Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Thổ nhân sâm (Talinum crassifolium Willd)

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:64

Thêm vào BST

Báo xấu

27
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Thổ nhân sâm (Talinum crassifolium Willd) được thực hiện với mục tiêu nhằm xác định được môi trường thích hợp cho nhân giống cây Thổ nhân sâm trong ống nghiệm. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Thổ nhân sâm (Talinum crassifolium Willd)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ TRANG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY THỔ NHÂN SÂM (Talinum crassifolium Willd) LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2016 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ TRANG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY THỔ NHÂN SÂM (Talinum crassifolium Willd) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN THỊ TÂM THÁI NGUYÊN - 2016 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiê ̣n dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Trang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Tâm, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo và các anh chi ̣ kỹ thuật viên tại phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học trường đại học Sư Phạm Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn thạc sĩ. Trong thời gian thực hiện luận văn thạc sĩ tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm Nghiệp - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ của Ban lãnh đạo Viện, các kỹ thuật viên tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học đã tận tình giúp đỡ hướng dẫn tôi làm các thí nghiệm của luận văn thạc sĩ. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Khoa ho ̣c sự số ng và các thầ y cô giáo, cán bộ trong Khoa, đặc biệt là sự quan tâm, giúp đỡ của các anh chị kỹ thuâ ̣t viên phòng thí nghiệm khoa Khoa ho ̣c sự số ng. Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè luôn bên cạnh ủng hộ, khuyến khích, động viên tạo động lực để tôi hoàn thành luận văn này. Trong quá trình làm luận văn không tránh khỏi những sai sót, tôi mong nhận được sự đóng góp quý báu từ phía thầy cô và bạn bè để tôi có thể làm tốt hơn. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Trang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
iii MỤC LỤC Lời cam đoan ...................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................ ii Mục lục ............................................................................................................. iii Danh mục các từ và chữ viết tắt ........................................................................ v Danh mục bảng................................................................................................. vi Danh mục hình ................................................................................................ vii MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ...................................................... 3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4 1.1. Giới thiệu về cây Thổ nhân sâm ................................................................ 4 1.1.1. Đặc điểm phân loại và hình thái cây Thổ nhân sâm ............................ 4 1.1.2. Đặc điểm phân bố cây Thổ nhân sâm .................................................. 5 1.1.3. Đặc điểm sinh thái, trồng trọt cây Thổ nhân sâm ................................ 5 1.1.4. Thành phần hóa học và giá trị dược liệu của cây Thổ nhân sâm ........ 6 1.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................................... 8 1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................ 9 1.2.2. Vai trò của một số chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ....................................................................................... 11 1.3. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro ....................... 15 1.3.1. Giai đoạn I - Cấy gây ......................................................................... 15 1.3.2. Giai đoạn II - Nhân nhanh ................................................................. 15 1.3.3. Giai đoạn III - Chuẩn bị và đưa ra ngoài đất ..................................... 16 1.4. Một số thành tựu nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật..................................................................................... 16 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
