luận văn:So sánh hai phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo dược điển Việt Nam III

Chia sẻ: Nguyễn Thị Bích Ngọc | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:45

Thêm vào BST

Báo xấu

223
lượt xem 58
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Berberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có trong nhiều loại cây thuốc ở Việt Nam, khoảng 150 loài thuộc nhiều họ thực vật khác nhau. Berberin chủ yếu ở trong thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1,5-3%

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: luận văn:So sánh hai phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo dược điển Việt Nam III

----- ----- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài: “So sánh hai phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo dược điển Việt Nam III.” 1
TV N Berberin là m t alcaloid th c v t thu c nhóm isoquinolin có trong nhi u lo i cây thu c Vi t Nam, kho ng 150 loài thu c nhi u h th c v t khác nhau. Berberin ch y u trong thân và r cây vàng ng v i t l 1,5- 3%[1]. Berberin ư c bi t n v i tác d ng n i b t là kìm khu n t và E.coli, i u tr b nh l . Thu c ư c s d ng ph bi n do giá thành th p và khá an toàn, không nh hư ng t i s phát tri n bình thư ng c a vi khu n có ích ru t. Hi n nay trên th trư ng có các d ng bào ch c a Berberin như: thu c nh m t, viên nén, viên bao…. Vì v y v n ki m tra ch t lư ng nguyên li u làm thu c cũng như thành ph m là r t quan tr ng. Dư c i n Vi t Nam III (D VN III) có chuyên lu n ki m nghi m nguyên li u và ch ph m viên nén Berberin b ng phương pháp o quang ph h p th t ngo i UV- VIS, dư c i n Trung Qu c (2005) nh lư ng Berberin b ng HPLC. có cơ s l a ch n phương pháp nh lư ng Berberin thích h p, chúng tôi ã ti n hành th c hi n tài : “ So sánh hai phương pháp nh lư ng Berberin nguyên li u b ng HPLC theo dư c i n Trung Qu c (2005) và b ng o quang ph h p th UV-VIS theo dư c i n Vi t Nam III” v i nh ng m c tiêu sau:  ánh giá phương pháp nh lư ng Berberin nguyên li u b ng HPLC theo dư c i n Trung Qu c (2005)  ánh giá phương pháp nh lư ng Berberin nguyên li u b ng o quang ph h p th UV-VIS theo D VN III 2
 So sánh hai phương pháp nh lư ng trên tìm phương pháp thích h p cho vi c nh lư ng berberin trong các cơ s ki m tra ch t lư ng thu c trong nư c. PH N I. T NG QUAN 1.1. VÀI NÉT V BERBERIN: 1.1.1. C u trúc: Beberin là m t alcaloid th c v t thu c nhóm isoquinolin có khung protoberberin[1]. Isoquinolin còn ư c g i là benzo[c] pyridin hay 2- benzamin là m t h p ch t h u cơ thơm heterocyclic[18] This image cannot currently be display ed. C u trúc c a isoquinolin Công th c c u t o: This image cannot currently be display ed. Công th c phân t : C20H18NO4+ PTL: 336.36 Tên khoa h c : 5,6 dihydro – 8,9 – dimethoxy – 1,3 – dioxa – 6a – azoniaindeno (5,6-a) anthracen [6] 1.1.2. Ngu n g c: 3
Berberin thư ng có trong r , thân r , thân, v cây nh ng cây thu c chi Berberis, Hydrastis candensis, Coptis chinensis [18]. Berberin có nhi u trong thân và r cây vàng ng v i t l 1,5-3%, berberin chi m ít nh t là 82% so v i alcaloid toàn ph n [9]. Berberin thư ng có l n các t p ch t alcaloid khác như: palmatin, jatrorrhizin. Gi i h n t p ch t palmatin không quá 2%, jatrorrhizin không quá 5 % [6],[13]. 1.1.3. Tính ch t - B t k t tinh màu vàng, không mùi, có v r t ng. Tan trong nư c nóng, khó tan trong ethanol và nư c l nh, r t khó tan trong cloroform, không tan trong ether.[6] 1.5. Tác d ng dư c lý: - Berberin có tác d ng kháng vi trùng như: vi khu n ( shigella, t c u và liên c u khu n), th protozoal, vi n m, candida, virus, n m men, kí sinh trùng gây b nh (kí sinh trùng s t rét, kí sinh trùng ư ng ru t) [12], [17]. - Berberin có tác d ng kìm khu n t và E.coli, c bi t khi dùng s không nh hư ng t i s phát tri n bình thư ng c a h vi khu n có ích ru t, khi dùng ph i h p v i m t s thu c kháng sinh s h n ch tác d ng ph gây ra b i các thu c kháng sinh i v i h sinh v t ư ng ru t [17]. - Berberin có tác d ng c ch s bài ti t ion trong lòng ru t, c ch co cơ, gi m cholesterol và trigycerid, ch ng ti u ư ng, c ch cơn nh p nhanh th t, gi m viêm cho ngư i b viêm kh p, tăng ti u c u c a b nh nhân xu t huy t, gi m ti u c u tiên phát và th phát, kích thích s bài ti t m t và th i tr bilirubin[17]. Ch nh: [9],[12],[17] - B nh l tr c khu n, h i ch ng l , viêm ru t, tiêu ch y, viêm ng m t và c bi t là b nh s i m t, vàng da, s t, s t rét, m n nh t. 4
- i u tr viêm k t m c, au m t do kích thích bên ngoài( do n ng, gió, l nh, b i, khói…) và i u tr b nh au m t h t. - i u tr b nh Leishmania, Trichomonas. 1.1.6. Ch ng ch nh: [17] - Ph n có thai vì kh năng gây co bóp t cung c a berberin - Ngư i d ng v i berberin ( r t hi m g p) 1.1.7. D ng thu c và hàm lư ng: [11] - D ng viên nén, viên bao, viên nang v i hàm lư ng 10 mg, ho c 50- 100 mg/ viên - D ng thu c nh m t i u tr viêm k t m c, au m t do kích thích bên ngoài (gió, n ng, l nh, b i, khói) 1.2. M T S PHƯƠNG PHÁP NH LƯ NG BERBERIN: 1.2.1. Phương pháp th tích: [5], [13] Hòa tan 0,3g ch ph m (chính xác) vào trong c c v i 150ml nư c ang sôi. Làm ngu i, chuy n dung d ch vào bình nh m c 250ml. L y chính xác 50ml dung d ch kali dicromat 0,1N r i thêm nư c t i v ch. L c u trong 5 phút, l c qua gi y l c khô, b 20ml d ch l c u. L y chính xác 100ml d ch l c cho vào bình nón nút mài 250 ml, thêm 2g kali iodid, l c cho tan, sau ó thêm 10 ml dung d ch acid hydrochloric 16%, y kín, l c u, vào bóng t i trong 10 phút. Chu n b ng dung d ch natri thiosulfat 0,1N, g n i m tương ương thêm 2ml dung d ch h tinh b t và ti p t c chu n cho n khi màu xanh bi n m t thì d ng. Song song ti n hành làm m u tr ng trong cùng i u ki n. 1ml dung d ch kali dicromat 0,1N tương ng v i 12,39 mg C20 H18NO4Cl. 1.2.2. Phương pháp o UV-VIS  Phương pháp 1:[6]. 5
* Dung d ch th : Cân 0.200 g ch ph m và hòa tan trong 200ml nư c b ng cách un nóng. Sau ó làm l nh và thêm nư c n 1000ml. L y 10ml dung d ch này pha loãng v i nư c n 100ml. * Dung d ch chu n: Cân chính xác kho ng 0,200 g Kali dicromat thu c th chu n ã s y khô 1100C trong 4 gi , hòa tan trong nư c. Thêm 10ml dung d ch acid sulfuric 1N và thêm nư c v a 1000ml. * o h p th : o At và As c a dunh d ch th và dung d ch chu n bư c sóng 421 nm. * Cách tính: Lư ng ( mg) c a C20H18NO4Cl ư c tính b ng công th c sau: At 1 P= × ×a As 1,006 a: kh i lư ng ( mg) kali dichromat.  Phương pháp 2 [6] Xác nh hàm lư ng berberin clorid trong viên nén. * Dung d ch th : Cân 20 viên, tính kh i lư ng trung bình và nghi n thành b t m n. Cân chính xác m t lư ng b t viên tương ương v i kho ng 80 mg berberin clorid, thêm 10ml nư c th m u b t viên, sau ó thêm kho ng 200ml nư c sôi, khu y kĩ 5 phút, ngu i r i chuy n vào bình nh m c 500ml, thêm nư c t i v ch, l c u. l ng t nhiên ho c em ly tâm. L y chính xác 5ml dung d ch trong trên em pha loãng v i nư c c t v a 100ml. * Dung d ch chu n : pha tương t dung d ch th , dùng ch t i chi u berberin clorid. * M u tr ng: nư c c t. * Ti n hành o h p th c a dung d ch th và chu n trong cùng i u ki n t i bư c sóng c c i 345 nm, c c o d y 1 cm. 1.2.3. Phương pháp cân [5] 6
Áp d ng nh lư ng viên nén berberin clorid, d a trên kh năng t o t a c a berberin v i acid picric. Cân 20 viên và nghi n thành b t m n. Cân chính xác m t lư ng b t viên tương ng v i kho ng 0.50g berberin clorid, cho vào bình nh m c 250ml, thêm kho ng 200 ml methanol (TT), l c k hòa tan berberin, r i thêm methanol n ng n. L c u, l c qua gi y l c khô, b 20ml d ch l c ban u. L y úng 100ml d ch l c. Làm bay hơi cho n khô trên cách th y, thêm 150ml dung d ch NaOH 0,1N và 90ml nư c, un nóng. L c k hòa tan. ngu i r i l c qua gi y l c ã th m ư t. R a ph u và gi y l c 3 l n, m i l n 10ml nư c. G p d ch l c và nư c r a, thêm 10ml dung d ch acid hydroclorid 0,1N r i ti p t c cho ngay và t t 30ml dung d ch bão hòa acid picric ( TT). L c u. yên qua m t êm, l c qua ph u th y tinh x p có ư ng kính l x p 10 – 16 µm ( ã cân bì) l y t a. R a t a 3 l n v i nư c c t kho ng 150C, m i l n 15ml nư c, hút ki t nư c r i s y khô ph u và t a 1000C n kh i lư ng không i. Kh i lư ng t a xác nh là P (g). 1 g t a tương ng v i 0,6586 g C20H18NO4Cl. 1.2.4. Phương pháp HPLC  Phương pháp 1:[14], [15]. * i u ki n s c ký: - C t s c ký: C t thép không g ( 25cm x 4 mm) ư c nh i b i h t silicagel ã ư c octadecylsilan hóa có ư ng kính 5 µm. - Nhi t c t: 400C. - Pha ng: Hòa tan 3,4g kali dihydrophosphat và 1,7g natri laurylsulfat trong 1000 ml h n h p dung môi nư c và acetonitril (1:1). 7
-T c dòng: i u ch nh t c dòng sao cho th i gian lưu c a berberin kho ng 10 phút. - Detector UV bư c sóng 345 nm. - Th tích tiêm: 10 µl. - N ng dung d ch th và chu n: 0,1mg/ml và cách ti n hành pha 2 dung d ch này gi ng nhau. * Ti n hành: L n lư t tiêm các dung d ch th và chu n. D a vào áp ng c a pic berberin trong các dung d ch th , chu n và hàm lư ng dung d ch chu n, tính lư ng berberin trong ch ph m. * Cách tính: Lư ng Wt (mg) c a berberin clorid (C20H18ClNO4). Wt = Ws x (At / As) Ws = Lư ng (mg) c a berberin chu n, tính theo lư ng khan.  Phương pháp 2: [13] * i u ki n s c ký: - C t s c ký: C t ư c nh i b i các h t silicagel ã ư c octadecylsilan hóa. - Pha ng: H n h p dung d ch m phosphate [ 0,05 mol/L kali dihydrophosphat v i 0,05 mol/L natri heptan sulfonat (1:1) ch a 0,2% triethylamin, i u ch nh t i pH 3,0 b ng acid phosphoric] và acetonitril (60:40). -T c dòng: 1,5 ml/ phút. - Detector UV bư c sóng 263 nm. - Th tích tiêm: 20 µl - N ng dung d ch chu n và th : 32 µg/ml * Ti n hành: 8
L n lư t tiêm các dung d ch th và chu n. D a vào áp ng c a pic berberin trong dung d ch th , chu n và hàm lư ng dung d ch chu n, tính lư ng berberin có trong ch ph m.  Phương pháp 3: [16] * i u ki n s c ký: - C t s c ký: C t Hypersil C18 ( 5 µm, 25 cm x 4,6 mm) - Pha ng: Acid phosphoric 0,04 mol/l – acetonitril ( 58: 42). -T c dòng: 1ml/phút. - Detector UV bư c sóng 349 nm. * Ti n hành: Tương t như 2 phương pháp HPLC ã trình bày trên. 1.3. T NG QUAN PHƯƠNG PHÁP HPLC 1.3.1. Nguyên t c Phương pháp HPLC là 1 phương pháp phân tích hóa lý, dùng tách và nh lư ng các thành ph n trong h n h p d a trên ái l c khác nhau gi a các ch t v i 2 pha luôn ti p xúc nhưng không hòa l n vào nhau: Pha tĩnh (trong c t hi u năng cao) và pha ng (dung môi r a gi i). Khi dung d ch c a h n h p các ch t c n phân tích ưa vào c t, chúng s ư c h p ph ho c phân b vào pha tĩnh tùy thu c vào b n ch t c a c t và c a ch t c n phân tích. Khi ta bơm dung môi pha ng b ng bơm v i áp su t cao thì tùy thu c vào ái l c c a các ch t v i hai pha, chúng s di chuy n qua c t v i v n t c khác nhau d n n s phân tách. Các ch t sau khi ra kh i c t s ư c phát hi n b i b ph n phát hi n g i là detector và ư c chuy n qua b x lý k t qu . K t qu cu i cùng ư c hi n th trên màn hình ho c ưa ra máy in. [8] 1.3.2. Cơ s lý thuy t Quá trình phân tách trong k thu t HPLC là do quá trình v n chuy n và phân b c a các ch t tan gi a 2 pha khác nhau. Khi pha ng di chuy n v i 9
m tt c nh t nh qua c t s c ký s y các ch t tan b pha tĩnh lưu gi ra kh i c t. Tùy theo b n ch t pha tĩnh, ch t tan và dung môi mà quá trình r a gi i tách ư c các ch t khi ra kh i c t s c ký. N u ghi quá trình tách s c ký, chúng ta có s c . [8], [11] 1.3.3. Các thông s c trưng c a quá trình s c ký: K t qu c a quá trình s c kí ư c detector phát hi n, phóng i và ghi thành s c ký ( hình 1): t R2 t R1 to W 0.5-1 W 0.5-2 t' R1 W b1 W b2 t' R2 Hình 1: s c ký c a 2 ch t và các thông s c trưng Trong ó : to (th i gian ch t): Là th i gian c n thi t pha ng ch y qua c t tách tR (th i gian lưu): th i gian k t khi ch t c n phân tích ư c bơm vào c t cho n khi xu t hi n nh c a pic ch t c n phân tích. tR’ (th i gian lưu th c ) = tR- to. W0,5: r ng pic n a chi u cao Wb: r ng áy pic. 1.3.2.1. H s dung lư ng k’ t' t −t t [8] k' = R = R 0 = R −1 t 0 t 0 t 0 10
N u k' nh thì tR cũng nh và s tách kém. Trong th c t k' n m trong kho ng 2 - 5 là t t nh t. Hai ch t ch ư c tách ra kh i nhau n u chúng có giá tr khác nhau. 1.3.2.2 ch n l c α (selectivity - factor) α= k '2 = t R2 − t0 (k2' > k1' ) [4], [8] k' t 1 R1 − t0 α khác 1 càng nhi u thì kh năng tách càng rõ ràng, t i ưu t 1,5 n 2. 1.3.2.3. phân gi i (resolution) c trưng cho m c tách hai ch t ra kh i nhau trên m t i u ki n s c ký. phân gi i c a 2 pic c nh nhau ư c tính theo công th c: 2 (t − t R ,A ) 1,18 (t − t R ,A ) N  α − 1  k 'B  [4], [8]   R ,B R ,B R = = =  w B + wA w 1/ 2B + w 1/ 2A 4  α  1+ k 'B    phân gi i cơ b n t ư c khi R = 1,5 1.3.2.4. H s b t i AF Cho bi t m c cân i c a pic s c ký, nó ư c tính theo công th c: AF = w 1 / 20 [4], [8] 2a Trong ó: W1/20: là chi u r ng c a pic ư c o 1/20 chi u cao c a pic a: kho ng cách t ư ng vuông góc h t nh pic n mép ư ng cong phía trư c t i v trí 1/20 chi u cao c a pic. Khi AF n m trong kho ng 0,5-2,5 thì phép nh lư ng ư c ch p nh n, n u AF càng tăng lên thì hi n tư ng kéo uôi càng rõ. Hi n tư ng nh kéo uôi (tailing peak) có th là do tương tác gi a ch t c n phân tích và pha tĩnh ho c c t s c ký b n. nh kéo tuy n trư c (fronting peak) có th do lư ng m u ưa vào quá l n so v i năng l c c t [7]. 1.3.2.5. S ĩa lý thuy t N c trưng cho hi u l c c t. 11
2 2  tR   tR  N = 16 hay N=5,54 [4], [8]     wB  w1 / 2B  N u g i L là chi u cao c t s c ký, thì chi u cao c a ĩa lý thuy t H L ư c tính b ng công th c: H= N 1.3.4. Nguyên t c c u t o h th ng HPLC [4],[8] H th ng HPLC ơn gi n và làm vi c theo k thu t HPLC bao g m 6 b ph n chính sau: a/H th ng bơm bơm pha ng vào c t tách. Bơm này ph i i u ch nh ư c áp su t (0 - 400 bar) a/ Bình ch a dung môi và h th ng x lý dung môi Bình ch a dung môi thư ng b ng th y tinh ho c thép không g . Dung môi ch y s c ký ư c l c qua màng l c (thư ng màng l c c l 0,45 µm ) và u i khí hòa tan. c/ H tiêm m u ưa m u phân tích vào c t. Có nhi u phương pháp tiêm m u khác nhau, ơn gi n nh t là s d ng m t van tiêm. Trong các h th ng s c ký hi n i là h tiêm m u t ng. Trong s c ký l ng, m u l ng có th ư c tiêm ngay sau khi l c lo i t p qua màng l c 0,45 µm, còn m u r n c n hòa tan trong 1 dung môi thích h p. d/ C t s c ký l ng HPLC C t ư c ch t o b ng thép c bi t trơ v i hóa ch t, ch u ư c v i áp su t cao n vài trăm bar. - Chi u dài c t: 10, 15, ho c 25 cm; thích h p v i các ti u phân pha tĩnh có ư ng kính r t nh (3, 5, 10 µm). - ư ng kính c t: 4 ho c 4,6 mm. 12
e/ Detector trong HPLC Là b ph n phát hi n ch t phân tích, tùy theo b n ch t c a ch t c n phân tích mà s d ng detector thích h p. Detector hay s d ng là detector h p th UV - VIS. Ngoài ra còn có detector khúc x , huỳnh quang, i n hóa. f/ Thi t b hi n th k t qu Có nhi u lo i nhưng ơn gi n và ph bi n nh t là máy t ghi tín hi u o dư i d ng pic. Sơ kh i h th ng HPLC ư c t ng quát hình 2 Van tiêm mẫu Bơm Binh chứa pha động Cột Detector Bộ phận tự ghi Hình 2: Sơ kh i t ng quát h th ng HPLC 1.3.5. Cách ánh giá pic[7] * ánh giá di n tích pic: Di n tích c a m t ch t tương ng v i t ng lư ng ch t ó. tính di n tích pic, hi n nay ngư i ta thư ng dùng máy tích phân i n t g n v i máy vi tính (sai s kho ng 0,5 %) ho c máy phân tích cơ h c (sai s 1,3 %). Phương pháp này có th dùng cho các pic không b trôi ư ng n n và c pic có ư ng n n b trôi. Phương pháp này ch c n i m u 13
i m cu i c a pic ư c nh n ra chính xác và cho k t qu t t v i n ng v a, trung bình và cao. * ánh giá chi u cao pic: Khi pic có d ng không i thì chi u cao pic (kho ng cách gi a ư ng n n và nh pic) là m t i lư ng t l v i di n tích pic và nó cũng có th dùng ánh giá ph . Phương pháp ch áp d ng khi các ch s k' là h ng nh. * V i pic có ư ng n n b nhi u ho c b h p thì vi c xác nh chi u cao pic s d dàng và chính xác hơn vi c xác nh di n tích pic. 1.4.T NG QUAN PHƯƠNG PHÁP QUANG PH H P TH UV-VIS 1.4.1. Cơ s lý thuy t[2],[3],[4],[6] 1.4.1.1. nh lu t Lambert-Beer Chi u m t chùm tia sáng ơn s c có bư c sóng và cư ng Io qua dung d ch ng nh t có n ng C, b dày l p dung d ch là l. Khi i qua dung d ch ,m t ph n ánh sáng b h p th , m t ph n b ph n x , ph n còn l i (I) thì i qua dung d ch . M i quan h gi a I và Io ư c th hi n b ng nh lu t Lambert-Beer. I = Io × 10 - Cl V i là h s h p th riêng c a dung d ch. H s này không ph thu c vào n ng , ch ph thu c vào b n ch t ch t tan, vào bư c sóng c a ánh sáng chi u vào dung d ch. 1.4.1.2. i u ki n ng d ng nh lu t Lambert – beer + Chùm tia sáng ph i ơn s c + Dung d ch ph i loãng (n m trong kho ng n ng thích h p) + Dung d ch ph i trong su t (tr chu n o quang). + Ch t th ph i b n trong dung d ch và ph i b n du i tác d ng c a ánh sáng (UV-VIS). 1.4.1.3. S sai l ch iv i nh l t Lambert-beer 14
+ S sai l ch do máy:(do b ph n ơn s c ,b ph n khu ch i kém) như do t bào quang i n, nhân quang quá già, nh y kém. + Sai l ch do hoá h c: - Do s phân ly (ion hoá): thư ng g p khi pha loãng dung d ch, phân t ch t tan b phân ly, mà h p th c a d ng phân t và d ng ion phân ly không như nhau. - Do t o dimer, trimer: s n ph m trùng h p này l i có h p th khác d ng ơn phân t . + Do ph n ng các ch t l : - Ch t l có th t o ph c v i các ion trong dung d ch: phòng hi n tư ng này x y ra, ngư i ta dùng m u tr ng có thành ph n như dung d ch, ch thi u ch t c n nh lư ng. - S h p th c a ch t l , thu c th cũng có th nh hư ng t i k t qu nh lư ng. Vì v y trong quá trình làm ph n ng ″t o màu″, ph i chú ý t i i u ki n ph n ng và các thành ph n tham gia ph n ng. 1.4.1.4. M t s i lư ng thông d ng[ a/ truy n qua (T-Transmittance): truy n qua (hay còn g i là th u quang) c trưng cho trong su t (v m t quang h c) c a dung d ch, ư c nh nghĩa: T= I t = 10- Cl I 0 Thư ng T tính ra ph n trăm (%). M t ch t có T=1(hay100%), nghĩa là hoàn toàn không có h p th ánh sáng, ngư i ta nói ch t ó hoàn toàn trong su t. b/ h p th (A-Absorbance): h p th (hay còn g i là m t quang) ư c nh nghĩa : 1 A = lg = .C.l T 15
i v i m t ch t xác nh (có xác nh), thư ng o trên m t lo i c c o (có b dày thông thư ng là l=1 cm), như v y h p th t l thu n v i n ng dung d ch: A=K.C (K= .l) c/ H s hâp th ph n trăm ( E 1cm ): 1% Theo công th c A = .C.l, n u l=1 cm, C=1% thì : 1cm A= = E 1% 1cm V y E 1% chính là h p th c a dung d ch có n ng 1%, dùng c c o 1cm có b dày 1cm. V i m t ch t tan xác nh, t i m t xác nh, E 1% là m t h ng s . d/ H s h p th phân t ( ): H s h p th phân t , hay còn g i là h s t t mol là h p th c a dung d ch có n ng 1M/l, dùng c c o có b dày1cm. 1cm Cũng như E 1% , v i m t ch t xác nh, trong nh ng i u ki n o xác nh ( , dung môi, nhi t ,...) là m t h ng s . 1cm Gi a E 1cm 1% và có m i liên h = E 1% × M 10 ây M là phân t gam c a ch t tan. 1.4.2. M t s k thu t nh lư ng b ng phương pháp quang ph UV- VIS.[2],[4],[8] 1.4.2.1. Phương pháp o ph tr c ti p: o h p th c a dung d ch, tính n ng C c a dung d ch d a vào giá 1cm tr E 1% bi t trư c (tra c u). 1cm A A= E 1% .C.l → C= 1cm (v i l =1 cm) E 1% 16
Trong phương pháp này, ph i chú ý ki m tra máy o v bư c sóng ( ) và m t quang A b ng cách:  Dùng èn thu ngân, èn D2 (cho m t v ch sáng có bư c sóng xác nh).  Dùng m t m u chu n, o và i u ch nh tìm sai s .  Dùng m t kính l c Holmium (có các giá tr max xác nh cho trong tài li u ) ki m tra l i máy.  Dùng dung d ch K2CrO4, K2Cr2O7 tinh khi t quang ph pha thành dung d ch có n ng chính xác. o ph tìm các giá tr max và tìm Amax . 1.4.2.2. Phương pháp so sánh o h p th Ax, Ac c a dung d ch th có n ng Cx (chưa bi t) và c a dung d ch chu n có n ng Ac ( ã bi t). Ta có: A x = C x → Cx = A x x Cc A c C c A c Chú ý: n ng c a dung d ch th Cx và c a dung d ch chu n Cc không ư c chênh l ch nhau quá nhi u. N ng dung d ch này càng g n nhau, k t qu càng chính xác. Ngoài ra còn có các k thu t nh lư ng khác như: phương pháp ư ng chu n, phương pháp thêm ư ng chu n, phương pháp chu n o quang, phương pháp nh lư ng h n h p theo nguyên t c c ng ph . 17
PH N 2: TH C NGHI M VÀ K T QU 2.1. Nguyên v t li u và phương pháp nghiên c u 2.1.1. Nguyên li u, hoá ch t, thu c th : 2.1.1.1. i tư ng nghiên c u: . Berberin clorid: Ch t chu n hàm lư ng 83,3% do Vi n ki m nghi m thu c TW cung c p . Berberin clorid d ng nguyên li u do b môn Hoá Dư c cung c p . Palmatin: do vi n ki m nghi m thu c TW cung c p 2.1.1.2. Hoá ch t, thu c th : . Mu i potasium dihydrophosphate (KH2PO4), acid phosphoric (H3PO4) . Heptane sodium sulfonate, triethylamine . Acetonitril dùng cho HPLC (Merk) . Nư c c t 2 l n (c t tr c ti p t i B môn Hóa vô cơ trư ng ih c Dư c Hà N i) dùng cho máy HPLC . M t vài hóa ch t khác 2.1.1.3. Thi t b : + Máy s c ký l ng hi u năng cao: DIONEX- Detector UV Diode array- PDA 100 + Cân phân tích AY 220 , Max = 220 g, chính xác 0,1 mg + Máy o pH JENWAY c a Anh + Máy c t nư c 2 l n + Máy l c siêu âm EBRO ARMATUREN c a c 18
+ Máy l c hút chân không Satorius + Bình nh m c các lo i: 20,0 ml; 25,0 ml; 100,0 ml ... + C c có m : các lo i 100; 200; 500 + Pipet chính xác, pipet thư ng, ũa th y tinh. + Bơm tiêm, l ng m u, màng l c 0,45 µm... 2.1.2. Phương pháp nghiên c u: 2.1.2.1. Ch tiêu nghiên c u: . Phân tích m u th b ng phương pháp HPLC và phương pháp o quang ph h p th UV- VIS . ánh giá chính xác, tính úng, tính tuy n tính, tính c hi u c a hai phương pháp trên . So sánh 2 phương pháp trên 2.1.2.2. Phương pháp xác nh các ch tiêu nghiên c u:  Nghiên c u trên lý thuy t và tài li u tham kh o l a ch n phương pháp phân tích  B ng th c nghi m, d a vào k t qu thu ư c, x lý th ng kê và rút ra k t lu n  Phương pháp s d ng trong th c nghi m: HPLC, o quang ph h p th UV-VIS 2.1.2.3.Phương pháp x lý s li u th ng kê: . D li u thu ư c ư c x lý b ng phương pháp th ng kê - s d ng công c h tr là ph n m m Microsoft Excel .M ts c trưng th ng kê ư c s d ng: n - Giá tr trung bình: 1 x = n ∑x i =1 i n ∑ (x ) 2 i −x - l ch chu n: S= i =1 n −1 19
S - l ch chu n tương i (RSD): RSD% = × 100 x S - Sai s chu n : s x = n - Sai s tương i: ε (% ) = t α ( n −1 ) × s x × 100 x - Kho ng tin c y: µ = x ± tαSx Trong ó : xi là k t qu xác nh l n th i ; n là s l n xác nh + Tiêu chu n Fischer ánh giá chính xác hay l pl ic a2 2 phương pháp thí nghi m khác nhau : Ftn = S 1 ; trong ó S1 > S2 2 S 2 Ftn>Flt : chính xác hay l p l i c a hai phương pháp khác nhau có ý nghĩa th ng kê  Ftn>Flt : chính xác hay l p l i c a hai phương pháp khác nhau có ý nghĩa th ng kê  Ftn X 2) v i = ( n − 1) S + ( n − 1) S 1 1 2 2 S Sp 1 + 1 p n +n −2 1 2 n1 n 2 20