệ IMO tuyển chọn lên khả năng sinh trưởng cây rau muống110 4.4.4 Khả năng kích thích nảy mầm và sinh trưởng cây cải xanh của 5 hệ IMO tuyển chọn................................................................................................................... 111 4.4.4.1 Ảnh hưởng của mức pha loãng khác nhau lên tỷ lệ nảy mầm hạt cải xanh .... 111 iv
4.4.4.2 Ảnh hưởng của các hệ IMO lên khả năng sinh trưởng của cây cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm....................................................................................... 114 4.5 Nội dung 5: Hiệu quả của 5 dòng vi khuẩn tuyển chọn và 5 IMO chứa các dòng vi khuẩn tuyển chọn lên sinh trƣởng, năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện nhà lƣới............................................................................... 117 4.5.1 Sinh trưởng và năng suất rau muống trong nhà lưới .......................................... 117 4.5.1.1 Chiều cao cây rau muống ................................................................................ 117 4.5.1.2 Số lá rau muống............................................................................................... 119 4.5.1.3 Đường kính thân .............................................................................................. 120 4.5.1.4 Hàm lượng chlorophyll tổng số trong lá ......................................................... 121 4.5.1.5 Sinh khối tươi/chậu .......................................................................................... 122 4.5.2 Sinh trưởng và năng suất cải xanh trong nhà lưới .............................................. 125 4.5.2.1 Vụ cải xanh thứ nhất........................................................................................ 125 4.5.2.2 Vụ cải xanh thứ hai.......................................................................................... 127 4.6 Nội dung 6: Hiệu quả của 3 dòng vi khuẩn tuyển chọn và 2 IMO lên sinh trƣởng, năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện đồng ruộng ........... 131 4.6.1 Sinh trưởng và năng suất rau muống ở điều kiện đồng ruộng ........................... 131 4.6.1.1 Vụ rau muống thứ nhất .................................................................................... 131 4.6.1.2 Vụ rau muống thứ hai ...................................................................................... 135 4.6.2 Sinh trưởng và năng suất cải xanh ở điều kiện ngoài đồng ................................ 139 4.6.2.1 Vụ cải xanh thứ nhất ....................................................................................... 139 4.6.2.2 Vụ cải xanh thứ hai.......................................................................................... 142 CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 150 5.1 Kết luận ................................................................................................................ 150 5.2 Kiến nghị .............................................................................................................. 151 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 152 PHỤ LỤC ........................................................................................................................ 1 Danh mục các hóa chất sử dụng và nguồn gốc .............................................................. 2 Thành phần một số môi trường nuôi cấy vi sinh vật trong luận án ................................ 3 Thành phần các dung dịch sử dụng trong luận án .......................................................... 4 Thông tin chế phẩm vi sinh thương mại làm đối chứng ................................................. 5 pH của các IMO theo thời gian ...................................................................................... 6 Kết quả phân tích số nhóm loài vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn trong IMO ........................... 7 Hình thái khuẩn lạc và hình dạng tế bào 83 dòng vi khuẩn phân lập............................. 8 Hình dạng tế bào 10 dòng vi khuẩn tuyển chọn ở độ phóng đại 100X .......................... 9 Trình tự đoạn gen 16S-rRNA của 10 dòng vi khuẩn tuyển chọn ................................... 10 Ghi nhận tổng quan 5 vụ rau thí nghiệm trong nhà lưới .............................................. 11 Tổng hợp năng suất rau muống và cải xanh trong nhà lưới ......................................... 12 Kết quả đánh giá vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa trong rau qua 5 vụ rau trong nhà lưới ................................................................................................................... v
13 Ghi nhận tổng quan 4 vụ rau thí nghiệm ngoài đồng ................................................... 14 Tổng hợp năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện ngoài đồng ........................... 15 Tổng hợp hàm lượng nitrate trong 4 vụ rau thí nghiệm ở ngoài đồng ......................... 16 Kết quả đánh giá vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa trong rau qua 4 vụ thí nghiệm ngoài đồng .............................................................................................................. vi
DANH SÁCH BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 So sánh 2 hợp phần của enzyme nitrogenase 16 2.2 Vai trò của các gen nif trong quá trình cố định nitơ 17 3.1 Vị trí và địa điểm thu thập 19 hệ vi sinh vật bản địa IMO 48 3.2 Thành phần của PAGE 8% với nồng độ chất biến tính 40-60% 51 3.3 Một số đặc tính đất thí nghiệm nhà lưới 61 3.4 Thời gian bố trí các thí nghiệm rau muống và cải xanh trong nhà 61 lưới Bộ môn Khoa học đất, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ 3.5 Các nghiệm thức thí nghiệm cho cây rau muống được bố trí trong 62 nhà lưới 3.6 Các nghiệm thức thí nghiệm cho cây cải xanh được bố trí trong 63 nhà lưới 3.7 Lịch bón phân cho cây rau muống và cây cải xanh được bố trí 64 trong nhà lưới 3.8 Một số đặc tính đất trước khi bố trí thí nghiệm ngoài đồng tại xã 65 Trường Khánh, huyện Long Phú, tỉnh Sóc Trăng 3.9 Thông tin về thời gian bố trí các thí nghiệm rau muống và cải 65 xanh ngoài đồng tại xã Trường Khánh, huyện Long Phú, tỉnh Sóc Trăng 3.10 Thông tin chi tiết về các nghiệm thức thí nghiệm ngoài đồng cho 66 cây rau muống và cây cải xanh 3.11 Lịch bón phân cho cây rau muống và cải xanh trong thí nghiệm 67 ngoài đồng tại xã Trường Khánh, huyện Long Phú, tỉnh Sóc Trăng 4.1 Mật số vi sinh vật của 20 hệ IMO thu thập trên địa bàn tỉnh Sóc 77 Trăng sau 38 ngày lên men 4.2 Nồng độ IAA (mg.L-1) trong môi trường NBRIP lỏng bổ sung 82 tryptophan được tổng hợp bởi 20 hệ IMO thu thập sau 6 ngày nuôi cấy 4.3 Hàm lượng đạm tổng số tăng thêm trong môi trường Burks lỏng 85 sau 5 ngày nuôi cấy của các IMO thu thập 4.4 Mật số vi khuẩn cố định đạm trong các hệ IMO thu thập 87 4.5 Kết quả phân lập vi khuẩn trong 19 hệ IMO thu thập 88 4.6 Hàm lượng đạm tổng số và đạm hữu dụng tổng hợp bởi 83 dòng 92 vi khuẩn cố định đạm phân lập trong môi trường Burks lỏng 4.7 Nồng độ IAA tổng hợp bởi 50 dòng vi khuẩn cố định đạm tuyển 95 chọn trong môi trường Burks lỏng khuyết đạm có bổ sung 100 mg.L-1 tryptophan sau 10 ngày nuôi cấy vii
4.8 Sự tương đồng giữa 10 dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp 99 IAA được tuyển chọn so với các dòng vi khuẩn trên cơ sở dữ liệu NCBI 4.9 Ảnh hưởng mật số vi khuẩn lên tỷ lệ nảy mầm hạt rau muống sau 102 6 ngày thí nghiệm ở điều kiện phòng thí nghiệm 4.10 Ảnh hưởng của 8 dòng vi khuẩn tuyển chọn lên một số chỉ tiêu 105 sinh trưởng cây rau muống trên môi trường agar 1% ở điều kiện phòng thí nghiệm 4.11 Ảnh hưởng của mật số vi khuẩn lên tỷ lệ nảy mầm hạt cải xanh 106 sau 6 ngày chủng ở điều kiện phòng thí nghiệm 4.12 Ảnh hưởng của 5 dòng vi khuẩn tuyển chọn lên một số chỉ tiêu 108 sinh trưởng cây cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm 4.13 Ảnh hưởng các mức pha loãng hệ IMO lên tỷ lệ nảy mầm hạt rau 110 muống sau 6 ngày chủng ở điều kiện phòng thí nghiệm 4.14 Ảnh hưởng của 5 hệ IMO tuyển chọn lên một số chỉ tiêu sinh 111 trưởng cây rau muống ở mức nồng độ pha loãng 1000 lần ở điều kiện phòng thí nghiệm 4.15 Ảnh hưởng của các mức pha loãng hệ IMO lên tỷ lệ nảy mầm hạt 112 cải xanh sau 6 ngày chủng ở điều kiện phòng thí nghiệm 4.16 Ảnh hưởng của 5 hệ IMO tuyển chọn lên một số chỉ tiêu sinh 114 trưởng cây cải xanh ở nồng độ pha loãng 1000 lần ở điều kiện phòng thí nghiệm 4.17 Chiều cao cây rau muống qua 3 vụ thí nghiệm ở phòng thí 118 nghiệm 4.18 Số lá rau muống qua 3 vụ thí nghiệm ở điều kiện phòng thí 120 nghiệm 4.19 Đường kính cây rau muống qua 3 vụ thí nghiệm ở điều kiện 121 phòng thí nghiệm 4.20 Hàm lượng chlorophyll tổng số trong lá rau muống qua 3 vụ thí 122 nghiệm ở điều kiện phòng thí nghiệm 4.21 Trọng lượng tươi của rau muống (g/chậu) qua 3 vụ thí nghiệm ở 123 điều kiện nhà lưới 4.22 Một số chỉ tiêu nông học và sinh khối cây cải xanh qua 2 vụ thí 126 nghiệm trong chậu ở trong điều kiện nhà lưới 4.23 Một số chỉ tiêu nông học, năng suất và thành phần hóa học cây 133 rau muống trong vụ thí nghiệm 1 ở ngoài đồng tại Trường Khánh, Long Phú, Sóc Trăng sau 30 ngày gieo hạt 4.24 Một số chỉ tiêu nông học, năng suất và thành phần hóa học cây 136 rau muống trong vụ thí nghiệm 2 ở ngoài đồng tại Trường Khánh, Long Phú, Sóc Trăng sau 26 ngày gieo hạt viii
4.25 Một số chỉ tiêu nông học, năng suất và thành phần hóa học cây 140 cải xanh trong vụ thí nghiệm 1 ở ngoài đồng tại Trường Khánh, Long Phú, Sóc Trăng sau 30 ngày gieo hạt 4.26 Một số chỉ tiêu nông học, năng suất và thành phần hóa học cây 143 cải xanh trong vụ thí nghiệm 2 ở ngoài đồng tại Trường Khánh, Long Phú, Sóc Trăng sau 33 ngày gieo hạt ix
DANH SÁCH HÌNH Hình Tên hình Trang 2.1 Các chức năng kích thích sinh trưởng cây trồng của vi khuẩn 14 2.2 Cấu tạo và cơ chế hoạt động của enzyme nitrogenase 15 2.3 Bản đồ gen nif của vi khuẩn Klebsiella pneumoniae 18 2.4 Sơ đồ giả thuyết về hai con đường của quá trình cố định N2 18 2.5 Các dạng vi khuẩn Burkholderia 21 2.6 Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri 23 2.7 Các con đường tổng hợp IAA ở vi khuẩn 29 2.8 Các bước thu thập IMO từ môi trường đất 36 2.9 Các bước thực hiện phân tích đa dạng hệ vi sinh vật trong 42 DGGE 3.1 Sơ đồ tóm tắt các nội dung nghiên cứu của luận án 46 3.2 Tóm tắt quy trình thu mẫu IMO 47 3.3 Sơ đồ vị trí thu mẫu các hệ IMO 48 3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ngoài đồng tại xã Trường Khánh, 66 huyện Long Phú, tỉnh Sóc Trăng 3.5 Vị trí thu mẫu để xác định năng suất rau muống và cải xanh 68 trên mỗi lô thí nghiệm 4.1 Hình thái bên ngoài của hệ vi sinh vật bản địa IMO 70 4.2 Kết quả sản phẩm PCR bằng các cặp mồi đặc hiệu để nhận diện 71 nhóm vi sinh vật trong hệ IMO 4.3 Kết quả phân tích đa dạng thành phần vi khuẩn trong 14 hệ 73 IMO thu thập 4.4 Kết quả phân tích đa dạng thành phần nấm trong 14 hệ IMO 75 thu thập 4.5 Kết quả phân tích đa dạng thành phần xạ khuẩn trong 14 hệ 76 IMO thu thập 4.6 Kết quả kiểm tra sự hiện diện nhóm vi sinh vật gây bệnh trong 80 các hệ IMO thu thập 4.7 Nồng độ IAA được tổng hợp cao nhất bởi 20 hệ IMO thu thập 82 trong môi trường NBRIP có bổ sung tryptophan (100 mg.L-1) trong thời gian 6 ngày nuôi cấy 4.8 Kết quả PCR bằng các cặp mồi đặc hiệu polF/polR dùng để 84 nhận diện gen chức năng cố định đạm sinh học NifH của 20 hệ IMO thu thập 4.9 Sự đa dạng kích thước và hình thái khuẩn lạc của một số dòng 89 vi khuẩn cố định đạm đại diện trên môi trường Burks sau 5 ngày nuôi cấy x
4.10 Sự đa dạng hình thái tế bào của một số dòng vi khuẩn cố định 90 đạm đại diện trên môi trường Burks sau 5 ngày nuôi cấy ở độ phóng đại 100X 4.11 Kết quả PCR với cặp mồi polF/polR chuyên biệt cho gen nifH 94 có chức năng cố định đạm sinh học của 22 dòng vi khuẩn cố định đạm 4.12 Mối quan hệ di truyền giữa 10 dòng vi khuẩn cố định đạm và 101 tổng hợp IAA tuyển chọn dựa trên phương pháp phân tích UPGMA 4.13 Sự khác biệt về mặt hình thái giữa nghiệm thức có chủng và 104 không chủng vi khuẩn ở hạt và cây rau muống mầm 4.14 Tỷ lệ nảy mầm hạt cải xanh ở các nghiệm thức chủng vi khuẩn 107 ở mật số 107cfu.mL-1 sau 2 ngày thí nghiệm ở điều kiện phòng thí nghiệm 4.15 Tỷ lệ nảy mầm hạt cải xanh chủng IMO ở mức pha loãng 1.000 113 lần sau 2 ngày chủng 4.16 Sự xuất hiện nhiều lông hút ở rễ mầm cây cải khi được chủng 114 với IMO 4.17 Cây cải xanh ở các nghiệm thức thí nghiệm khác nhau ở thời 128 điểm 33 ngày sau khi gieo hạt của vụ cải thứ 2 xi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ ADN Acid Deoxyribonucleic APS Ammonium persulfate DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long IAA Indole-3-Acetic Acid IAM Indole-3-acetamide IAN Indole-3-acetonitrile IMO Indigenous Microorganism (hệ vi sinh vật bản địa) ITS Internal transcribed spacer KNF Korean Natural Farming LSB Lauryl Sulphate Broth PDA Potato Dextrose Agar PCR Polymerase Chain Reaction TAM Tryptamine TAE Tris-Acetic-EDTA TSB Tryptone Soya Broth TEMED Tetramethylethylenediamine TSO Tryptophan side-chain oxidase xii