Luận văn:Nghiên cứu thu nhận chế phẩm amylase từ bacillus amyloliquefaciens T9

Chia sẻ: Nguyen Vang | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:25

Thêm vào BST

Báo xấu

165
lượt xem 35
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Enzyme giữ vai trò cực kì quan trọng trong ngành công nghệ sinh học hiện đại, hiện nay việc sản xuất và ứng dụng các chế phẩm enzym đang phát triển rất mạnh mẽ. Nước ta là một nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm rất thuận lợi cho sự phát triển của sinh vật. Vì thế ngành công nghiệp sản xuất các chế phẩm enzym và ứng dụng chúng ở nước ta hiện nay rất phát triển, trong đó hệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi ở nhiều lĩnh vực...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn:Nghiên cứu thu nhận chế phẩm amylase từ bacillus amyloliquefaciens T9

1 B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O Đ I H C ĐÀ N NG TR N TH ÁI LUY N NGHIÊN C U THU NH N CH PH M AMYLASE T BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS T9 Chuyên ngành : Công ngh th c ph m và ñ u ng Mã s : 60.54.02 TÓM T T LU N VĂN TH C SĨ K THU T Đà N ng - Năm 2011
2 Công trình ñư c hoàn thành t i: Đ I H C ĐÀ N NG Ngư i hư ng d n khoa h c: PGS. TS. Tr n Th Xô Ph n bi n 1: PGS.TS. Trương Th Minh H nh Ph n bi n 2: PGS.TS. Lê Th Liên Thanh Lu n văn s ñư c b o v t i H i ñ ng ch m lu n văn t t nghi p th c sĩ k thu t h p t i Đ i h c Đà N ng vào ngày 26 tháng 7 năm 2011 * Có th tìm lu n văn t i: - Trung tâm Thông tin - H c li u Đ i h c Đà N ng - Trung tâm H c li u, Đ i h c Đà N ng.
3 M Đ U 1. Tính c p thi t c a lu n văn Trong nh ng năm g n ñây, vi c nghiên c u c i thi n các ñi u ki n nuôi c y nh m thu nh n enzyme có ho t tính cao và t ñó s d ng chúng trong s n xu t công nghi p không còn là m i ñ c bi t là enzyme amylase. Song v n ñ ñ t ra là giá thành c a các ch ph m này tương ñ i cao – ñây chính là m t trong nh ng tr ng i cho vi c ng d ng enzyme r ng rãi trong quá trình s n xu t. M t trong nh ng cách làm gi m giá thành ch ph m enzyme là thay th ngu n nguyên li u ñ c trưng trong phòng thí nghi m b ng các ngu n nguyên li u t nhiên r ti n. Và th c t , chúng ñang ñư c s d ng r ng rãi cho c quá trình lên men l ng và r n không ngoài m c ñích này. Đ i v i nư c ta, các s n ph m ph t nông nghi p, công nghi p cũng như t các quá trình ch bi n th công r t ña d ng như b t ñ u nành, b t s n thô… Nh ng ngu n nguyên li u này v n dĩ r t r và d ki m do ñó vi c t n d ng chúng ñ thay th m t lư ng tương ñương các thành ph n dinh dư ng trong môi trư ng nuôi c y sinh enzyme là m t ñi m nh n quan tr ng nh m thúc ñ y các ngành công nghi p s d ng các ch ph m enzyme m t cách r ng rãi. Tuy nhiên, ñ các ch ph m enzyme này khi ng d ng trong công nghi p có hi u qu cao nh t thì vi c nghiên c u xác ñ nh các tính ch t cơ b n c a enzyme trư c khi s d ng chúng là r t c n thi t. Xu t phát t nh ng khía c nh trên, tôi ñã ch n ñ tài nghiên c u c a mình là “Nghiên c u thu nh n ch ph m amylase t Bacillus amyloliquefaciens T9” nh m tìm ra ñư c ñi u ki n nuôi c y thích h p cho quá trình sinh t ng h p amylase cao t m t s ngu n nguyên li u t nhiên qua ñó thu nh n, tinh ch t ng ph n và xác ñ nh m t s ñ c tính c a ch ph m enzyme thu ñư c.
4 2. M c ñích c a lu n văn - Thi t l p ñư c quy trình thu nh n ch ph m amylase trong MTTN quy mô phòng thí nghi m. - Th nghi m kh năng th y phân tinh b t s n c a ch ph m enzyme thô. Đ th c hi n m c ñích trên, yêu c u ñ t ra là nghiên c u ch n ngu n ngu n C, N t nhiên thích h p, thu nh n ch ph m enzyme và xác ñ nh tính ch t c a chúng. 3. N i dung nghiên c u c a lu n văn - Nghiên c u tìm ñi u ki n t i ưu cho s sinh t ng h p amylase trong MTTN. T ñó thi t l p quy trình thu nh n ch ph m amylasse t ngu n nguyên li u ñã ñư c ch n. - Kh o sát m t s ñ c tính c a các ch ph m amylase thu ñư c. - Th nghi m kh năng th y phân tinh b t s n b i ch ph m amylase thu ñư c. 4. Ý nghĩa khoa h c và ý nghĩa th c ti n c a lu n văn - M ra thêm m t tri n v ng c a vi c thu nh n enzyme có ho t l c cao b ng cách s d ng các s n ph m ph , các ngu n nguyên li u r ti n. - Gi m chi phí s n xu t enzyme t ñó góp ph n ñáp ng ñư c nhu c u s d ng chúng trong s n xu t công nghi p ph bi n hơn. - Góp ph n gi i quy t ñư c lư ng ph ph ph m trong quá trình ch bi n công nghi p, gi m ô nhi m môi trư ng - Giúp n ñ nh ngu n ch ph m enzyme trong công nghi p ch bi n t o ñ u ra cho các s n ph m ch bi n có s d ng enzyme trong quy trình s n xu t.
5 5. B c c c a lu n văn Lu n văn g m các chương m c sau: M cl c M ñ u Chương 1: T ng quan tài li u Chương 2: Đ i tư ng và phương pháp nghiên c u. Chương 3: K t qu và th o lu n K t lu n và ki n ngh Tài li u tham kh o Ph l c
6 Chương 1: T NG QUAN TÀI LI U 1.1. T ng quan v Bacillus 1.2. T ng quan v vi khu n Bacillus amyloliquefaciens 1.3. T ng quan v enzyme amylase 1.4. T ng quan v quá trình thu nh n enzyme amylase t vi sinh v t 1.5. T ng quan v ngu n ph ph m t nhiên 1.6. Nh ng nghiên c u trong và ngoài nư c Chương 2: Đ I TƯ NG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.1. Đ i tư ng - Vi khu n Bacillus amyloliquefaciens T9. - Các ngu n nguyên li u t nhiên: b t s n thô, b t g o tr ng Khang nhân, g o l t Khang nhân, b t ñ u nành, b t ph li u tôm, b t cá, tinh b t s n. 2.2. Phương pháp nghiên c u - Phương pháp ho t hoá gi ng - Đánh giá m t ñ t bào vi khu n b ng phương pháp ño quang - Phương pháp xác ñ nh ho t ñ amylase b ng phương pháp Bernfeld - Phương pháp ñi n di nh m xác ñ nh phân t lư ng c a amylase - Phương pháp thu nh n ch ph m enzyme thô - Phương pháp toán h c Chương 3: K T QU VÀ TH O LU N 3.1. Ho t hóa gi ng T bào vi khu n Bacillus amyloliquefaciens T9 ban ñ u ñư c b o qu n trong glycerol 30% ñi u ki n l nh ñông. V i m c ñích ho t hóa l i ch ng vi khu n trư c khi s d ng cho nghiên c u, chúng
7 tôi ti n hành nuôi c y ria trên môi trư ng th ch. K t qu thu ñư c khu n l c thu n có ñ c ñi m tròn, có n t lõi gi a, màu tr ng hơi ñ c và có mép răng cưa (hình 3.1). Đ c ñi m này gi ng v i mô t v ch ng Bacillus amyloliquefaciens. Hình 3.1. Hình nh khu n l c ch ng B. amyloliquefaciens T9 3.2. Kh o sát nh hư ng ngu n carbon (C) và nitơ (N) t nhiên ñ n kh năng sinh t ng h p amylase ngo i bào c a B. amyloliquefaciens T9 D a vào hàm lư ng N, C trong MTCB và thành ph n protein, tinh b t có trong nguyên li u ñ xác ñ nh hàm lư ng nguyên li u t nhiên tương ñương c n b sung vào nh m thay th hoàn toàn hàm lư ng C, N trong MTCB (B ng 3.1). T ñó, chúng tôi ti n hành kh o sát nh hư ng c a s k t h p t ng ngu n N v i các ngu n C khác nhau lên quá trình sinh t ng h p amylase c a ch ng vi khu n. Ho t ñ amylase c a các m u thí nghi m sau nuôi c y l c 200 vòng/phút nhi t ñ 40oC, pH = 7,0 trong 24 gi ñư c xác ñ nh theo phương pháp Bernfeld và tính theo % so v i m u ñ i ch ng là MTCB ñ xác ñ nh hi u qu c a s k t h p.
8 B ng 3.1. Hàm lư ng C, N t nhiên c n b sung vào môi trư ng nuôi c y Hàm lư ng Hàm lư ng (%) c n s (%) c n s S Ngu n N t d ng ñ thay Ngu n C t d ng ñ thay th nhiên th hoàn toàn nhiên th hoàn toàn t ngu n N trong ngu n C trong MTCB (1,3%) MTCB (0,75%) 1 B t ñ u nành 3,23 B t s n thô 1,65 B t ph li u B t g o 1,47 2 4,64 tôm tr ng 3 B t cá 2,06 B tg ol t 1,49 K t qu kh o sát nh hư ng c a s k t h p này ñư c th hi n hình 3.2 ñ n hình 3.5 3.2.1. nh hư ng c a s k t h p b t ñ u nành và các ngu n C t nhiên a % ho t ñ amylase a b c Công th c thí nghi m Hình 3.2. nh hư ng c a s thay th k t h p b t ñ u nành v i các ngu n C t nhiên khác nhau lên kh năng sinh amylase ngo i bào c a B. amyloliquefaciens T9 (Các ch cái khác nhau bi u th s sai khác có ý nghĩa th ng kê (p
9 3.2.2. nh hư ng c a s k t h p b t ph li u tôm và các ngu n C t nhiên S k t h p c a b t ph li u tôm và b t s n thô là môi trư ng có s kích thích r t l n ñ n s sinh trư ng và phát tri n c a vi khu n. Ho t ñ c a enzyme trong môi trư ng này (120,69%) cao hơn r t nhi u so v i hai s k t h p còn l i (Hình 3.3). a % ho t ñ amylase b c c Công th c thí nghi m Hình 3.3. nh hư ng c a s thay th k t h p b t ph li u tôm v i các ngu n C t nhiên khác nhau lên kh năng sinh amylase ngo i bào c a B. amyloliquefaciens T9 (Các ch cái khác nhau bi u th s sai khác có ý nghĩa th ng kê (p
10 B t cá khi k t h p v i các ngu n C khác nhau ñư c s d ng trong nghiên c u này ñ u cho k t qu kh quan. Ph n trăm ho t ñ enzyme ñ t ñư c cao nh t khi b t cá v i b t s n thô (123,707%) T các k t qu trên, chúng tôi ñã l a ch n ñư c 4 môi trư ng thay th ñ ch ng này sinh amylase cao hơn so v i MTCB (Hình 3.5) a a % ho t ñ amylase b b b Công th c thí nghi m Hình 3.5. nh hư ng c a s thay th ngu n C, N t nhiên lên kh năng sinh amylase ngo i bào c a B. amyloliquefaciens T9 (Các ch cái khác nhau bi u th s sai khác có ý nghĩa th ng kê (p
11 - B t s n thô có tác d ng kích thích t t nh t ñ n kh năng sinh t ng h p amylase b i ch ng vi khu n khi ph i h p v i các ngu n N khác nhau. - B t g o bao g m c b t g o tr ng và g o l t ñ u không ph i là ngu n C t nhiên t t Tóm l i, môi trư ng mà chúng tôi l a ch n ñ th c hi n cho các nghiên c u ti p theo là môi trư ng g m b t ph li u tôm và b t s n thô. Môi trư ng này s g i là môi trư ng t nhiên (MTTN). 3.3. nh hư ng c a th i gian nuôi c y lên kh năng sinh t ng h p amylase c a B. amyloliquefaciens T9 trong MTTN V i m c ñích xác ñ nh th i ñi m sinh enzyme cao nh t trong MTTN, chúng tôi ti n hành nuôi c y ch ng và xác ñ nh ho t ñ trong các kho ng th i gian khác nhau. Quá trình sinh t ng h p amylase t ch ng Bacillus amyloliquefaciens T9 ñ t cao nh t (6,316U/ml) 32 gi nuôi c y. Đây cũng là th i ñi m mà m t ñ t bào ñ t c c ñ i. (hình 3.6) M t ñ quang Ho t ñ amylase (U/ml) a a b b c c c c d d d e Th i gian nuôi c y Hình 3.6. nh hư ng c a th i gian nuôi c y ñ n s phát tri n vi khu n và ho t tính c a amylase (Các ch cái khác nhau bi u th s sai khác có ý nghĩa th ng kê (p
12 3.4. nh hư ng c a pH ban ñ u lên kh năng sinh t ng h p amylase b i B. amyloliquefaciens T9 Th c hi n thay ñ i pH c a MTTN và ti n hành nuôi c y theo ch ñ trên (nhi t ñ 400C, th i gian 32 gi ) ñ kh o sát nh hư ng c a pH ban ñ u ñ n kh năng sinh t ng h p amylase c a B. amyloliquefaciens T9. a Ho t ñ amylase b c e d (U/ml) f g h h i j pH môi trư ng Hình 3.7. nh hư ng c a pH ban ñ u lên kh năng sinh t ng h p amylase b i B. amyloliquefaciens T9 (Các ch cái khác nhau bi u th s sai khác có ý nghĩa th ng kê (p
13 a Ho t ñ amylase b b c d Nhi t ñ nuôi c y (0C) Hình 3.8. nh hư ng c a nhi t ñ lên quá trình sinh t ng h p amylase b i B. amyloliquefaciens T9 (Các ch cái khác nhau bi u th s sai khác có ý nghĩa th ng kê (p
14 Ch ph m enzyme thô thu ñư c ñư c k t t a b ng aceton và xác ñ nh phân t lư ng c a amylase b ng phương pháp ñi n di bi n tính và không bi n tính (hình 3.9). 3.7. Kh o sát m t s tính ch t c a ch ph m amylase thu nh n t Bacillus amyloliquefaciens T9 3.7.1. nh hư ng c a nhi t ñ và ñ b n nhi t c a ch ph m enzyme thô Th c hi n ph n ng h n h p enzyme và cơ ch t các m c nhi t ñ và th i gian khác nhau. K t qu thu nh n ñư c trình bày hình hình 3.10 và b ng 3.6 Ho t ñ amylase (U/ml) a b c c c c d e Nhi t ñ Nhi t ñ ph n ng (0C) sôi Hình 3.10. nh hư ng c a nhi t ñ ph n ng ñ n ho t ñ amylase t B. amyloliquefaciens T9 (Các ch cái khác nhau bi u th s sai khác có ý nghĩa th ng kê (p
15 B ng 3.6. Đ b n nhi t c a ch ph m amylase t B. amyloliquefaciens T9 pH 6 Th i gian Ph n trăm ho t ñ còn l i các m c nhi t ñ (%) (phút) 0 40 C 50 C 0 0 60 C 0 70 C 800C 0 100a 100a 100a 100a 100a 10 98,6ab 98,86ab 60,22b 38,48b 35,2b 20 97,02abc 98,49ab 35,38c 30,78c 32,88c 30 97,71abc 96,03cd 34,46c 29,28c 34,58b 40 97,19abc 97,54bc 30,35de 32,96c 20,38d 50 97,02abc 94,52de 32,48cd 17,57de 19,77d 60 96,66bc 94,14def 32,48cd 21,09d 20,07d 70 96,66bc 93,19efg 28,82de 18,07de 18,99de 80 95,96bc 91,68g 26,53e 18,07de 17,61ef 90 96,31bc 92,06fg 18,91fg 20,08de 16,68fg 100 95,44c 91,3g 19,53fg 17,91de 16,06g 110 92,27d 86,77h 22,42f 15,57e 14,37h 120 78,92e 85,82h 16,02g 15,4e 12,05i (Các ch cái khác nhau bi u th s sai khác có ý nghĩa th ng kê và s sai khác th hi n ñư c x lý theo c t) 3.7.2. nh hư ng c a pH và ñ b n pH c a ch ph m enzyme thô - Ho t ñ c a amylase ñ t ñư c r t th p pH 4.0 (2.1U/ml/phút) sau ñó tăng m nh và ñ t c c ñ i t i pH 6.0 (12.686 U/ml/phút). Kho ng pH thích h p cho ho t ñ ng c a enzyme n m trong vùng acid y u và trung tính (pH=5-7). - Ch ph m enzyme thô r t b n sau 120 ph 3 m c pH ñư c kh o sát (B ng 3.7), trong ñó ñ b n c a enzyme pH 5 và pH 7 n ñ nh hơn so v i pH 6.
16 Ho t ñ amylase (U/ml) a b c d e e f pH ph n ng Hình 3.11. nh hư ng c a pH môi trư ng ph n ng ñ n ho t ñ amylase t B. amyloliquefaciens T9 (Các ch cái khác nhau bi u th s sai khác có ý nghĩa th ng kê (p
17 3.7.3. nh hư ng c a ion Ca2+ ñ n ho t ñ và ñ b n nhi t c a ch ph m enzyme thô K t qu kh o sát nh hư ng c a ion Ca 2+ ñ n ho t ñ và ñ b n nhi t c a ch ph m enzyme thô cho th y r ng: - Ho t ñ c a enzyme trong ña s trư ng h p v i m u có b sung Ca2+ và không b sung Ca2+ có giá tr x p xĩ nhau. m ts 2+ m c nhi t ñ thì m u có b sung Ca cho ho t ñ cao hơn nhưng không ñáng k , m t s trư ng h p khác thì ho t ñ c a m u không có Ca2+ l i cho giá tr cao hơn. - Ion Ca2+ không có tác d ng làm tăng ñ b n nhi t c a enzyme theo các kho ng th i gian khác nhau các m c nhi t ñ khác nhau. Qua ñó chúng tôi nh n th y r ng, ion Ca2+ h u như không có tác ñ ng rõ r t ñ n vi c làm tăng ñ ho t ñ cũng như ñ b n nhi t c a enzyme amylase t ch ng Bacillus amyloliquefaciens T9 ñư c nuôi c y trong MTTN (hình 3.12, 3.13, 3.14, 3.15, 3.16 và hình 3.17) a a a a Ho t ñ amylase (U/ml) a a a a a a b a a a a a Nhi t ñ (0C) Hình 3.12. nh hư ng c a ion Ca2+ ñ n ho t ñ amylase t B. amyloliquefaciens T9 các nhi t ñ khác nhau (Các ch cái khác nhau bi u th s sai khác có ý nghĩa th ng kê (p
18 Ho t ñ tương ñ i (%) a a a a a a a a b b b b b b b b Th i gian (phút) Hình 3.13. Đ b n nhi t c a ch ph m amylase 400C (Các ch cái khác nhau bi u th s sai khác có ý nghĩa th ng kê (p
19 Ho t ñ tương ñ i (%) a a a a a b a a a b a a a a a a Th i gian (phút) Hình 3.15. Đ b n nhi t c a ch ph m amylase 600C (Các ch cái khác nhau bi u th s sai khác có ý nghĩa th ng kê (p
20 Ho t ñ tương ñ i (%) a a a a b a a a a b b a b b b b Th i gian (phút) Hình 3.17. Đ b n nhi t c a ch ph m amylase 800C (Các ch cái khác nhau bi u th s sai khác có ý nghĩa th ng kê (p