iv Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 21 2.1. Vật liệu, hoá chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu ..................................... 21 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................ 21 2.1.2. Hoá chất, thiết bị ................................................................................ 21 2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu...................................................... 21 2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 21 2.2.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy ........................................................... 21 2.2.2. Phương pháp nuôi cấy in vitro........................................................... 22 2.2.3. Đưa cây ra môi trường tự nhiên......................................................... 24 2.3. Điều kiện thí nghiệm ................................................................................ 26 2.4. Phương pháp xử lý số liệu........................................................................ 26 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 27 3.1. Kết quả nghiên cứu khử trùng hạt ............................................................ 27 3.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng ............................................................ 27 3.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch javel 60% đến hiệu quả khử trùng .............................................. 28 3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh và sự sinh trưởng của chồi Thổ nhân sâm trong ống nghiệm ..................................................................................... 31 3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năng nhân chồi Thổ nhân sâm ..................................................................... 31 3.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp kinetin đến khả năng nhân chồi Thổ nhân sâm ........................................... 34 3.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA tới khả năng nhân chồi Thổ nhân sâm ................................................................. 36 3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ chồi cây Thổ nhân sâm............................................................................................ 38 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro ngoài vườn ươm ............................. 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
v PHỤ LỤC ....................................................................................................... 47 DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT DNA : Deoxyribonucleic acid BAP : 6 - benzyl amino purine CT : Công thức CS : Cộng sự ĐC : Đối chứng IAA : 3 - indol acetic acid IBA : 3 - indol butyric acid Kinetin : 6 - furfuryl- aminopurine MS : Murashighe và Skoog, 1962 NAA : α - naphthalene acetic acid 2,4 - D : 2,4 - dichlorophenoxy acetic acid Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt Thổ nhân sâm bằng HgCl2 0,1% .............. 28 Bảng 3.2. Kết quả khử trùng hạt Thổ nhân sâm bằng javen 60% ................ 29 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năng nhân chồi Thổ nhân sâm ....................................................................................... 32 Bảng 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp kinetin đến khả năng nhân chồi Thổ nhân sâm .................... 34 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp với IBA đến khả năng nhân nhanh chồi Thổ nhân sâm .......................................... 36 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của của IBA đến khả năng ra rễ chồi Thổ nhân sâm ........ 38 Bảng 3.7. Kết quả ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro ngoài vườn ươm ..................... 40 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cây Thổ nhân sâm ngoài tự nhiên ................................................. 4 Hình 3.1: Kết quả khử trùng hạt bằng HgCl2 0,1% và dung dịch javel 60% .........30 Hình 3.2: Ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Thổ nhân sâm ....................................................................... 33 Hình 3.3: Ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Thổ nhân sâm ........................................... 36 Hình 3.4: Ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp với IBA đến khả năng nhân chồi cây Thổ nhân sâm ............................................... 37 Hình 3.5: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi Thổ nhân sâm ... 39 Hình 3.6: Cây con trồng trong các giá thể khác nhau sau 30 ngày ............... 41 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Theo lịch sử y học cổ truyền của Trung Quốc từ 3000 năm trước Công nguyên, nhân sâm đã được nói đến như là một thần dược trong “Thần nông bản thảo” của vua Thần Nông. Sâm là tên gọi khái quát chỉ một số loại cây thân thảo mà củ và rễ được sử dụng làm thuốc từ rất lâu đời tại nhiều nước châu Á, thuộc nhiều chi họ khác nhau nhưng chủ yếu là các loại thuộc chi Sâm [2]. Cây nhân sâm có tên khoa học là Panax Gingseng C.A Mey. Củ sâm có rất nhiều hình dạng, tư thế giống con người, do đó được gọi là nhân sâm. Nhân sâm thuộc họ Araliaceae là một loại dược phẩm quý hiếm có ở nhiều nơi như: Nhật Bản, Trung Quốc, Hoa Kỳ và đặc biệt ở Hàn Quốc. Dân Hàn Quốc coi nhân sâm là tặng phẩm của trời đất. Đông y coi nhân sâm là vị thuốc đứng đầu các vị thuốc theo thứ tự: Sâm, Nhung, Quế, Phụ. Có rất nhiều loại sâm, để phân biệt thường người ta gọi thêm tên địa phương hoặc màu sắc vào tên gọi [2]. Ở Việt Nam có các giống sâm như: Sâm Ngọc Linh, Sâm Bố Chính, Đảng Sâm, Tây Dương Sâm [2]. Thổ nhân sâm (Talinum crassifolium Willd) còn được gọi là Thổ cao ly sâm hay Đông dương sâm, sâm thảo, thuộc họ rau sam - Portulacaceae [2]. Thổ nhân sâm gồm nhiều thành phần hóa học khác nhau, trong đó có saponin tetracyclic nhóm Damavan gọi chung là gingsenosid. Ngoài ra, còn có saponin với aglicon là acid oleanolic, các vitamin B1, vitamin B2, phytosterol, tinh dầu, đường, tinh bột. Thổ nhân sâm có tác dụng bổ dưỡng toàn thân, suy nhược thần kinh, cơ thể hao tổn, tăng sức lực cho người già, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
2 người mới ốm dậy, kém ăn mất ngủ, hay quên. Theo một số nghiên cứu, do nhân sâm chứa nhiều chất chống oxy hóa nên có thể phòng ngừa một số bệnh như: Ung thư, bệnh tim mạch, thần kinh, chống căng thẳng, tăng sức đề kháng chống lại nhiễm trùng. Tác dụng của nhân sâm rất tốt nhưng phải biết dùng phù hợp với từng đối tượng và theo liều lượng khuyến cáo. Đông y coi Thổ nhân sâm là nhân sâm của người nghèo vì nó chứa nhiều công dụng giống nhân sâm mà giá thành rẻ và sẵn có trong tự nhiên [2]. Hiện nay, với những kinh nghiệm sử dụng dược liệu của người dân và việc khai phá rừng một cách ồ ạt đã làm cho nguồn tài nguyên thực vật suy giảm nghiêm trọng trong đó có những cây thuốc quý hiếm. Chính vì vai trò quan trọng của cây Thổ nhân sâm nên việc nhân giống chúng là rất cần thiết. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Thổ nhân sâm” (Talinum crassifolium Willd). 2. Mục tiêu nghiên cứu Xác định được môi trường thích hợp cho nhân giống cây Thổ nhân sâm trong ống nghiệm. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Nghiên cứu khử trùng hạt tạo mẫu sạch ban đầu trong ống nghiệm. 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh và sự sinh trưởng của chồi Thổ nhân sâm trong ống nghiệm. 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ chồi Thổ nhân sâm trong ống nghiệm. 3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro ngoài vườn ươm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
3 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu xác định được môi trường thích hợp cho nhân giống cây Thổ nhân sâm bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, đánh giá được tác động của các chất kích thích sinh trưởng, thành phần môi trường nuôi cấy và thời gian khử trùng mẫu cấy, bổ sung thêm dữ liệu cho việc nghiên cứu các loại cây dược liệu khác. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu đảm bảo cung cấp được số lượng lớn cây giống có chất lượng cao, đồng đều cho sản xuất không phụ thuộc vào mùa vụ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây Thổ nhân sâm 1.1.1. Đặc điểm phân loại và hình thái cây Thổ nhân sâm Thổ nhân sâm có tên khoa học là: Talinum crassifolium Willd (Talinum patens L., Talinum panicuiatum Gaertn). Ngoài ra, cây Thổ nhân sâm còn một số tên gọi khác: Sâm cao ly, Thổ sâm cao ly, Giả nhân sâm, Sâm thảo, Sâm đất [31]. Thổ nhân sâm thuộc giới thực vật (Plantae), ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta), lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), bộ Cẩm Chướng (Caryophyllales), họ Rau Sam (Portulacaceae), chi Sâm mùng tơi (Talinum) [34]. Thổ nhân sâm là cây thân thảo, sống hằng năm, cao 30-50 cm, thân hình trụ nhẵn, phân cành ngay từ gốc [8]. Lá mọc so le, dày gần như không có cuống hoặc cuống rất ngắn, hình bầu dục hoặc hình trứng, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn, gân lá mờ, hai mặt nhẵn gần như cùng màu, phiến lá dày, lá dài 5 - 7cm, rộng 2,5 - 3,5cm [8]. Cụm hoa là một chùy kép mọc ở đầu cành, gồm nhiều hoa nhỏ đường kính ước 6mm, tràng 5 cánh hoa màu tím đỏ nhạt, đài có hai răng nhỏ, tràng năm cánh nhọn, nhị nhiều, bầu thượng hình cầu [8]. Quả nhỏ, hình cầu, khi chín màu đỏ nâu; hạt dẹt, rất nhỏ, màu đen nhánh, trên mặt hơi nổi vân. Củ gần giống củ nhân sâm [8]. Mùa ra hoa tháng 6-7, có quả tháng 9-10 [8]. Hình 1.1: Cây Thổ nhân sâm ngoài tự nhiên [31] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
5 1.1.2. Đặc điểm phân bố cây Thổ nhân sâm Thổ nhân sâm có nguồn gốc từ Trung Mỹ, du nhập vào Việt Nam khoảng năm 1909, sau đó mọc hoang khắp nơi, ra hoa quanh năm [8]. Thổ nhân sâm cũng mọc hoang và được trồng làm cảnh ở một số tỉnh của Trung Quốc như: Triết Giang, Giang Tô, An Huy, Quảng Tây, Quảng Đông, Tứ Xuyên, người ta gọi cây này với tên Thổ nhân sâm, Thổ cao ly sâm, v.v… và cũng dùng làm thuốc bổ thay sâm [6], [8]. Ở Việt Nam, Thổ nhân sâm là cây trồng tự nhiên để làm thuốc, lấy rau ăn và trồng làm cảnh. Cây gặp nhiều ở các tỉnh: Thái Nguyên, Bắc Kạn, Hà Giang, Tuyên Quang, Hòa Bình, Lạng Sơn, Cao Bằng, Hải Phòng, Nghệ An…[6]. 1.1.3. Đặc điểm sinh thái, trồng trọt cây Thổ nhân sâm Thổ nhân sâm ưa đất ẩm nhưng nhiều ánh nắng, rất dễ trồng, có thể thu hoạch lá quanh năm. Khi thu hoạch thì cắt nhánh để đâm chồi, cho ra lứa rau sâm khác. Ngoài ra, rau sâm còn được trồng trong các chậu kiểng vì cây cho ra hoa bé xinh, phớt hồng rất đẹp [8]. Thổ nhân sâm có thể trồng từ rễ củ hoặc từ hạt. Có thể trồng trong vườn, trong chậu cảnh hay thùng xốp. Cây mọc khỏe, sau 2 - 3 tháng có thể hái ngọn và lá làm rau ăn, sau một năm có thể thu hoạch củ, nếu để lâu năm củ sẽ to hơn. Lá và cành non dùng để nấu với thịt, tôm… Nấu canh rau vị thơm mát dễ chịu gần giống rau mùng tơi [13].  Nguồn giống từ hạt Hạt giống sau khi thu hái được xử lý bằng nước ấm (2 sôi + 3 lạnh) ngâm trong nước khoảng 6 - 8 giờ, vớt ra để ráo, dùng que nhọn chọc lỗ sâu 1cm rồi cho hạt vào (2 - 3 hạt/lỗ), lấp kín đất, dùng lưới che nắng cho luống gieo [13].  Nguồn giống từ hom Chọn hom: hom được lấy từ thân hoặc củ cây mẹ, lấy từ đoạn gốc đến hết phần bánh tẻ của thân, hạn chế lấy phần ngọn quá non, dễ bị thối gốc khi giâm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
6 Dùng dao hay kéo sắc để cắt hom. Hom được cắt từ thân có chiều dài khoảng 10 - 20cm và ít nhất trên mỗi hom có 3 - 4 mắt lá, tỉa bớt lá trên hom còn chừa khoảng 1/3 lá, đem giâm vào luống. Thường xuyên tưới ẩm. Sau khi giâm 15 - 20 ngày hom giâm bắt đầu ra rễ thì đem trồng [13]. Cách trồng bằng hạt: Cây không kén đất, đất nào cũng mọc được trừ những nơi ngập úng. Đất cày bừa lên thành luống cao 20 - 25cm, bón lót 10 - 15 tấn/ha phân chuồng, rạch thành hàng cách nhau 20cm. Hạt gieo theo hàng, sau tỉa bớt, giữa các cây cách nhau khoảng cách 10 - 15cm. Đất trồng pha trộn theo tỷ lệ: 80% đất thịt + 10% tro trấu hoặc rơm mục + 10% phân chuồng ủ hoai. Thường xuyên tưới nước giữ ẩm cho đất, đặc biệt vào mùa nắng hạn. Thường xuyên làm cỏ, xới xáo, vun gốc, bón thúc bằng nước phân chuồng, nước giải hoặc đạm pha loãng. Kết hợp nhổ cỏ dại và phòng trừ sâu xám ăn lá và chồi non. Thổ nhân sâm ra hoa quả hàng năm, mùa ra hoa tháng 6 - 7, mùa ra quả tháng 9 - 10. Khi quả chín cần thu hoạch kịp thời nếu không quả sẽ bị tách làm hạt bị rụng. Đem phơi cả quả, khi khô đập lấy hạt rồi phơi hạt trong nắng yếu cho khô. Hạt tốt là những hạt có màu đen nhánh, bóng. Bảo quản trong lọ sành, để nơi khô ráo [13]. Thổ nhân sâm thường dùng củ. Loại cây một năm đã có thể thu hoạch rễ củ, nhưng tốt nhất là sau ba năm. Nếu dùng ngay cắt rễ con bỏ đầu để cả vỏ thái miếng sấy nhẹ lửa (60 - 700C) cho khô. Nếu để lâu, đồ chín, bỏ rễ con, để cả củ (hoặc thái miếng), sấy nhẹ lửa cho khô. Lúc mới đào rễ có màu hồng đẹp. Đem phơi hay sấy khô và để lâu sẽ có màu đen xám. Khi dùng thái mỏng, tẩm nước gừng hoặc nước đường, đồ chín. Lá thu hoạch quanh năm [13]. 1.1.4. Thành phần hóa học và giá trị dược liệu của cây Thổ nhân sâm Nghiên cứu về thành phần hóa học trong cây Thổ nhân sâm, người ta đã phát hiện có các chất phitosterol, saponin, flavonoid, tannin, steroid và các chất vô cơ kali, natri, canxi, magie, sắt. Rễ chứa I-hexacosanol, I- octacosanol, I-triacontanol, campestrol, stigmasterol, jo-sitostero, rễ còn có dẫn xuất phenolic [6]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
7 Theo y học hiện đại, người ta đã nghiên cứu chất octacosanol trong cây Thổ nhân sâm có tác dụng chống siêu vi gây bệnh Herp, các viêm nhiễm ngoài da, hỗ trợ chữa bệnh Parkinson, bệnh tim và làm hạ Cholesterol máu [31]. Theo y học cổ truyền, Thổ nhân sâm có vị ngọt, tính bình, có tác dụng bổ trung ích khí, nhuận phế sinh tân [10]. Thổ nhân sâm thường dùng chữa suy nhược ốm yếu, thể hư ra nhiều mồ hôi, tỳ hư tiêu chảy, đái dầm, kinh nguyệt không đều, thiếu sữa…[6]. Theo kinh nghiệm, nhân dân ta thường dùng lá Thổ nhân sâm nấu ăn cho mát, để giải nhiệt, dễ tiêu hóa, nhuận tràng. Lá Thổ nhân sâm giã nát dùng ngoài để chữa các vết loét, ung nhọt. Củ dùng làm thuốc bổ, chữa suy nhược cơ thể, chữa ho, người ra nhiều mồ hôi, đái dầm, kinh nguyệt không đều, thiếu sữa, ngày dùng 20 - 30g sắc uống trong ngày. Có thể dùng rễ Thổ nhân sâm thái nhỏ, hãm với nước sôi làm trà uống hàng ngày [31]. Trên thế giới nhiều nước dùng Thổ nhân sâm làm thuốc bổ. Tại Indonesia còn dùng chữa các bệnh về gan thận và làm thuốc tăng kích dục. Tại Dominique nước cốt sắc từ lá Thổ nhân sâm dùng chữa đau cổ [31]. * Một số bài thuốc theo kinh nghiệm dân gian Bài 1: Chữa tiểu tiện nhiều, hỗ trợ đái tháo đường Thổ nhân sâm 60g, kim anh tử 60g, các vị trên cho vào ấm đổ 550 ml nước, sắc nhỏ lửa còn 250 ml nước chia 2 lần uống trong ngày, 5 ngày một liệu trình [6]. Bài 2: Bổ khí huyết - chữa khí huyết yếu, người xanh gầy, thở yếu, hồi hộp, ít ngủ, kém ăn, mệt mỏi Thổ nhân sâm 40g, sắc nước uống trong ngày, cho vào ấm đổ 400ml nước, sắc nhỏ lửa còn 150 ml nước chia 2 lần uống trong ngày, 10 ngày một liệu trình [6]. Bài 3: Chữa đại tiện lỏng do tỳ hư Thổ nhân sâm 30g, đại táo 15g, cho vào ấm đổ 550 ml nước, sắc uống thay trà trong ngày [6]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
8 Bài 4: Hỗ trợ điều trị ho lâu ngày Thổ nhân sâm, hà thủ ô trắng, thông thảo, mỗi vị 20g, gà một con nhỏ tương đương với 400g. Cách chế biến: Cho các nguyên liệu trên rửa sạch cho vào nồi hầm gà thêm khoảng 80 phút đến khi nước canh có màu trắng sữa, khi gà chín nhừ, hớt bỏ bớt mỡ, múc gà ra một bát to, đổ hết nước hầm lên, bổ sung thêm muối và hạt tiêu [6]. Bài 5: Chữa mồ hôi trộm Thổ nhân sâm 60g, dạ dày lợn nửa cái. Cách chế biến: Dạ dày làm sạch để ráo, cho vào nồi hầm Thổ nhân sâm, khi dạ dày chín nhừ bổ sung thêm muối và hạt tiêu [6]. Bài 6: Người mới ốm dậy, sau phẫu thuật Sườn lợn 300g, hoàng kỳ 200g, Thổ nhân sâm 200g. Xương sườn lợn luộc qua rồi vớt bỏ bọt, hoàng kỳ sắc kỹ lấy nước, đun nhỏ lửa và om kỹ, khi đạt độ nhừ cho Thổ nhân sâm vào đun tiếp 5 - 10 phút, nêm gia vị vừa đủ ăn với cơm, mỗi tuần có thể ăn 2 - 3 bữa [6]. Bài 7: Chữa táo bón Lá Thổ nhân sâm, rau đay, mùng tơi, liều vừa đủ nấu canh cua ăn thường xuyên [6]. 1.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật được hình thành và phát triển từ những năm 80 của thế kỉ XX và được ứng dụng chủ yếu trong các lĩnh vực: Nhân giống vô tính in vitro, nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng để tạo cây sạch bệnh, bảo quản nguồn gen in vitro, tạo phôi vô tính và hạt nhân tạo…[7]. Kỹ thuật nuôi cấy mô đã được trên 600 công ty lớn trên thế giới áp dụng và đã nhân được khoảng 500 triệu cây giống trong 1 năm ở các công ty giống cây trồng khác nhau. Dự kiến trên thị trường cây giống, kỹ thuật nuôi cấy mô thu được khoảng 15 tỉ USD/năm và tốc độ tăng trưởng của thị trường này hàng năm vào khoảng 15% [7]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
9 Trong những năm gần đây, quy trình nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro được nhiều cơ sở khoa học nghiên cứu và hoàn thiện trên các đối tượng khác nhau như: Cây rừng, cây lương thực, thực phẩm, cây ăn quả, hoa, cây cảnh, cây dược liệu…[7]. Rừng Việt Nam chiếm diện tích lớn nhưng hiện nay đã bị chặt phá do nhiều nguyên nhân khác nhau. Góp phần vào cung cấp nguồn giống cây rừng phục vụ cho công tác phủ xanh đất trống đồi núi trọc của nhà nước, hàng loạt quy trình nhân giống in vitro các loại cây rừng được nghiên cứu nhằm tạo ra lượng lớn cây giống có chất lượng tốt [7]. Thuật ngữ nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy từ nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường nhân tạo trong điều kiện vô trùng. Cho đến nay, nuôi cấy mô tế bào thực vật được xem là giải pháp công nghệ quan trọng trong công nghệ sinh học nói chung. Trên môi trường nhân tạo, từ các mô hoặc các cơ quan thực vật ban đầu có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh và chỉ trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một lượng lớn cây trồng có cấu trúc di truyền và các đặc điểm sinh học giống hệt nhau [7]. 1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.1.1. Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902. Haberlandt lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đó phân hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào [16]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
10 1.2.1.2. Sự phân hóa và phản phân hóa Cơ thể thực vật hình thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó, từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau [3]. Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau. Quá trình phân hóa tế bào có thể biểu thị: Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá có chức năng riêng biệt Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ, quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào. phân hóa tế bào tế bào phôi sinh tế bào dãn tế bào chuyên hóa phản phân hóa tế bào Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
11 khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào [3]. 1.2.2. Vai trò của một số chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Chất điều hòa sinh trưởng là chất có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh các quá trình sinh trưởng, phát triển và các hoạt động sinh lí của cơ thể. Các chất điều hòa sinh trưởng của thực vật bao gồm các phytohoocmon và chất điều hòa sinh trưởng tổng hợp nhân tạo. Chất điều hòa sinh trưởng của thực vật được chia làm 2 nhóm có tác dụng đối kháng về sinh lý, đó là các chất kích thích sinh trưởng và các chất ức chế sinh trưởng. Các chất được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật chủ yếu thuộc nhóm các chất kích thích sinh trưởng gồm: Auxin, giberelin, cytokinin [23]. 1.2.2.1. Auxin Năm 1880, người ta đã phát hiện ra bao lá mầm của cây lúa rất nhạy cảm với ánh sáng. Nếu chiếu sáng một phía thì gây ra quang hướng động, nhưng nếu che tối hoặc bỏ đỉnh sinh trưởng thì hiện tượng trên không xảy ra. Đỉnh ngọn bao lá mầm là nơi tiếp nhận kích thích ánh sáng, đã sinh ra một chất nào đấy liên quan đến hiện tượng trên. Năm 1935, các nhà khoa học cũng tách được chất có hoạt tính tương tự chất kích thích sinh trưởng từ nấm Rhyzopus và xác định được bản chất hóa học là IAA, gọi là auxin [33]. Auxin là nhóm chất kích thích sinh trưởng chủ yếu và quan trọng của tất cả các loài thực vật từ bậc thấp tới bậc cao. Thuộc nhóm auxin gồm có: IAA, NAA, IBA và 2,4 - D [23]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn