Luận án tiến sĩ: Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trên gà

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:241

Thêm vào BST

Báo xấu

66
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài “Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trên gà” được thực hiện nhằm nghiên cứu tìm giải pháp mới thay thế sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi, nâng cao năng suất, hiệu quả trong chăn nuôi gà công nghiệp và giảm bớt nguy cơ lan rộng các dòng vi khuẩn đề kháng kháng sinh trong tự nhiên.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ: Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trên gà

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ THỊ HẢI YẾN TUYỂN CHỌN CHỦNG BACILLUS SUBTILIS ỨNG DỤNG TRONG PHÕNG BỆNH NHIỄM KHUẨN ĐƯỜNG TIÊU HÓA TRÊN GÀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI MÃ SỐ: 62 64 01 02 CẦN THƠ, 2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ THỊ HẢI YẾN TUYỂN CHỌN CHỦNG BACILLUS SUBTILIS ỨNG DỤNG TRONG PHÕNG BỆNH NHIỄM KHUẨN ĐƢỜNG TIÊU HÓA TRÊN GÀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI MÃ SỐ: 62 64 01 02 HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC HIỀN Cần Thơ, 2018
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành các nội dung trong luận văn tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng học hỏi của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiều từ quý thầy cô, bạn bè. Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến: PGS. TS Nguyễn Đức Hiền đã động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Quí thầy cô Bộ môn Thú y, khoa Nông nghiêp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Ban lãnh đạo Vemedim Corporation, Trung tâm nghiên cứu và phát triển Vemedim đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi học tập, nghiên cứu và nâng cao trình độ trong thời gian qua. Cty TNHH chăn nuôi một thành viên Vemedim đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được thực hiện các thí nghiệm. Xin chân thành cảm ơn tất cả bạn bè, các bạn đồng nghiệp, các anh, chị, em phòng Sản phẩm sinh học, Trung Tâm nghiên cứu và phát triển Vemedim đã hỗ trợ, chia sẻ và cung cấp thông tin giúp tôi hoàn thành luận án. Cảm ơn gia đình và những người thân đã động viên, chia sẻ và luôn sát cánh bên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài. ii
TÓM LƢỢC Đề tài “Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trên gà” được thực hiện với mục đích phân lập chủng vi khuẩn B. subtilis có tiềm năng probiotic thích hợp cho gia cầm từ đất và phân của trại gà. Nghiên cứu này nhằm tìm biện pháp mới thay thế kháng sinh trong phòng và trị bệnh, nâng cao năng suất, hiệu quả trong chăn nuôi gà công nghiệp, giảm bớt nguy cơ lan rộng các dòng vi khuẩn kháng kháng sinh trong tự nhiên. Đề tài đã phân lập được 296 chủng vi khuẩn từ 70 mẫu đất và 70 mẫu phân gà thu thập tại các trại gà thuộc 7 tỉnh, thành vùng ĐBSCL. Các chủng vi khuẩn này được chọn lọc qua kiểm định sinh lý, sinh hóa với các chỉ tiêu như: âm tính với lecithinase, dương tính với catalase, amylase, cellulase, VP (Voges- Proskauer), và chịu nhiệt cao (phát triển được ở 50oC); và được định danh bằng bộ kít API CH50B (Biomerieux-France) kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử giải trình tự gen 16S rRNA (sử dụng phần mềm BLAST so sánh trình tự gen trên cơ sở dữ liệu NCBI). Kết quả phân tích cho thấy đã chọn ra được 21 chủng vi khuẩn đạt chỉ tiêu về mặt sinh lý, sinh hóa theo yêu cầu và về mặt định danh có mức độ tương đồng của gene 16S rRNA cao (≥ 99%) với B. subtilis. Nhằm tuyển chọn chủng vi khuẩn có tiềm năng probiotic, 21 chủng B. subtilis tuyển chọn đã được khảo sát các đặc điểm đặc trưng cho vi khuẩn probiotic như: tính nhạy cảm kháng sinh (erythromycin, gentamycin, neomycin, oxytetracyclin, doxycyclin, colistin, sulfadimidin - trimethoprim, norfloxacin, enrofloxacin), tính chịu nhiệt (phát triển ở nhiệt độ từ 50-60oC), khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, lipase), khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh (E. coli, S. enterica, Staphylococcus spp., Streptococcus spp.), khả năng chịu pH acid dạ dày (pH 2,0), khả năng chịu muối mật 0,3%, khả năng bám dính (tự bám dính, bám dính với vi khuẩn gây bệnh, bám dính tế bào biểu mô ruột) và khả năng sống được trong đường tiêu hóa gà. Kết quả cho thấy trong 21 chủng vi khuẩn khảo sát, B. subtilis VL28 thể hiện tốt nhất các đặc tính probiotic, do vậy chủng này được chọn để sử dụng trong thử nghiệm thức ăn bổ sung probiotic cho gà. Vi khuẩn B. subtilis VL28 mật độ 107 CFU/g với liều lượng 5 g/kg thức ăn được bổ sung vào thức ăn cho gà ở độ tuổi 1-56 ngày cho thấy hiệu quả tăng trọng của gà đạt 11,7%, đồng thời lượng thức ăn sử dụng giảm 16,8% so với đối chứng nuôi bằng thức ăn không bổ sung vi khuẩn. Bên cạnh đó, gà 18 ngày tuổi lây nhiễm với S. enterica (liều 7,5x104 CFU/mL/gà) và E. coli (liều 5,0x106 CFU/mL/gà), được nuôi với thức ăn có bổ sung B. subtilis VL28 với liều như trên có khả năng tăng trọng và tỉ lệ sống tương đương với điều trị bằng kháng sinh enrofloxacin và iii
oxytetracyclin. Các kết quả này cho thấy chủng B. subtilis VL28 phân lập và tuyển chọn được trong đề tài này có tiềm năng probiotic rất lớn, chủng này có thể sử dụng để thay cho kháng sinh trong việc phòng và trị bệnh đường tiêu hóa ở gia cầm. Trình tự gen 16S rRNA của B. subtilis VL28 đã được đăng ký trên ngân hàng gen của NCBI với mã số truy cập là KY346980. Từ khóa: B. subtilis, gà, phân lập, định danh, probiotic iv
ABSTRACT The dissertation “Isolation of Bacillus subtilis and its application on the prevention of intestinal diseases in chicken” was carried out to isolate the B. subtilis strains with probiotic potential from soil and fecal samples at intensive chicken farms. This study aimed to find out alternatives for antibiotics in the prevention and treatment of intestinal diseases as well as to increase productivity and effectiveness in poultry industry and also to reduce the risks of spreading antibiotic resistant bacteria in nature. From 70 soil samples and 70 fecal samples of chicken farms from 7 provinces in the Mekong Delta, 296 similarly B. subtilis bacteria were isolated. These isolates were analyzed further for B. subtilis characteristics by physio- biological tests with the following criteria such as: negative in lecithinase, positive in catalase, amylase, cellulase, VP (Voges-Proskauer), and temperature tolerance (being able to grow at 50oC); and identified by the API CH50B kit (Biomerieux-France) in combination with the bio-molecular technique namely partial sequencing of 16S rRNA (using BLAST alignment with the known sequences on the NCBI genbank). The results showed that there were 21 isolates which satisfied the required physio-biochemical criteria, and the strain identification revealed that the similarity of gene 16S rRNA was high (≥ 99%) with B. subtilis. In order to select the B. subtilis strain with probiotic capabilities, 21 selected B. subtilis isolates were investigated further on the susceptibility to antibiotics (erythromycin, gentamycin, neomycin, oxytetracyclin, doxycyclin, colistin, sulfadimidin - trimethoprim, norfloxacin, enrofloxacin), temperature tolerance (being able to grow at 50-60oC), extracellular enzyme production (amylase, protease, lipase), bacterial pathogen inhibition properties (E. coli, S. enterica, Staphylococcus spp., Streptococcus spp.), tolerance to acidity of the gastric juice (pH 2,0) and 0.3% bile salts, adherence ability (autoaggregation, coaggregation, adherence to epithelial cells) and survival rate in gastro- intestinal environment. The results showed that among 21 isolates observed, the strain B. subtilis VL28 exposed the best probiotic capabilities. Consequently, this strain was chosen to use as a supplement for chicken feed. The B. subtilis VL28 (the density of 107 CFU/g and the dosage at 5 g/kg of feed) was supplemented in feed for the 1-56 day old chicken. The results showed that chicken growth increased by 11,7% and feed usage decreased by 16,8%, compared with the control groups without supplementing B. subtilis VL28. Furthermore, the 18 day old chicken, infected by S. enterica (with the dosage of 7,5x104CFU/mL/chicken) and by E. coli (with the dosage of 5,0x106 CFU/mL/chicken), then fed with v
B. subtilis VL28 (supplemented in feed with the above described dosage), had growth ability and mortality rate equivalent to control groups treated with enrofloxacin and oxytetracyclin. These results showed that the selected B. subtilis VL28 strain in our study has great probiotic potential and could be used to replace antibiotics for prevention and treatment of intestinal diseases in poultry. The 16S rRNA partial sequence of the new B. subtilis VL28 was registered in the Genbank of NCBI with the access code KY346980. Key words: B. subtilis, chicken, isolation, identification, probiotic vi
MỤC LỤC Lời cam kết kết quả......................................................................................... i Lời cảm ơn ..................................................................................................... ii Tóm lược ....................................................................................................... iii Abstract .......................................................................................................... v Danh sách bảng .............................................................................................. x Danh sách hình............................................................................................. xii Danh mục từ viết tắt..................................................................................... xv CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU ......................................................................... 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................... 1 1.2. Mục tiêu .................................................................................................. 1 1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .......................................................... 2 1.4. Những đóng góp mới của luận án ........................................................... 2 1.5. Ý nghĩa thực tiễn của luận án ................................................................ 2 CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU....... ……………………………..3 2.1. Tổng quan về probiotic ........................................................................ 3 2.1.1. Lịch sử probiotic .................................................................................. 3 2.1.2. Các định nghĩa về probiotic ................................................................. 3 2.1.3. Xu hướng sử dụng probiotic ................................................................ 4 2.1.4. Vai trò và cơ chế tác động của probiotic ............................................. 5 2.1.5. Cơ chế tác động của probiotic ở gia cầm ............................................ 8 2.1.6. Các chủng vi khuẩn thường dùng làm probiotic................................ 12 2.1.7. Các chỉ tiêu để chọn một vi sinh vật làm probiotic ........................... 13 2.1.8. Yêu cầu an toàn đối với các chủng vi sinh vật probiotic ................... 14 2.2. Tổng quan về Bacillus subtilis ............................................................ 15 2.2.1. Đặc điểm chung của giống Bacillus .................................................. 15 2.2.2. Đặc điểm loài Bacillus subtilis .......................................................... 16 vii
2.2.3. Dinh dưỡng và tăng trưởng ............................................................... 22 2.2.4. Các chất do B. subtilis sinh ra ............................................................ 23 2.2.5. Tính đối kháng của B. subtilis ........................................................... 25 2.2.6. Một số phương pháp nghiên cứu tính đối kháng của B. subtilis và vi sinh vật gây bệnh ................................................................................... 26 2.3. Hệ tiêu hóa và vi sinh vật đƣờng ruột ............................................... 27 2.3.1. Hệ tiêu hóa gia cầm và sự khác biệt so với động vật hữu nhũ .......... 27 2.3.2. Vi sinh vật đường ruột và tác động của chúng đến vật nuôi ............. 30 2.4. Một số vi khuẩn gây bệnh đƣờng tiêu hóa thƣờng gặp trên gà ...... 31 2.4.1. Salmonella ......................................................................................... 31 2.4.2. E. coli ................................................................................................. 36 2.4.3.Clostridium perfringens ...................................................................... 39 2.5. Một số nghiên cứu về probiotic trên thế giới và tại Việt Nam ....... 42 2.5.1. Trên thế giới ...................................................................................... 42 2.5.2. Tại Việt Nam .................................................................................... 43 2.6. Một số nghiên cứu ứng dụng B. subtilis ............................................ 44 2.6.1. B. subtilis ứng dụng cho người và vật nuôi ....................................... 44 2.6.2. B. subtilis sử dụng cho gia cầm ........................................................ 45 CHƢƠNG 3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 47 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................... 47 3.2. Phƣơng tiện nghiên cứu ..................................................................... 47 3.2.1. Vật liệu ............................................................................................... 47 3.2.2. Dụng cụ .............................................................................................. 47 3.2.3. Thiết bị .............................................................................................. 47 3.2.4. Hóa chất và môi trường phân lập nuôi cấy vi khuẩn ......................... 48 3.3. Nội dung nghiên cứu và phƣơng pháp nghiên cứu .......................... 49 3.3.1. Nội dung nghiên cứu.......................................................................... 49 3.3.2. Phân lập các chủng Bacillus subtilis .................................................. 50 viii
3.3.3. Tuyển chọn các chủng B. subtilis có đặc tính probiotic .................... 56 3.3.4. Đánh giá tính an toàn và tác dụng của chế phẩm trên gà .................. 61 3.4. Xử lý số liệu ......................................................................................... 65 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................ 66 4.1. Phân lập và định danh vi khuẩn Bacillus subtilis ............................ 66 4.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus spp............................................. 66 4.1.2. Kết quả định danh Bacillus spp ......................................................... 67 4.2. Kết quả khảo sát các đặc tính probiotic ........................................... 77 4.2.1. Kết quả khảo sát khả năng chịu nhiệt độ cao..................................... 77 4.2.2. Khả năng nhạy/ kháng kháng sinh .................................................... 78 4.2.3. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào .......................... 81 4.2.4. Khả năng đối kháng với các chủng vi sinh vật gây bệnh .................. 85 4.2.5. Khả năng chịu acid dạ dày và muối mật ............................................ 98 4.2.6. Khả năng bám dính ......................................................................... 104 4.2.7. Khả năng sống của vi khuẩn trong đường ruột gà ........................... 109 4.3. Kết quả thí nghiệm, đánh giá tác dụng của chế phẩm trên gà ..... 111 4.3.1. Kết quả thí nghiệm 1….................................................................... 111 4.3.2. Kết quả thí nghiệm 2 ....................................................................... 114 4.3.3. Kết quả thí nghiệm 3........................................................................ 123 4.4. Đăng ký trình tự B. subtilis trên Genbank…………………….....131 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................. 133 5.1. Kết luận .............................................................................................. 133 5.2. Đề nghị ............................................................................................... 134 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ.............................. 135 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................... 136 PHỤ LỤC ................................................................................................. 154 ix
DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1. Bậc phân loại của Bacillus subtilis ...................................................... 15 Bảng 2.2. Một số đặc điểm của Bacillus subtilis ................................................. 22 Bảng 2.3. Một số loại enzyme do B. subtilis sinh tổng hợp ................................ 23 Bảng 3.1. Phân bố mẫu ........................................................................................ 50 Bảng 3.2. Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR ..................................... 54 Bảng 3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 ..................................................................... 62 Bảng 3.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 ..................................................................... 64 Bảng 3.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 ..................................................................... 65 Bảng 4.1. Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào quan sát dưới kính hiển vi của 296 chủng vi khuẩn ............................................................................................. 66 Bảng 4.2. Kết quả sàng lọc vi khuẩn bằng các test sinh hóa ............................... 68 Bảng 4.3. Kết quả định danh 29 chủng vi khuẩn bằng kit API CH50B .............. 70 Bảng 4.4. Kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA .... 74 Bảng 4.5. Kết quả khảo sát khả năng chịu nhiệt của các chủng B. subtilis ......... 77 Bảng 4.6. Kết quả kháng sinh đồ của 21 chủng B. subtilis chọn lọc ................... 79 Bảng 4.7. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của 21 chủng B. subtilis ............... 81 Bảng 4.8. Kết quả hoạt lực enzyme amylase, protease, lipase của 10 chủng B. subtilis khảo sát ............................................................................................... 83 Bảng 4.9. Khoảng cách kháng khuẩn của các chủng B. subtilis bằng phương pháp kẻ vạch vuông góc .............................................................................................. 86 Bảng 4.10. Kết quả đối kháng trực tiếp của B. subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với E. coli ............................................................................................ 88 Bảng 4.11. Kết quả đối kháng trực tiếp của B. subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với S. enterica...................................................................................... 91 Bảng 4.12. Kết quả đối kháng trực tiếp của B. subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với Staphylococcus spp ....................................................................... 93 Bảng 4.13. Kết quả đối kháng trực tiếp của B. subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với Streptococcus spp. ........................................................................ 96 x
Bảng 4.14. Kết quả khảo sát acid- muối mật ở pH 4 và pH 5 ............................. 99 Bảng 4.15. Kết quả khảo sát acid- muối mật ở pH 3 ......................................... 101 Bảng 4.16. Kết quả khảo sát acid- muối mật ở pH 2 ......................................... 103 Bảng 4.17. Kết quả khảo sát khả năng tự bám dính .......................................... 105 Bảng 4.18. Kết quả khảo sát khả năng bám dính với E. coli và S. enterica ...... 107 Bảng 4.19. Khả năng sống của B. subtilis VL28 trong đường ruột gà .............. 109 Bảng 4.20. Tăng trọng, thức ăn tiêu thụ và FCR qua 8 tuần thí nghiệm ......... 112 Bảng 4.21. Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 1-14 ngày tuổi trong thí nghiệm 2 ............................................................................................................ 115 Bảng 4.22. Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 15- 28 ngày tuổi…117 Bảng 4.23. Tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 29-56 ngày tuổi trong thí nghiệm 2.......................................................................................................................... 120 Bảng 4.24. Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 1-56 ngày tuổi trong thí nghiệm 2 .............................................................................................. 122 Bảng 4.25. Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 1-14 ngày tuổi…...123 Bảng 4.26. Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 15- 28 ngày tuổi…124 Bảng 4.27. Kết quả test sinh hóa E. coli trên bệnh phẩm gan………………...127 Bảng 4.28. Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 29-56 ngày tuổi ở thí nghiệm 3 .................................................................................................... 129 Bảng 4.29. Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 1-56 ngày tuổi ở thí nghiệm 3 .................................................................................................... 130 xi
DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1. Biểu đồ về sự tăng trưởng trong sử dụng probiotic ............................... 4 Hình 2.2. Sơ đồ tổng hợp về vai trò và cơ chế của probiotic đối với sức khỏe ..... 8 Hình 2.3. Sơ đồ mô tả tác động qua lại giữa các vk probiotic và niêm mạc ruột . 9 Hình 2.4. Sự tương tác giữa các sản phẩm loại trừ cạnh tranh, probiotic hoặc chất kích thích miễn dịch, và khả năng miễn dịch đường ruột ở gia cầm ........... 11 Hình 2.5. Mô hình cấu tạo tế bào vi khuẩn Bacillus spp ..................................... 16 Hình 2.6. Mô hình các vị trí nhiễm sắc thể trên bộ gen B. subtilis...................... 17 Hình 2.7. Sơ đồ quá trình hình thành bào tử B. subtilis....................................... 19 Hình 2.8. Sự biệt hóa tế bào ở B. subtilis ............................................................ 21 Hình 2.9. Sơ đồ hệ tiêu hóa gà ............................................................................. 28 Hình 3.1. Sơ đồ sàng lọc, định danh vi khuẩn B. subtilis .................................... 55 Hình 3.2. Sơ đồ kiểm tra khả năng chịu acid dạ dày và muối mật của vi khuẩn B. subtilis………………………………………………………………………...59 Hình 3.3. Chuồng gà thí nghiệm………………………………………………...62 Hình 4.1. Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus spp. trên môi trường TSA và hình thái dưới kính hiển vi ................................................................................................. 67 Hình 4.2. Kết quả test sinh hóa ............................................................................ 69 Hình 4.3. Định danh bằng kit API CH50B .......................................................... 71 Hình 4.4. Sản phẩm PCR của các chủng B. subtilis trong nghiên cứu ................ 73 Hình 4.5. Sơ đồ chọn lọc và định danh vi khuẩn B. subtilis ................................ 76 Hình 4.6. Khả năng chịu nhiệt của các chủng B. subtilis phân lập...................... 78 Hình 4.7. Mức độ nhạy cảm kháng sinh của 21 chủng vi khuẩn B. subtilis…….80 Hình 4.8. Kết quả kháng sinh đồ của các chủng B. subtilis AG27 và VL28 ....... 81 Hình 4.9. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng B. subtilis AG27 ........... 82 Hình 4.10. Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh của các chủng B. subtilis .... 87 Hình 4.11. Hiệu quả kháng khuẩn của AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với E. coli ................................................................................................................... 90 xii
Hình 4.12. Hiệu quả đối kháng của AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với S. enterica ............................................................................................................ 92 Hình 4.13. Hiệu quả đối kháng của AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với Staphylococcus spp .............................................................................................. 94 Hình 4.14. Hiệu quả đối kháng của AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với Streptococcus spp ................................................................................................ 97 Hình 4.15. Hoạt tính đối kháng của VL28 với E. coli, S. enterica, Staphylococcus spp và Streptococcus spp. .......................................................... 98 Hình 4.16. Khả năng chịu pH 4 và 5 của các chủng B. subtilis......................... 100 Hình 4.17. Khả năng chịu pH 3 của các chủng B. subtilis ................................ 102 Hình 4.18. Khả năng chịu pH 2 của các chủng B. subtilis ................................ 104 Hình 4.19. Khả năng tự bám dính của các chủng B. subtilis ............................. 105 Hình 4.20. Khả năng bám dính với vi khuẩn gây bệnh của AG27 và VL28 ..... 108 Hình 4.21. Khả năng bám dính của 2 chủng VL28 và AG27 trong biểu mô ruột ............................................................................................................................ 108 Hình 4.22. Khả năng tồn tại của B. subtilis VL28 ở ruột non, manh tràng, và ruột già .......................................................................................................... 110 Hình 4.23. Tóm tắt quá trình phân lập và chọn lọc vi khuẩn probiotic……….111 Hình 4.24. Biểu đồ tăng trọng và FCR của gà qua các tuần ở thí nghiệm 1 ..... 113 Hình 4.25. FCR và tăng trọng ở giai đoạn 1-14 ngày tuổi của thí nghiệm 2 .... 116 Hình 4.26. Tăng trọng và FCR ở giai đoạn 15-28 ngày tuổi ............................. 118 Hình 4.27. Bệnh tích gà trong thí nghiệm gây nhiễm S. enterica ..................... 119 Hình 4.28. Khuẩn lạc S. enterica trên môi trường SS và kết quả test sinh hóa . 119 Hình 4.29. Kết quả giải trình tự vi khuẩn S. enterica phân lập từ lách gà bệnh 120 Hình 4.30. Tăng trọng và FCR ở giai đoạn 29-56 ngày tuổi ở thí nghiệm 2..... 121 Hình 4.31. Tăng trọng và FCR giai đoạn 15-28 ngày tuổi ở thí nghiệm 3 ........ 125 Hình 4.32. Bệnh tích gà trong thí nghiệm gây nhiễm E. coli ............................ 126 Hình 4.33. Khuẩn lạc E. coli trên môi trường Mac Conkey và EMB ............... 126 Hình 4.34. Test sinh hóa vi khuẩn E. coli .......................................................... 127 xiii
Hình 4.35. Kết quả giải trình tự vi khuẩn E. coli phân lập từ gan gà bệnh ....... 128 Hình 4.36. Tăng trọng và FCR ở giai đoạn 29-56 ngày tuổi ở thí nghiệm 3..... 129 Hình 4.37. Kết quả đăng ký trình tự gen B. subtilis VL28 trên ngân hàng gen NCBI…………………………………………………………………………..131 xiv
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ (tiếng Anh) Tiếng Việt APC Antigen presenting cells Tế bào trình diện kháng nguyên (tế bào đuôi gai hay đại thực bào) ATCC American Type Culture Collection Bảo tàng giống chuẩn Hoa Kỳ BAU Bacterial Amylase Units Đơn vị hoạt lực amylase của vi khuẩn CE Competitive exclusion Loại trừ cạnh tranh CFU Colony-forming unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc CLSI Clinical and Laboratory Viện Tiêu chuẩn lâm sàng và Standards Institute Xét nghiệm DSM Difco sporulation Medium Môi trường bào tử hóa FCR Feed conversion ratio Hệ số chuyển hóa thức ăn HE Hematoxylin- eosin Thuốc nhuộm tiêu bản mô MHA Mueller Hinton agar Môi trường làm kháng sinh đồ MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu NA Nutrient agar Thạch dinh dưỡng PBS Phosphate buffered saline Muối đệm phosphate PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp SC Secretory component Thành phần kích thích tiết immunoglobulin TCA Trichloroacetic acid Hóa chất dùng cho phản ứng kết tủa protein TSB Tryptone Soya Broth Môi trường dinh dưỡng xv
CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 . Tính cấp thiết của đề tài Sự phát triển mạnh mẽ của ngành chăn nuôi gà công nghiệp trong những thập niên gần đây đã mang lại nhiều lợi ích kinh tế - xã hội to lớn, nhưng cũng làm nảy sinh nhiều vấn đề cần được quan tâm xem xét. Một trong những vấn đề cần quan tâm giải quyết là việc sử dụng rộng rãi các chất kháng sinh để phòng bệnh và kích thích tăng trưởng trong chăn nuôi. Việc này đã làm gia tăng các dòng vi khuẩn kháng thuốc trong tự nhiên, có ảnh hưởng rất lớn tới hiệu quả sử dụng kháng sinh trong điều trị các bệnh viêm nhiễm trên người. Do vậy, nhiều nước tiên tiến đã quyết định hạn chế việc sử dụng các chất kháng sinh trong chăn nuôi. Để thay thế kháng sinh trong chăn nuôi, các nhà khoa học đã đưa ra nhiều giải pháp khác nhau trong đó có biện pháp sử dụng probiotic - những vi sinh vật sống hữu ích cho hoạt động tiêu hóa và có tác dụng tăng cường sức khỏe nói chung cho người và động vật. Bacillus subtilis là một vi khuẩn rất phổ biến trong tự nhiên, hầu như không có độc tính trên người cũng như nhiều loài động vật và có sức đề kháng cao với nhiều tác nhân vật lý và hóa học. Do vậy, từ lâu vi khuẩn này được chọn nghiên cứu để làm probiotic cho người và vật nuôi theo mô hình công nghiệp. Tuy nhiên, B. subtilis rất đa dạng về các đặc tính sinh học nên không phải tất cả các chủng đều có thể sử dụng làm probiotic và mỗi chủng probiotic chỉ phù hợp và có hiệu quả khi sử dụng cho một đối tượng nhất định. Đề tài “Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trên gà” được thực hiện nhằm nghiên cứu tìm giải pháp mới thay thế sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi, nâng cao năng suất, hiệu quả trong chăn nuôi gà công nghiệp và giảm bớt nguy cơ lan rộng các dòng vi khuẩn đề kháng kháng sinh trong tự nhiên. 1.2. Mục tiêu - Phân lập được ít nhất 01 chủng Bacillus subtilis tại một số tỉnh ĐBSCL có các đặc tính probiotic như: khả năng sinh enzyme tiêu hóa (amylase, protease, lipase); chịu được tác động của dịch tiêu hóa (dịch vị, muối mật), khả năng bám dính vào niêm mạc ruột và đối kháng với một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột (S. enterica, E. coli). - Xác định được liều dùng hiệu quả của chủng probiotic phân lập được trong phòng bệnh đường ruột ở gà do E. coli và S. enterica gây ra. 1
1.3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu - Đối tƣợng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis. - Phạm vi nghiên cứu: Các chủng Bacillus subtilis được phân lập từ đất và phân gà ở 7 tỉnh thành thuộc Đồng bằng sông Cửu Long, bao gồm: Cần Thơ, Hậu Giang, An Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp, Sóc Trăng, Kiên Giang. 1.4. Những đóng góp mới của luận án Luận án là công trình nghiên cứu đầu tiên chọn lọc được chủng B. subtilis bản địa có hiệu quả trong phòng bệnh đường tiêu hóa trên gà tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long, đặc biệt là bệnh do S. enterica và E. coli gây ra. - Đã phân lập và giám định chính xác 21 chủng B. subtilis bản địa từ phân và đất chuồng gà ở khu vực ĐBSCL và tuyển chọn được chủng B. subtilis VL28 có thể sử dụng làm probiotic trên gà. - Đã chứng minh bằng thực nghiệm việc bổ sung chủng B. subtilis VL28 7 10 CFU/g với liều 5 g/kg thức ăn có khả năng thay thế kháng sinh ngăn ngừa quá trình nhiễm trùng đường ruột ở đàn gà được gây nhiễm thực nghiệm với S. enterica và E. coli, đồng thời làm tăng mức tăng trưởng cũng như giảm hệ số chuyển hóa thức ăn so với gà đối chứng. - Đã được ngân hàng gen NCBI công nhận trình tự gen 16S rRNA của B. subtilis VL28 với mã số truy cập KY346980. (có thể truy cập trên trang web https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ky346980) - Là công trình nghiên cứu, phân lập, tuyển chọn vi khuẩn probiotic một cách hệ thống theo tiêu chuẩn Quốc tế. 1.5. Ý nghĩa thực tiễn của luận án Chọn lọc được chủng B. subtilis bản địa có tiềm năng dùng làm probiotic phù hợp với điều kiện chăn nuôi tại Đồng bằng sông Cửu Long. Kết quả nghiên cứu của đề tài dùng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm probiotic, phòng chống bệnh đường ruột gia cầm, làm tăng năng suất chăn nuôi đem lại lợi nhuận cao cho người chăn nuôi. Tạo cơ sở khoa học để đề xuất hạn chế sử dụng kháng sinh làm chất kích thích tăng trưởng và phòng bệnh trong chăn nuôi. Góp phần tạo được nguồn thịt gia cầm sạch, không tồn dư kháng sinh, bảo vệ sức khỏe cộng đồng. 2
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về probiotic 2.1.1. Lịch sử probiotic Nghiên cứu về probiotic bắt đầu được chú ý vào năm 1900 khi Tisser quan sát và thấy phân của những đứa trẻ tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe mạnh (Schillinger et al., 1996). Sau đó năm 1907, Metchnikoff đã chứng minh việc sử dụng Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dắc (Caucasians) ở Bulgaria là họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men (Metchnikoff E., 1907). Có thể nói Tisser và Metchikoff là những người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic. Năm 1930, Shirota phân lập các vi khuẩn lactic từ phân của các trẻ em khỏe mạnh (Cartwright, 2003). Cùng năm đó các nhà nghiên cứu Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm bệnh táo bón thường xuyên. Các nhà khoa học đại học Harvard phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất được. Khái niệm chung về probiotic xuất hiện ở Châu Âu vào những năm đầu của thập niên 80, ở Châu Á, nhiều năm sau các sản phẩm từ sữa lên men mới được du nhập vào và bắt đầu có khái niệm về probiotic (Cartwright, 2003). Cùng với sự phát triển của khoa học và công nghệ, đặc biệt là công nghệ sinh học, các nghiên cứu về probiotic ngày càng được mở rộng. Ngày nay probiotic đã được sử dụng rộng rãi trong dược phẩm, thực phẩm và chăn nuôi. 2.1.2. Các định nghĩa về probiotic Năm 1965, Lilley và Stillwell lần đầu tiên sử dụng thuật ngữ probiotic để mô tả những chất tiết ra từ vi sinh vật có khả năng kích thích sự phát triển của vi sinh vật khác (Grover and Luthra, 2011). Trải qua lịch sử định nghĩa probiotic ngày càng cụ thể hơn, như: “Probiotic là các chủng vi khuẩn sống mà chúng tác động có lợi cho sự cân bằng vi sinh vật đường ruột của động vật” (Marteau et al., 2002). 3