Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp glycoprotein (GP5) của virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRSV)

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:54

Thêm vào BST

Báo xấu

33
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm thiết kế được vector biểu hiện protein tái tổ hợp GP5; biểu hiện và tinh sạch được protein tái tổ hợp GP5 của Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp glycoprotein (GP5) của virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRSV)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP GLYCOPROTEIN (GP5) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN (PRRSV) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên, 2015 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn của PGS.TS. Lê Văn Sơn các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận văn Hà Đăng Chiến Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Lê Văn Sơn đã tận tình chỉ bảo và hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình triển khai, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các Thầy, Cô giáo – Các nhà khoa học đã trực tiếp giảng dạy truyền đạt những kinh nghiệm, kiến thức khoa học quý báu. Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô, đồng nghiệp và bạn bè đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi luôn trân trọng và biết ơn sự giúp đỡ hết mình đó. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ nghiên cứu thuộc Phòng Công nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi cũng xin cám ơn Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen đã cung cấp kinh phí, thiết bị cũng nhƣ cho phép tôi sử dụng các kết quả nghiên cứu thuộc đề tài NV07-PTNTDD2015. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các cán bộ của cơ sở đào tạo thuộc Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng nhƣ quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tác giả luận văn Hà Đăng Chiến Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt bp Base Pairs Cặp bazơ nitơ CS Cộng sự DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxynucleoside Triphosphate E.coli Escherichia coli EtBr Ethidium Bromide EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid GP5 Glycoprotein 5 IPTG Isopropylthio-β-Galactoside kb Kilobase kDa Kilodalton Môi trƣờng dinh dƣỡng cơ LB Luria Bertani bản nuôi cấy vi khuẩn MES 2-(N-morpholino)Etansulfonic acid OD Optical Density Mật độ quang PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp Porcine Reproductive and Hội chứng rối loại hô hấp PRRS Respiratory Syndrome và sinh sản ở lợn Porcine Reproductive and Virus gây hội chứng rối loại PRRSV Respiratory Syndrome virus hô hấp và sinh sản ở lợn RNA Ribonucleic Acid RNase Ribonuclease SDS Sodium Dodecyl Sulphate TAE Tris-Acetate-EDTA TBS Tris-Buffered Saline TTBS Tween Tris-Buffered Saline v/p Vòng/ phút 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Beta- X-gal D-Galacto-Pyranoside Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................... iii MỤC LỤC ...................................................................................................... iv DANH MỤC HÌNH........................................................................................ vi MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ......................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu: ................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu: .................................................................................. 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 3 1.1. Tổng quan về PRRS ................................................................................. 3 1.1.1. Khái niệm PRRS................................................................................. 3 1.1.2. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn ..................................... 3 1.1.3. Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRSV) .............. 8 1.2. Protein tái tổ hợp .................................................................................... 11 1.2.1. Giới thiệu .......................................................................................... 11 1.2.2. Glycoprotein (GP5) .......................................................................... 12 1.2.3. Sản xuất protein tái tổ hợp dựa trên ORF5 ...................................... 13 1.2.4. Vector biểu hiện pET 32a(+) và chủng biểu hiện BL21 ................. 14 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 16 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
v 2.1. Vật liệu.................................................................................................... 16 2.1.1. Nguyên liệu ....................................................................................... 16 2.1.2. Hóa chất và môi trƣờng .................................................................... 18 2.1.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ......................................................... 19 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................ 19 2.2.1. Tạo dòng gen gp5 ............................................................................. 19 2.2.2. Tạo vector tái tổ hợp mang gen gp5 ................................................ 21 2.2.3. Phƣơng pháp biểu hiện và tinh sạch protein GP5 ........................... 25 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 29 3.1. Tạo dòng vector mang gen mã hóa protein GP5 .................................... 29 3.2. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen mã hóa protein GP5 ...................... 32 3.3. Biểu hiện và tinh sạch protein GP5 trong E.coli .................................... 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 41 1. Kết luận ...................................................................................................... 41 2. Đề nghị....................................................................................................... 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 42 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hệ gen của virus PRRS ................................................... 10 Hình 2.1. Sơ đồ vector tách dòng pBT .......................................................... 16 Hình 2.2. Cấu trúc vector biểu hiện pET 32a(+) ........................................... 17 Hình 3.1. Kết qủa điện di sản phẩm colony - PCR khuẩn lạc mang gen GP5 ...... 30 Hình 3.2. Kết quả cắt kiểm tra và tinh sạch pBT-GP5 .................................. 31 Hình 3.3. Kết quả cắt kiểm tra plasmid pET 32a(+) bằng enzyme cắt giới hạn SacI và HindIII .............................................................................................. 32 Hình 3.4. Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn SacI và HindIII .............................................................................................. 34 Hình 3.5. Kết quả điện di SDS-PAGE dịch nuôi vi khuẩn mang vector tái tổ hợp ………. ........................................................................................ 35 Hình 3.6. Kết quả phân tích Western blot với kháng thể anti-His-tag (pha loãng 1:1000 lần) ........................................................................................... 36 Hình 3.7. Khảo sát nồng độ Imidazol để tinh sạch sản phẩm ...................... 38 Hình 3.8. Kết quả điện di kiểm tra GP5 tinh sạch bằng sắc ký ái lực Ni-NTA..... 39 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Tên thiết bị thí nghiệm .................................................................. 19 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR ........................................................... 20 Bảng 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ............................................... 20 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng cắt pBT mang gen GP5 ............................. 22 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng cắt pET 32a(+) .......................................... 22 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng ghép nối gen .............................................. 24 Bảng 2.7. Thành phần gel điện di protein (SDS-PAGE)............................... 26 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS - Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), tại Việt Nam còn gọi là bệnh “lợn tai xanh” (Blue Ear), đƣợc xem là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất trên lợn từng đƣợc ghi nhận trên thế giới và đƣợc ghi nhận lần đầu tiên tại Bắc Mỹ năm 1987, do lợn mắc bệnh thƣờng bị xung huyết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm sau đó tím xanh. Đặc trƣng của bệnh, với lợn cái, PRRS gây hậu quả nghiêm trọng nhƣ sảy thai, đẻ non, lợn con sinh ra yếu ớt, chết non, tình trạng bệnh âm ỉ gây rối loạn sinh sản nhƣ động dục kéo dài, chậm động dục trở lại. Đối với lợn đực giống, PRRS làm giảm số lƣợng tinh dịch, chất lƣợng tinh dịch kém, ảnh hƣởng đến tỷ lệ thụ thai và chất lƣợng đàn con [9]. “Lợn tai xanh” là bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm, do virus PRRS (PRRSV), thuộc họ Arteriviridae, bộ Nidovirales gây ra. Bệnh lây lan nhanh và làm chết nhiều lợn nhiễm bệnh [1]. Hiện nay, PRRS đã và đang trở thành dịch ở nhiều nƣớc trên thế giới, gây tổn thất nặng nề cho nền kinh tế. PRRS lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở Hoa Kỳ vào năm 1987, châu Âu tại Đức năm 1990, tại Hà Lan năm 1991 và tại châu Á vào đầu những năm 1990 [36]. Tại Việt Nam, PRRSV đƣợc phát hiện trên đàn lợn nhập từ Mỹ năm 1997 bằng phản ứng huyết thanh học. Gần đây, từ tháng 3 năm 2007 đến nay, liên tiếp xảy ra các đợt dịch bệnh ở nhiều địa phƣơng trong cả nƣớc, gây thiệt hại hàng trăm tỷ đồng cho ngành chăn nuôi do phải tiêu huỷ lợn bệnh nhằm ngăn chặn nguồn virus lây nhiễm [7]. Virus PRRS có tính thích ứng rất cao đối với các đại thực bào ở phổi. Hệ gen của PRRSV là phân tử RNA sợi đơn dƣơng, có cấu trúc tƣơng tự cấu trúc của Coronavirus, gồm 7 khung đọc mở gối lên nhau mã hóa cho 7 protein của virus gồm: GP1, GP2, GP3, GP4, GP5, M và N. Trong số đó, protein GP5 (glycoprotein 5) đƣợc mã hoá bởi ORF5, là một protein đƣợc Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
2 glycosyl hoá, gắn với màng bọc ngoài của PRRSV, có tính kháng nguyên mạnh và chịu trách nhiệm gây bệnh của virus. Protein GP5 là đích chủ yếu của các kháng thể trung hoà, tham gia vào cơ chế “lẩn tránh” đáp ứng miễn dịch cơ thể vật chủ của PRRSV, do ngăn cản hiện tƣợng trình diện kháng nguyên virus của các đại thực bào với các tế bào có thẩm quyền miễn dịch trong cả đáp ứng miễn dịch dịch thể và qua trung gian tế bào (CMI-cell mediated immunity). Ngoài ra, GP5 còn tham gia hiện tƣợng “chết theo chƣơng trình” (apoptosis) của các tế bào trong cơ thể bị nhiễm PRRSV. Sự biến đổi của GP5 là một trong những nguyên nhân làm gia tăng khả năng lây nhiễm và gây bệnh của PRRSV, làm cho bệnh dịch PRRS ngày càng phức tạp, do làm giảm hiệu quả phòng bệnh của các vaccine phòng bệnh đang lƣu hành. Chính vì vậy, nghiên cứu protein tái tổ hợp GP5 của PRRSV là thực sự cần thiết, giúp cho chẩn đoán xác định bệnh và sản xuất vaccine tái tổ hợp thế hệ mới nhằm khống chế, giảm bớt thiệt hại do virus PRRSV gây ra. Từ những cơ sở lý luận khoa học và những nghiên cứu của các nhà khoa học trong và ngoài nƣớc chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp glycoprotein (GP5) của vius gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRSV)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Thiết kế đƣợc vector biểu hiện protein tái tổ hợp GP5. Biểu hiện và tinh sạch đƣợc protein tái tổ hợp GP5 của Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus. 3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu tạo dòng vector mang gen gp5: Dựa trên thông tin về trình tự nucleotide của gen gp5 đã công bố, thiết kế các cặp mồi phù hợp để phân lập kiểm tra và nhân gen bằng PCR. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
3 - Nghiên cƣ́u thi ết kế vector tái tổ hợp pET 32a(+) mang gen mã hóa cho protein GP5. - Biểu hiện GP5 trong E. coli BL21 và tinh sạch protein tái tổ hợp (GP5 ) bằng sắc ký ái lực Ni-NTA. Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về PRRS 1.1.1. Khái niệm PRRS Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndome, PRRS), là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho lợn. Biểu hiện đặc trƣng là các rối loạn sinh sản ở lợn cái nhƣ sảy thai, thai chết lƣu, lợn sinh ra chết yểu, cũng nhƣ lợn con theo mẹ và lợn cái hậu bị còn thể hiện viêm đƣờng hô hấp rất nặng nhƣ: sốt, ho, khó thở, chết với tỷ lệ cao [6], [20]… Bệnh còn đƣợc gọi bằng một số tên khác nhƣ: Bệnh bí hiểm ở lợn (Mystery Disease Syndome). Hội chứng vô sinh và hô hấp ở lợn, viết tắt là SIS (Swine Infertility and Respiratory Syndromde). Hội chứng hô hấp và sảy thai ở lợn, viết tắt là PEARS (Porcine Endemic and Respiratory Syndrome). Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome). Bệnh lợn tai xanh (Blue- ear Disease). Năm 1992, Hội nghị quốc tế về bệnh này đƣợc tổ chức tại St. Paul, Minnesota (Mỹ) đã nhất trí dùng tên hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) và đƣợc tổ chức Thú Y thế giới công nhận. Bệnh đƣợc gây ra bởi virus PRRS, tồn tại dƣới dạng hạt virion gây nhiễm. 1.1.2. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn * Cơ chế gây bệnh và các phƣơng pháp lan truyền Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
4 Virus gây PRRS có trong dịch mũi, nƣớc bọt, phân và nƣớc tiểu của lợn ốm hoặc lợn mang trùng và phát tán ra môi trƣờng; tinh dịch của lợn đực giống nhiễm virus cũng là nguồn lây lan bệnh. Ở lợn cái mang thai, virus có thể từ mẹ xâm nhiễm sang bào thai và gây bệnh. Virus gây PRRS có thể xâm nhập vào cơ thể lợn theo đƣờng hô hấp, tiêu hóa và đƣờng âm đạo. Sau khi xâm nhập, đích tấn công chủ yếu của virus là các đại thực bào ở phế nang. Đây là tế bào duy nhất có receptor phù hợp với cấu trúc hạt của virus, vì thế chúng hấp thụ và thực hiện quá trình nhân lên chỉ trong loại tế bào này và phá hủy nó. Ở lợn mắc bệnh, một tỷ lệ lớn các tế bào đại thực bào trong nang phổi bị virus xâm nhập rất sớm và phá hủy làm giảm khả năng phòng vệ của phổi. Lúc đầu, PRRSV có thể kính thích sự tăng sinh của đại thực bào nhƣng sau 2-3 ngày, virus này sẽ giết chết chúng, các virion đƣợc giải phòng ồ ạt xâm nhiễm sang các tế bào khác, tiếp tục quá trình nhân lên và phá hủy đại thực bào. Trong cơ thể lợn ốm do mắc PRRS có tới 40% tế bào đại thực bào bị virus giết chết [17]. Trong hệ thống miễn dịch của cơ thể, đại thực bào đóng vai trò vô cùng quan trọng, cả trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu, đây là loại tế bào trình diện kháng nguyên thiết yếu. Khi đại thực bào bị phá hủy bởi PRRSV mở đầu cho quá trình miễn dịch không xảy ra đƣợc, cơ thể lợn rơi vào trạng thái suy giảm miễn dịch và dễ dàng mắc các bệnh nhiễm trùng thứ phát, điều này có thể thấy rõ ở những đàn lợn vỗ béo chuẩn bị giết thịt, khi bị nhiễm PRRSV sẽ có sự tăng đột biến về tỷ lệ viêm phổi kế phát do những vi khuẩn vốn sẵn có trong đƣờng hô hấp nhƣ Mycoplasma hyopneumoniae, P. multocida, S. suis, A. pleuropneumoniae... Tiêu Quang An và Nguyễn Hữu Nam (2011) [1] khi xác định một số vi khuẩn kế phát gây chết lợn trong vùng dịch PRRS ở huyện Văn Lâm, tỉnh Hƣng Yên năm 2010 đã cho thấy lợn mắc PRRS thƣờng kế phát bệnh do các nhóm vi khuẩn đƣờng hô hấp và đƣờng ruột nhƣ A. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
5 pleuropneumoniae, P. multocida, S.suis, Escherichia coli, Salmonella sp, Clostridium perfringens. Kết quả phân lập đƣợc vi khuẩn A. pleuropneumoniae với tỷ lệ cao nhất 63.33% và thấp nhất là P. multocida 10%[2]. Các tác giả nhận định các nhóm vi khuẩn kế phát trên đã làm cho dịch PRRS trầm trọng và phức tạp hơn. * Các biện pháp phòng bệnh Hiện nay chƣa có thuốc điều trị đặc hiệu lợn mắc PRRS, do vậy việc phòng bệnh bằng vaccine và vệ sinh phòng bệnh, tiêu độc khử trùng hiện đang là hai biện pháp hữu hiệu ở nhiều cơ sở chăn nuôi lợn. Để chủ động phòng chống dịch, cần thực hiện đồng bộ, kiên quyết các giải pháp phòng, chống dịch nhƣ: Phát hiện sớm, bao vây xử lý kịp thời các ổ dịch; công tác tuyên truyền thực hiện sâu rộng tới các ngành, các cấp và ngƣời dân tham gia chăn nuôi; đặc biệt có sự chỉ đạo quyết liệt của chính quyền các cấp từ Trung ƣơng tới các địa phƣơng. Trƣờng hợp có tỷ lệ lợn trong đàn kiểm tra huyết thanh dƣơng tính cao thì tiêu hủy là phƣơng pháp hiệu quả. Tuy nhiên, phƣơng pháp tiêu hủy rất tốn kém và có thể dẫn đến mất đi những giống thuần. Điều này cho thấy trong chăn nuôi lợn việc chẩn đoán sớm những con lợn mang trùng mà chƣa có dấu hiệu lâm sàng là rất cần thiết và cấp bách. Các biện pháp quản lý không đƣợc kết hợp để cải thiện điều kiện chăn nuôi thì nguy cơ dịch viêm phổi vẫn sẽ tồn tại [35]. * Tình hình dịch bệnh trên thế giới và ở Việt Nam + Trên thế giới Từ năm 2005 trở lại đây, 27 nƣớc và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châu lục trên thế giới đã báo cáo cho Tổ chức Thú y thế giới khẳng định phát hiện có bệnh Tai xanh lƣu hành. Hiện nay, hội chứng này đã trở thành dịch địa phƣơng ở nhiều nƣớc trên thế giới, kể cả các nƣớc có ngành chăn nuôi lợn phát triển nhƣ Mỹ, Hà Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
6 Lan, Đan Mạch, Anh, Pháp, Đức... và đã gây ra những tổn thất rất lớn về kinh tế cho ngƣời chăn nuôi lên đến hàng trăm triệu đô la [27]. Nhƣ hàng năm Mỹ phải chịu tổn thất cho bệnh Tai xanh gây ra khoảng 560 triệu USD. Các nƣớc trong khu vực có tỷ lệ bệnh Tai xanh lƣu hành rất cao. Ở Trung Quốc là 80%. Đài Loan là 94,7% - 96,4%, Philippine là 90%, Thái Lan là 97%, Malaysia là 94%, Hàn Quốc là 67,4% - 73,1%[5]. Tại Trung Quốc: Theo báo cáo của đoàn chuyên gia quốc tế và chuyên gia của Trung Quốc đã đƣợc phát hành vào tháng 12/2007, kể từ năm 2006, đàn lợn của Trung Quốc đã bị ảnh hƣởng nghiêm trọng bởi "Hội chứng sốt cao ở lợn" do nhiều nguyên nhân, trong đó chủ yểu là virus PRRS và các loại mầm bệnh này đã làm hàng triệu lợn bị ốm, chết và phải tiêu hủy. Kết quả nghiên cứu toàn diện của Trung Quốc đã khẳng định chủng virusPRRS gây bệnh tại nƣớc này là chủng độc lực cao, đặc biệt có sự biến đổi của virus (thiếu hụt 30 acid amin trong gen). Năm 2007, các tỉnh Anhui, Hunan, Guangdong, Shandong, Liaoning, Jilin và một số tỉnh khác bị ảnh hƣởng nặng buộc Trung Quốc phải tiêu hủy tới 20 triệu lợn để ngăn chặn dịch lây lan. Trƣớc diễn biến phức tạp của dịch Tai xanh, Bộ Nông Nghiệp Trung Quốc đang thực hiện chƣơng trình phòng chống bệnh rất quy mô, riêng chƣơng trình nghiên cứu, sản xuất vaccine đã đƣợc cam kết chi khoảng 280 triệu Nhân dân tệ tƣơng đƣơng với 36,5 triệu USD [25]. Tại Hồng Kông và Đài Loan đã xác định có cả hai chủng Châu Âu và Bắc Mỹ cùng lƣu hành, đặc biệt trong cùng một con lơn ở Hồng Kông đã xác định nhiễm cả hai chủng nêu trên; dịch Tai xanh cũng đƣợc thông báo ở Thái Lan từ các năm 2000 - 2007. Thông báo cho biết các virus gây bệnh Tai xanh đƣợc phân lập từ nhiều địa phƣơng thuộc nƣớc này gồm cả chủng dòng châu Âu và chủng dòng Bắc Mỹ. Trong đó, số virus thuộc chủng dòng châu Âu chiếm 66,42%, còn các virus thuộc chủng dòng Bắc Mỹ chiếm Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
7 33,58%. Phần lớn ở những quốc gia này hiện còn đang lƣu hành virus gây bệnh Tai xanh chủng châu Âu hoặc Bắc Mỹ, là những chủng virus cổ điển độc lực thấp [13]. Tháng 9/2007, Nga là nƣớc thứ 3 đã báo cáo chính thức có dịch bệnh Tai xanh do chủng virus PRRS thể độc lực cao gây [16]. + Tại Việt Nam Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam, 10 trong số 51 con có huyết thanh dƣơng tính với PRRS và cả đàn đƣợc tiêu hủy ngay [6]. Tuy nhiên, theo điều tra ở một số địa bàn thuộc thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận cho thấy 25% mẫu huyết thanh lợn có kháng thể virut PRRS (596/2308 mẫu) và 5/15 trại (chiếm 33%) có lƣu hành huyết thanh bệnh lợn Tai xanh. Năm 2003, tỷ lệ huyết thanh dƣơng tính với bệnh tai xanh trên lợn nuôi tập trung ở Cần Thơ là 66,86%. Nhƣ vậy, PRRS đã đƣợc phát hiện ở Việt Nam từ năm 1997, tuy nhiên, từ năm 1997 đến trƣớc tháng 3 năm 2007 chƣa phát hiện các ổ dịch lâm sàng trên đàn lợn. Việc xảy ra các ổ dịch lần đầu ở các tỉnh phía Bắc có liên quan đến tình hình dịch ở các nƣớc láng giềng. Theo thông báo của các tổ chức quốc tế, trong năm 2006, dịch xảy ra nghiêm trọng ở một số nƣớc trong khu vực. Từ tháng 3 năm 2007 đến nay, liên tiếp xảy ra các đợt dịch bệnh ở nhiều địa phƣơng trong cả nƣớc, gây thiệt hại hàng trăm tỷ đồng cho ngành chăn nuôi do phải tiêu huỷ lợn bệnh nhằm ngăn chặn nguồn virus lây nhiễm. Mặc dù chƣa có những nghiên cứu cụ thể về tốc độ lây lan của virus, nhƣng quan sát dịch tễ học đợt dịch lần thứ nhất (tháng 3, 4 năm 2007) cho thấy chỉ một thời gian ngắn sau khi Hải Dƣơng có dịch thì sáu tỉnh lân cận của vùng đồng bằng Bắc Bộ là Hƣng Yên, Quảng Ninh, Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hải Phòng. Số lợn mắc bệnh 31.750 con, số lợn chết và xử lý 7.296 con [15]. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
8 1.1.3. Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRSV) Qua nghiên cứu giải mã gen của virus tại Mỹ và Trung Quốc cho thấy các chủng PRRSV tại Việt Nam có mức tƣơng đồng về amino acid từ 99% đến 99,7% so với chủng virus gây bệnh thể độc lực cao ở Trung Quốc và đều bị mất 30 axít amin. Điều này cho thấy các chủng PRRSV ở nƣớc ta hiện nay thuộc dòng Bắc Mỹ, có độc lực cao giống chủng ở Trung Quốc [16]. Nhiều nghiên cứu của các tác giả trong nƣớc từ năm 2009 đến nay đã nhận định PRRSV tại Việt Nam hiện nay đƣợc xác định thuộc chủng Bắc Mỹ dòng Trung Quốc [3], [8], [10], [14].  Đặc tính sinh học của virus Virus gây PRRS rất thích hợp với đại thực bào, đặc biệt là đại thực bào hoạt động ở vùng phổi. Virus nhân lên ngay bên trong đại thực bào, sau đó phá huỷ và giết chết đại thực bào (tới 40%). Đại thực bào bị giết chết nên sức đề kháng của lợn mắc bệnh bị suy giảm nghiêm trọng. Do vậy lợn mắc PRRS thƣờng dễ bị nhiễm khuẩn thứ phát. Virus không gây ngƣng kết với các loại hồng cầu gà, dê, thỏ, chuột, hồng cầu type O của ngƣời. Virus phát triển tốt trên môi trƣờng tế bào đại thực bào phế nang lợn, trên tế bào dòng CL 2621, tế bào MA 140 với bệnh tích phá huỷ tế bào, sau 2- 6 ngày tế bào co tròn, tập trung thành cụm dày lên, nhân co lại cuối cùng bong ra [17]. Tuy có một số khác biệt về di truyền và kiểu hình nhƣng các chủng virus Bắc Mỹ và các chủng virus Châu Âu lại cùng gây ra các triệu chứng lâm sàng về hô hấp và sinh sản ở lợn rất giống nhau. Dựa vào những kết quả nghiên cứu tổn thƣơng đại thể và vi thể của tổ chức phổi lợn mắc bệnh, ngƣời ta chia ra hai nhóm virus là nhóm virus có độc lực cao và nhóm virus có độc lực thấp. Nhóm virus có độc lực cao thƣờng gây ra các tổn thƣơng ở tổ chức phổi lợn bệnh nặng hơn nhóm virus có độc lực thấp. Năm 2007, Kegong Tian và Yu khi nghiên cứu về sự biến đổi về độc lực của PRRSV tại Trung Quốc cho Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
9 rằng virus đã có sự biến đổi về độc lực và hậu quả lợn nhiễm virus này có tỷ lệ chết cao, trên 20% trong tổng số nhiễm bệnh [34].  Sức đề kháng và khả năng gây bệnh của virus + Sức đề kháng của virus. Virus gây PRRS có thể tồn tại một năm ở nhiệt độ lạnh từ -20 đến -70 o C; trong điều kiện 4oC virus có thể sống một tháng; nhiệt độ cao virus đề kháng kém ở 37oC chịu đƣợc 48 giờ, 56oC bị chết sau một giờ, virus thích hợp ở pH 5 -7. Với các chất sát trùng thông thƣờng và môi trƣờng có pH axit, virus dễ dàng bị tiêu diệt. Dƣới tác động của ánh nắng mặt trời hoặc tia tử ngoại vô hoạt virus nhanh chóng [10], [12]. + Khả năng gây bệnh của virus Ngƣời và các động vật khác không mắc PRRS, tuy nhiên trong các loài thuỷ cầm chân màng có vịt trời (Mallard duck) lại mẫn cảm. Virus có thể nhân lên ở loài động vật này và chính đây là nguồn reo rắc mầm bệnh trên diện rộng nên rất khó khống chế [18]. Virus gây bệnh cho lợn ở tất cả các lứa tuổi, nhƣng lợn con và lợn cái mang thai thƣờng mẫn cảm hơn cả. Lợn rừng là động vật mang trùng và có thể coi là nguồn dịch thiên nhiên [12]. Về độc lực, các nghiên cứu cho thấy virus gây PRRS tồn tại dƣới 2 dạng đó là dạng cổ điển và dạng biến thể độc lực cao. Dạng cổ điển có độc lực thấp, ở dạng này khi lợn mắc bệnh thì có tỷ lệ chết thấp, chỉ từ 1 - 5% trong tổng đàn. Dạng biến thể độc lực cao gây nhiễm bệnh cho lợn lây lan nhanh, trầm trọng và chết nhiều [34]. + Cấu trúc và chức năng của virus Cấu trúc: Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
10 Hình 1.1. Cấu trúc hệ gen của virus PRRS Dƣới kính hiển vi điện tử PRRSV là loại có vỏ bọc, hình cầu, có kích thƣớc từ 45 - 80 nm, chứa nhân nucleocapsid có kích thƣớc từ 25 - 35 nm, trên bề mặt có gai nhô ra rõ, có vỏ là lipid [17]. Virus gây PRRS là ARN virus với bộ gen là một phân tử ARN sợi đơn dƣơng, có những đặc điểm chung của nhóm Arterivirus. Sợi ARN này có kích thƣớc khoảng 15 kilobase, có chín ORF (open reading frame) mã hoá cho chín protein cấu trúc. Tuy nhiên, có sáu phân tử protein chính có khả năng trung hoà kháng thể bao gồm bốn phân tử glycoprotein, một phân tử protein xuyên màng (M) và một protein nucleocapsid (N) [12]. Qua các nghiên cứu cho thấy sợi đơn RNA của virus bao gồm một bộ gen có khoảng 15 kb, mã hóa 9 ORFs [7]. Bộ gen PRRSV bao gồm hai gen ORF1a và ORF1b là polymerase và bẩy gen cấu trúc là ORF2a, 2b, 3, 4, 5, 6 và 7. ORF1a và ORF1b cấu thành khoảng 75% bộ gen của virus và đƣợc đặc trƣng bởi một quá trình khung ribosome chuyển dịch thành một polyprotein lớn mà sự phân tách làm phát sinh các protein không cấu trúc (NSP) bao gồm cả RNA phụ thuộc Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
11 Polymerase. Các khung đọc mở ORF2a, 3, 4 và 5 tất cả mã hóa cho các protein glycosyl hóa là GP2a, GP3, GP4, GP5 tƣơng ứng. Các ORF2b mới đƣợc định nghĩa mã hóa các protein nhỏ nhất của các hạt virus đƣợc chỉ định GP2b. ORF7 mã hóa các protein nuclocapsid không glycosyl hóa (N) [24]. - Chức năng: ORF1a và ORF1b nằm ở đầu 5’ của genome, chiếm hơn hai phần ba bộ gen và mã hóa cho RNA Polymerase của virus đƣợc xem là protein chịu trách nhiệm trong quá trình nhân lên của virus. ORF2 đến ORF7 nằm ở phía sau của ORF1b, ở đầu 3’ của genome, mã hóa cho các protein cấu trúc liên quan đến việc hình thành virion. Sản phẩm của các ORF 5, 6, 7 bao gồm các protein chính của virus. Cho đến nay ngƣời ta đã xác định đƣợc 3 protein cấu trúc chính của PRRS đó là: Protein nhân (N-nucleocapsid) trọng lƣợng phân tử khoảng 15 kDa định bởi ORF7, protein màng (M-membrane) trọng lƣợng khoảng 19 kDa quy định bởi ORF6 và protein vỏ glycoprotein (E-envelope, GP5) trọng lƣợng khoảng 24-25 kDa quy định bởi ORF5. Những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng ORF 2, 3 và 4 của Lelystad virus(LV), chủng Châu Âu của PRRS virus có lẽ mã hóa cho 3 membrane-associated glycoprotein khác là: 29-30 kD GP2, 45-50 kD GP3, 31-35kD GP4 [22], [23], [33]. 1.2. Protein tái tổ hợp 1.2.1. Giới thiệu Hiện nay nhu cầu sử dụng kháng nguyên là protein trong chuẩn đoán bệnh lý cũng nhƣ sản xuất vaccine là rất cao. Tuy nhiên, PRRSV thƣờng khó nuôi trên môi trƣờng tế bào. Chúng chỉ phát triển tốt trên môi trƣờng đại thực bào túi phổi heo (PAM) và một số dòng tế bào thận khỉ Châu Phi. Hiện tại Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
12 ngƣời ta chƣa thành công trong việc tuyển lựa các dòng tế bào này trong nuôi cấy nhân tạo. Các dòng tế bào thận khỉ thƣờng không nhạy cảm cho tất cả các chủng virus PRRS. Chính vì thế phƣơng pháp sản xuất protein tái tổ hợp cho PRRSV là hƣớng đi đúng và mang lại nhiều ƣu điểm, đặc biệt sản xuất protein tái tổ hợp mã hóa bởi ORF5 mang tính ứng dụng cao trong các thử nghiệm nhƣ dùng làm vật liệu trong các kit chẩn đoán, tạo vaccine tái tổ hợp thế hệ mới… Sản xuất protein tái tổ hợp mở ra khả năng tạo số lƣợng lớn kháng nguyên dùng làm vật liệu trong chẩn đoán nhất là khi dịch bệnh bùng phát. Sản xuất protein tái tổ hợp cũng góp phần khắc phục đƣợc nhƣợc điểm hiện tại là khó nuôi cấy PRRSV trên môi trƣờng tế bào nhƣ đã nêu ở trên. 1.2.2. Glycoprotein (GP5) ORF5 của PRRSV mã hóa cho protein vỏ GP5 có kích thƣớc khoảng 25 kDa. GP5 nằm trên bề mặt màng virus chính là vị trí tiếp xúc của PRRSV khi nó nhiễm vào vật chủ. GP5 là một trong những glycoprotein vỏ phong phú và đa dạng nhất, là một tác nhân gây cảm ứng chính của kháng thể trung hòa trong cơ thể. Nó bao gồm ba vị trí glycosylation đƣợc cho là N-linked N34, N44, N51 nơi mà vị trí trung hòa virus đƣợc đặt tại đó [21]. Plagemann và cs (2002) đã sử dụng bản đồ peptit để chỉ ra rằng các vị trí trung hòa virus chính của PRRSV đƣợc đặt tại vị trí giữa của GP5 từ acid amin 36 đến 52. GP5 đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ chống lại PRRSV. Vì vậy GP5 rất đƣợc quan tâm nghiên cứu trong việc phân tích dịch tễ học và tiến hóa phân tử cũng nhƣ biến đổi vật liệu di truyền của chủng virus này. Điển hình là các peptide tín hiệu, vùng ngoại bào virus, vùng xuyên màng và vùng nội bào virus, các điểm trung hòa virus và những đột biến quan trọng: 13 (R  Q), 151 (R  G). Đây là những mô hình có vai trò quan trọng làm thay đổi yếu tố ảnh hƣởng đến độc lực virus. Hai đột biến trên OFR5 đƣợc xem là chỉ thị cho độc lực của chủng vaccine, đó là đột biến R13 thành Q13 và Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn