Luận văn : Nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi soma và tạo hạt nhân tạo ở cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp. ) part 2

Chia sẻ: Pkjd Opiuj | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

99
lượt xem 16
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Các phản ứng auxin và sự tăng trưởng có liên quan với vô số quá trình sinh lý và trao đổi chất khác và mối quan hệ nhân quả giữa auxin, ARN và chuyển hóa protein không phải hoàn toàn rõ ràng. Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với việc xử lý auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào, điều này xảy ra chỉ một vài phút sau khi xử lý. Một đặc trưng quan trọng là vách tế bào, là một vị trí quan trọng chịu sự tác động của các chất điều...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn : Nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi soma và tạo hạt nhân tạo ở cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp. ) part 2

11 Các phản ứng auxin và sự tăng trưởng có liên quan với vô số quá trình sinh lý và trao đổi chất khác và mối quan hệ nhân quả giữa auxin, ARN và chuyển hóa protein không phải hoàn toàn rõ ràng. Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với việc xử lý auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào, điều này xảy ra chỉ một vài phút sau khi xử lý. Một đặc trưng quan trọng là vách tế bào, là một vị trí quan trọng chịu sự tác động của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Torry và csv, 1981). Auxin làm giảm pH do kích thích sự bài xuất proton H+, pH hoạt hóa các enzym tác động nới lỏng vách tế bào và enzym tổng hợp vách tế bào, nhờ đó khởi động quá trình giản nở tế bào (Roger Prat, 1993). Auxin hoạt hóa sự sinh tổng hợp các hợp chất cao phân tử (protein, xenluloza, pectin, …) và ngăn cản sự phân giải chúng (Grodzinxki, 1981). (2) Cytokinin Đây là chất hoạt hóa sự phân chia tế bào (Mitsuhashi và csv, 1969; Mai Trần Ngọc Tiếng, 1989), đồng thời làm tăng quá trình chuyển hóa acid nucleic và protein (Vũ Văn Vụ và csv, 1993). Cytokinin được sử dụng khá nhiều trong kỹ thuật nuôi cấy mô, những chất thường được dùng là Kinetin và BA (Benzyl Adenin). Cytokinin phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nẩy mầm, làm tăng sự nở hoa. Cytokinin gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô bao gồm mô sẹo sinh trưởng (cals) trong mô nuôi cấy, hay việc tạo thành các mô bứu ở các cây gỗ lâu năm (Nester và csv, 1985; Taiz L. và csv, 1991). Cytokinin kích thích sự tổng hợp mới enzym Rubisco (Ribulozo-1,5-biphotphat cacboxylaza/oxygenaza) hoặc ở mức sao chép (làm tăng hoạt tính ARN-polymeraza) hoặc ở mức dịch mã (thành lập các polyriboxom) (Parthier, 1985). Ảnh hưởng của Cytokinin thấy rõ khi phối hợp sử dụng với auxin (Meredith và csv, 1970). Skoog và csv (1948) ghi nhận lượng benzyl amino purine cao có tác dụng kích thích sự tạo chồi, đồng thời ức chế sự phân hóa tạo rễ.
12  Thidiazuron [1-phenyl-3-(1,2,3-thidiazol-5-yl)urea] [TDZ] Thidiazuron [1-phenyl-3-(1,2,3-thidiazol-5-yl)urea] là một hóa chất tổng hợp dạng tinh thể thường tan trong ethanol và ít tan trong nước. Vào những năm 1970, TDZ được sử dụng như một thương phẩm làm rụng lá phục vụ cho quá trình thu hoạch bông vải. Đến gần đây, nó được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô do có hoạt tính cytokinin và auxin mạnh hơn hẳn các cytokinin và auxin cơ bản thông dụng khác. Về cấu trúc, phân tử TDZ khác hẳn các auxin và các cytokinin dạng adenin với hai nhóm chức năng khác nhau: phenyl và thidiazol. TDZ sẽ bị giảm hoạt tính khi bị thay thế bất kỳ một trong hai nhóm này bằng các vòng thơm khác (Murthy và csv, 1998). Đối với cây in vitro, TDZ được thấy là có khả năng thay thế cả cytokinin và auxin hoặc kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác nhau để kích hoạt các quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô. - Tạo mô sẹo: thông thường auxin được dùng để cảm ứng sự phân chia tế bào và tăng trưởng mô sẹo. TDZ cũng có khả năng cảm ứng tạo mô sẹo ở nhiều hệ thống nuôi cấy khác nhau với tốc độ tăng sinh tế bào cao hơn nhiều các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác, có khi lên đến 30 lần. Tuy nhiên mô sẹo thường hấp thu TDZ ít hơn các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác, có lẽ do hoạt tính của TDZ khá cao. Không có nhiều tài liệu nói về dạng mô sẹo tạo bởi TDZ, ngoài một số tài liệu cho rằng TDZ có khuynh hướng tạo mô sẹo xanh với những tế bào kích thước nhỏ, xếp chặt chẽ. - Tạo chồi: có khá nhiều loại cây được tạo chồi bằng TDZ, đặc biệt hiệu quả trên nhiều giống cây thân gỗ, ví dụ như Bạch đàn (Chen và csv, 1995). TDZ kích thích tạo chồi trực tiếp khi nuôi cấy tế bào lớp mỏng, ví dụ trên cây đậu Phaseolus vulgaris L. (Bui và csv, 2000). TDZ thúc đẩy sự biệt hóa các trung tâm tăng trưởng, làm giảm
13 sự ngủ của các đỉnh sinh trưởng ngọn, dẫn đến sự hình thành chồi bên và chồi bất định trực tiếp từ mô cấy. - TDZ được sử dụng trong quá trình tạo chồi (đặc biệt ở cây thân gỗ) với nồng độ rất cao. Điển hình như báo cáo tạo phôi trên cây măng cụt bằng nồng độ TDZ lên đến 2,25mM (Te-Chato và Lim, 1999) - Sinh phôi: Người ta thấy rằng TDZ, có thể thay thế cho auxin hoặc tổ hợp auxin và cytokinin trong sự hình thành phôi ở nhiều loài cây khác nhau như thuốc lá (Gill và Saxena, 1993), đậu xanh (Murthy và csv, 1995), cây phong lữ (Visser và csv, 1992), neem (Murthy và Saxena, 1998), cacao (Li và csv, 1998), … thường là với tỷ lệ sinh phôi cao hơn so với các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác. Do tính chất này của TDZ, nên ngoài hoạt tính của cytokinin đã được đề cập nhiều, người ta cho rằng, TDZ có ảnh hưởng đến quá trình biến dưỡng auxin. Victor và csv (1999) đã cũng cố cho giả thiết này bằng một khảo sát so sánh hoạt tính phát sinh hình thái của BAP và TDZ trên cây đậu phộng, ghi nhận sự khác biệt trong hoạt tính là TDZ có khả năng sinh phôi vô tính, trong BAP không có khả năng này. - Nuôi cấy protoplast: TDZ kết hợp với auxin (NAA; 2,4-D; NOA) được sử dụng trong giai đoạn hình thành vách tế bào xung quanh protoplast, khởi đầu cho sự phân chia tế bào (Chupeau và csv, 1993; Reustle và csv, 1995) và trong giai đoạn tiếp theo tái sinh từ mô sẹo có nguồn gốc protoplast (Lenzner và csv, 1995). Nhiều báo cáo khác nhau cho thấy, TDZ ở nồng độ thấp có hiệu quả cao hơn hẳn so với các cytokinin khác. - Tạo chồi ngoài vườn ươm : Ngoài các tác dụng sinh chồi in vitro, TDZ còn có tác dụng kích thích tạo chồi trên cây khi được phun hoặc xử lý vào đất trong vườn ươm, chủ yếu là tạo chồi bất định từ rễ hoặc phần dưới thấp của cây. Đi cùng với những ưu điểm trên, nhược điểm của TDZ cũng được ghi nhận, bao gồm : thủy tinh hóa chồi tái sinh (Debergh và csv, 1992; Briggs và csv, 1988; Causineu và Donnelly, 1991); biến dị hình dạng lá (van Niewkerk và csv, 1986; Cambecedes và csv, 1991); chồi chặt và ngắn (Fasolo và csv, 1989; Meyer và van Staden, 1988); sự khó khăn trong việc kéo dài và ra rễ chồi tái sinh.
14 2.3.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon Trong môi trường nuôi cấy, các mô không có khả năng tự dưỡng do không quang hợp đầy đủ trong điều kiện thiếu sự trao đổi khí với bên ngoài, do vậy cần cung cấp đường để giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp các chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối. Các loại đường thường được sử dụng là sucrose, d-glucose, d- fructose (Doods và Roberts, 1987). Sucrose là nguồn carbon được sử rụng rộng rãi nhất cho các loại cây, nồng độ sucrose thay đổi từ 2%-12% hoặc cao hơn tùy thuộc vào giống và tuổi phôi cấy. 2.3.3 Ảnh hưởng của nước dừa Nước dừa (CW-coconut water) thêm vào môi trường với lượng thích hợp sẽ kích thích sự phát triển của chồi bên cũng như sự hình thành cây con (Urata và Iwanaga, 1965; Scully, 1966; Tanaka và Sakanishi, 1978). Từ việc sử dụng CW, nhiều mô thực vật được nghiền tách dịch chiết và bổ sung vào môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích sự phát triển phôi như nội nhũ bắp, chà là, chuối, mầm đậu, mầm lúa mì, nước chiết cà chua … nhưng thông thường các dịch chiết chỉ có tác dụng trên các loài cây trồng không cùng nguồn gốc (Trần Văn Minh, 2002). Hoạt tính của CW khác BAP, tuy nhiên có thể thay thế được BAP. Van Overbeek và csv (1941) cho thấy CW kích thích sự phân chia tế bào của mô cây cà độc dược (Datura solanaceae) trong môi trường nuôi cấy. Theo Vũ Văn Vụ và csv (1993), trong CW khá giàu các hợp chất nitơ dạng khử như các acid amin, ngoài ra trong CW còn chứa các hormon sinh trưởng như cytokinine. Theo sự phân tích thành phần dinh dưỡng của Tổ chức Y tế Thế giới, thì trong CW có chứa protein, cacbohydrat, canxi, sắt và một số vitamin như thiamin, riboflavin, niacin, acid ascorbic và đường. Ảnh hưởng của than hoạt tính 2.3.4 Phải có những thực nghiệm xác định nồng độ than hoạt tính thích hợp cho quá trình nuôi cấy. Than hoạt tính thêm vào môi trường kích thích sự phát triển phôi của cây bắp, jujube và đu đủ.
15 2.3.5 Ảnh hưởng của độ pH và Agar pH của môi trường nuôi cấy thường ở khoảng 6, thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7 đều ức chế sự phát triển của mô (Nguyễn Văn Uyển, 1993 và Bùi Bá Bổng, 1995). Các mô thực vật đều được cấy trên môi trường agar. Agar thường được sử dụng ở nồng độ 6-10 g/lít, nồng độ agar tốt nhất cho sự phát triển của mô cấy là 8g/lít (Ribeiro và csv, 2000). 2.3.6 Ảnh hưởng của các điều kiện vật lý Ánh sáng cần thiết cho sự phát sinh hình thái của mô cấy. Trong tạo chồi ban đầu và nhân chồi tiếp theo, cường độ ánh sáng chỉ cần trong khoảng 1.000 lux. Nhưng trong giai đoạn tạo rễ, cây cần chiếu sáng ở cường độ cao từ 3.000-10.000 lux để kích thích cây chuyển từ giai đoạn dị dưỡng sang tự dưỡng có khả năng quang hợp. Dưới cường độ ánh sáng cao, cây lùn và có màu xanh hơi giảm nhưng có tỷ lệ sống sót cao khi chuyển sang môi trường đất. Chưa có nhiều nghiên cứu về chế độ sáng trong môi trường cấy mô, nhưng thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày của bóng đèn néon huỳnh quang là thích hợp cho sự phát triển mô cấy của nhiều loài. Cấy phôi thường không sử dụng ánh sáng đèn. Theo Scozzoli và Pasini, 1992; Pinto và csv, 1994, cấy phôi đào nên để trong tối 14 ngày. Tương tự, ở cây bơ nên để 21 ngày trong tối ở nhiệt độ 210C (Lano và csv, 1995). Ngoài ra, để mô cấy phát triển tốt thì môi trường nuôi cấy phải thông thoáng và có nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ trong phòng nuôi cấy thường được giữ ở 25 -28oC (Nguyễn Văn Uyển, 1993).
16 2.3 Nuôi cấy phát sinh mô sẹo 2.4.1 Sự hình thành mô sẹo Hình 2.2 Mô sẹo lan Hồ Điệp Mô sẹo là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức, có hình dạng không nhất định, do không có lớp nhu mô. Mô sẹo được hình thành từ mặt cắt của thân hay rễ, bao gồm tế bào nhu mô và thành phần tế bào rây (Esau, 1977). Mô sẹo hình thành ở hầu hết các bộ phận của cây (thân, lá, rễ), khi nơi đó có vết cắt (Street, 1969). Điều quan trọng được nhận thấy ở đặc tính của mô sẹo là mô sẹo phát triển không theo quy luật nhưng có khả năng biệt hóa thành rễ, chồi hoặc phôi để có thể hình thành cây hoàn chỉnh. Đặc điểm sinh trưởng của mô sẹo có quan hệ với cơ quan hình thành mô sẹo, thành phần môi trường nuôi cấy, và điều kiện nuôi cấy. Sự hình thành mô sẹo chia ra 3 giai đoạn : phát sinh mô sẹo, phân chia tế bào và biệt hóa. - Trong pha phát sinh mô sẹo, sự trao đổi chất kích thích tế bào chuẩn bị phân chia, giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của mô được đưa vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. - Tế bào đi vào giai đoạn phân chia tăng sinh khối. - Tế bào đi vào quá trình biệt hóa, xuất hiện sự biệt hóa tế bào và sự xuất hiện các con đường trao đổi chất dẫn đến sự sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học (Trần Văn Minh, 2003). Mô sẹo thường có màu vàng trắng, xanh hay màu sắc tố
17 anthocyanin. Sự biệt hóa của tế bào hình thành những chất liệu cấu tạo nhu mô các loại, các tế bào rây… hơn nữa hình thành vùng mô phân sinh, trung tâm của sự tạo nên chồi và rễ. Nhiều nhà khoa học cho rằng, mô sẹo được tạo ra từ những mô hay cơ quan có chứa diệp lục có khả năng quang tự dưỡng (Street, 1969). Hildebrandt và csv. (1963) cho rằng, mô sẹo có chứa diệp lục phụ thuộc vào lượng đường bổ sung trong môi trường và cường độ ánh sáng. Có nhiều yếu tố ảnh đến khả năng quang tự dưỡng của những tế bào có chứa diệp lục (tế bào có màu xanh) như : cường độ ánh sáng mạnh, ánh sáng màu xang cần thiết cho sự biệt hóa diệp lục và sự hình thành các enzym, đường thấp, auxin thấp, CO2 cao, và tăng hàm lượng phosphate (Barz và Husemann, 1982), và những tế bào quang tự dưỡng này có khả năng cố định 14CO2 bằng chu trình Calvin mặc dù có sự xuất hiện của các acid hữu cơ 4 carbon (Yamada và csv, 1982). Một vấn đề quan tâm trong nuôi cấy mô sẹo là sự biến tính tế bào. Sự biến tính này xảy ra do : độ già của mẫu, sự thay đổi tế bào chất của nhân, tế bào đa bội thể có số lượng DNA cao, thời gian duy trì nuôi cấy mô sẹo, điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường nhất là hormon ( Trần Văn Minh, 2003). Để tạo mô sẹo trong môi trường nuôi cấy có bổ sung chất sinh trưởng, đôi khi có dịch chiết (Trần Văn Minh, 2003). Phụ thuộc vào từng loại mô nuôi cấy mà chất sinh trưởng thêm vào có khác nhau (Trần Văn Minh, 2003). Chất hormon thường tổ hợp thành 4 nhóm : (1) Auxin. (2) Cytokinin. (3) Auxin + Cytokinin. Dịch Chiết. (4) Sau khi mô sẹo hình thành, mô sẹo được cấy chuyền. Môi trường cấy chuyền cũng giống như môi trường tạo mô sẹo nhưng chất sinh trưởng được giảm nồng độ. Kích thước tách mô sẹo nhỏ vừa phải để tế bào phát triển mạnh nhất, thường cụm mô sẹo có trọng lượng là 20-100mg, thời gian giữa hai lần cấy chuyền là 20-30 ngày phụ thuộc vào từng loại mô sẹo. Trong quá trình phát triển mô sẹo thường xuất hiện 2 loại tế bào : (1) Loại tế bào xốp, có không bào to, nhân nhỏ và tế bào chất loãng.
18 (2) Loại tế bào chặt, có không bào nhỏ, nhân to và tế bào chất đậm đặc. Mô sẹo cấy chuyền càng nhiều lần thì khả năng tái sinh càng giảm. Ngoài ra, nếu sau thời gian dài không cấy chuyền thì mô sẹo sẽ hoá nâu và chết. Hình 2.3 Mô sẹo hoá nâu 2.4.2 Sự phát triển của tế bào mô sẹo Giống thực vật cổ điển được sử dụng trong nghiên cứu p hát sinh cơ quan là thuốc lá (Skoog và Miller, 1957). Bước đầu tiên trong nghiên cứu tái sinh là tạo mô sẹo. Mô nuôi cấy cho thấy tiêu biểu của sự phân chia tế bào, những chức năng đặc biệt của tế bào, và sự hình thành cơ quan như cấu trúc của hệ thống mạch dẫn. Sự hình thành mô sẹo từ mô nuôi cấy cho thấy có sự phân chia tế bào, những tế bào ít có tính chuyên biệt và mất khả năng hình thành cấu trúc cơ quan (Trần Văn Minh, 2003). Khi cấy chuyền mô sẹo trên môi trường agar, tế bào mô sẹo phát triển theo hình chữ S. Có 5 pha trong sự phát triển mô sẹo : pha Lag : tế bào chuẩn bị phân chia. (1) pha Exponential : tốc độ phân chia tế bào cao nhất. (2) pha Linear : tế bào phân chia chậm lại và phát triển kích thước. (3) pha Deceleration : tốc độ phân chia và kéo dài tế bào giảm. (4) pha Stationary: số lượng và kích thước tế bào ổn định. (5) Sự phát triển của mô sẹo có thể đo được trọng lượng tươi. Đo trọng lượng khô cho thấy chính xác hơn trọng lượng tươi, nhưng đòi hỏi mẫu phải đồng nhất. Đo đếm sự phân bào nguyên nhiễm.
19 2.3.6.1 Sự tái sinh chồi từ mô sẹo Theo Thomas và Davey (1975) (trích dẫn bởi Trần Văn Minh, 2003) sự hình thành chồi từ mô sẹo được kích thích bởi : - Các chất sinh trưởng đưa vào môi trường. - Chất được sản sinh ra trong nuôi cấy mô sẹo. - Các chất có chứa sẵn trong mẫu nuôi cấy. Khả năng hình thành chồi từ mô sẹo phụ thuộc vào số lần cấy chuyền mà các chất có trong mẫu không có khả năng tổng hợp trong thời gian dài (Gautheret,1959) và sự hình thành tế bào xốp (Trần Văn Minh, 2003). Hình 2.4 Chồi lan Hồ Điệp tái sinh từ mô sẹo Sự hình thành chồi được điều khiển bằng hóa chất (Skoog, 1944). Theo Trần Thanh Vân và Trinh (1978) sự hình thành chồi được điều khiển bằng : - Tỷ lệ ctytokinin /auxin từ 10-100. - Carbohydrate như sucrose và các chất hữu cơ như casein hydrolysate. - Điều kiện nuôi cấy. - Dịch chiết. Tạo rễ cần auxin, đường, khoáng, nhiệt độ, ánh sáng… (Gautheret, 1959). Adenine sulfate có tác dụng cản trở auxin. GA3 cản trở sinh tổng hợp và tích lũy hạt tinh bột, cần thiết trong hình thành chồi.
20 2.4 Phôi vô tính Lịch sử nghiên cứu 2.5.1 Bắt đầu từ 1958, Street và Reinert đã mô tả sự hình thành phôi vô tính từ các tế bào đơn của cà rốt. Sau đó, vào 1977, Murashige đưa ra ý kiến tạo phôi vô tính có thể trở thành biện pháp vi nhân giống. và tiếp tục cho đến nay thì công nghệ phôi vô tính được xem là rất có triển vọng cho nông nghiệp thế kỷ 21. Hình 2.5 Phôi vô tính lan Hồ Điệp Khái niệm về phôi vô tính 2.5.2 Phôi vô tính hay phôi soma là các thể nhân giống (propagule) có cực tính bắt nguồn từ các tế bào dinh dưỡng, bao gồm cả phần mô phân sinh ngọn và mô phân sinh gốc, do đó có thể hình thành chồi và rễ. Không giống như các tế bào eukaryote, hầu hết tế bào thực vật đều có khả năng phát triển thành phôi dưới những diều kiện nhất định. Williams và Maheswaran (1986) đã cho rằng phôi vô tính có thể được hình thành từ một tế bào đơn hay từ cả một cụm tế bào phôi. tiến trình này khác với những quá trình tự nhiên khác và được gọi là quá trình hình thành phôi vô tính. Phôi vô tính rất giống phôi hữu tính ở hình thái và sinh lí nhưng không có quá trình tái tổ hợp di truyền do phôi vô tính không phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao tử đực và giao tử cái. Do đó tất cả những cây con tái sinh bằng con đường này thì có vật chất di truyền giống hệt các tế bào sinh dưỡng đã sinh ra chúng (Nguyễn Văn Uyển, 1992). Đặc tính này của phôi sinh dưỡng không những cho phép thực hiện sự