Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Tính hiệu quả của kỹ thuật kích hoạt noãn trong thụ tinh ống nghiệm

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:70

Thêm vào BST

Báo xấu

15
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm đánh giá hiệu quả của phương pháp hỗ trợ hoạt hóa noãn bằng ionomycin tới tỉ lệ thụ tinh, chất lượng phôi ngày 3, tỉ lệ lên phôi ngày 5, chất lượng phôi ngày 5 và tỉ lệ có thai của các trường hợp làm thụ tinh trong ống nghiệm. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Tính hiệu quả của kỹ thuật kích hoạt noãn trong thụ tinh ống nghiệm

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ----------------------------------------------------- NGUYỄN THỊ TRÀ MY TÍNH HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT KÍCH HOẠT NOÃN TRONG THỤ TINH ỐNG NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành Công nghệ sinh học Thái Nguyên – 2020
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ---------------------------------------------------- NGUYỄN THỊ TRÀ MY TÍNH HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT KÍCH HOẠT NOÃN TRONG THỤ TINH ỐNG NGHIỆM Ngành : Công nghệ sinh học Mã số ngành: 84.20.20.1 LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành Công nghệ sinh học Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. DƯƠNG VĂN CƯỜNG Thái Nguyên -2020
i LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu đề tài “ Tính hiệu quả của kỹ thuật kích hoạt noãn trong thụ tinh ống nghiệm” là trung thực, hoàn toàn thực hiện tại Khoa Hỗ trợ sinh sản – Bệnh viện A Thái Nguyên. Ngoài ra, trong bài báo cáo có sử dụng một số nguồn tài liệu tham khảo đã được trích dẫn rõ ràng và được phép công bố. Em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về tính trung thực của các nội dung khác trong đề tài của mình. Học viên
ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp, em đã nhận được sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân. Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến giáo viên hướng dẫn PGS.TS Dương Văn Cường đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này. Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến Bệnh viện A Thái Nguyên, Khoa Hỗ trợ sinh sản cùng các cán bộ, quý đồng nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020 Học Viên
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii MỤC LỤC ............................................................................................................ iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT............................................................................ vi DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................................. vii DANH MỤC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ........................................................ viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN ................................................................................... ix MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 3 2.1. Mục tiêu chung ........................................................................................ 3 2.2. Mục tiêu cụ thể......................................................................................... 3 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ....................................................................... 3 3.1. Ý nghĩa khoa học ..................................................................................... 3 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ...................................................................................... 3 CHƯƠNG 1........................................................................................................... 4 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................... 4 1.1. Cở sở khoa học của vấn đề nghiên cứu .................................................... 4 1.1.1. Thụ tinh tự nhiên ................................................................................ 4 1.1.2. Tiếp xúc màng trong suốt ................................................................... 4 1.1.3. Phản ứng cực đầu............................................................................... 5 1.1.4. Xuyên màng trong suốt....................................................................... 7 1.1.5. Sự hòa nhập tinh trùng và noãn ......................................................... 7 1.1.6. Hoạt hóa noãn .................................................................................... 8
iv 1.2.7. Phản ứng vỏ và các cơ chế ngăn chặn đa thụ tinh ............................. 10 1.2.8. Sự hình thành và hòa nhập của hai tiền nhân .................................... 11 1.2. Thụ tinh trong ống nghiệm ..................................................................... 12 1.2.1. Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI).......................... 12 1.2.2. Hoạt hóa noãn nhân tạo ................................................................... 16 1.3. Tổng quan kết quả nghiên cứu tại Việt Nam và thế giới........................ 17 CHƯƠNG 2......................................................................................................... 19 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu ................................................................ 19 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 19 2.3. Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu ........................................... 19 2.3.1. Trang thiết bị....................................................................................... 19 2.3.2. Dụng cụ ............................................................................................... 19 2.3.3. Hóa chất nghiên cứu ........................................................................... 20 2.4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 20 2.5. Phương pháp ............................................................................................. 20 2.5.1. Phương pháp kích hoạt noãn .............................................................. 20 2.5.2. Các phương pháp đánh giá................................................................. 20 2.5.3. Phương pháp thu thập số liệu ............................................................. 25 2.5.4. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................. 25 2.6. Quy trình ................................................................................................... 26 2.6.1. Chuẩn bị .............................................................................................. 26 2.6.2. Thực hiện............................................................................................. 26 CHƯƠNG 3......................................................................................................... 28 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................................. 28 3.1. Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa noãn đến tỉ lệ thụ tinh sau ICSI .................................................................................................................. 28
v 3.2. Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa noãn đến chất lượng phôi hữu dụng ngày 3 .............................................................................................. 30 3.3. Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa noãn đến tỉ lệ lên phôi ngày 5 và chất lượng phôi ngày 5.................................................................... 34 3.4. Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa noãn đến tỉ lệ có thai ... 39 KẾT LUẬN ......................................................................................................... 41 KIẾN NGHỊ ........................................................................................................ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 43
vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng anh Tiếng việt LH Luteinizing hormone Hormone tạo hoàng thể AOA Assisted oocyte activation Hỗ trợ kích hoạt noãn Ca2+ Calcium ion Ion canxi cAMP Cyclic adenosine monophosphate Adenosine monophosphate mạch vòng DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic EBP Egg-binding protein Protein liên kết noãn GVBD Germinal vesicle breakdown Giai đoạn vỡ túi tinh hCG Human Chorionic Gonadotropin Hormone thai kì ICM Inner cell mass Khối tế bào nội mô ICSI Intra cytoplasmic Sperm Tiêm tinh trùng vào trong noãn IP3 Inositol triphosphate Inositol triphosphat IVF Invitro fertilizaton Thụ tinh trong ống nghiệm MAPK Mitogen activate protein kinase Mitogen kích hoạt kinase protein mRNA Messenger Ribonucleic acid RNA thông tin NF Normal forms Dạng bình thường OAT Oligoasthenoteratozoospermia Tinh trùng ít - yếu - dị dạng Percutaneous epididymal sperm PESA Chọc hút mào tinh hoàn qua da aspiration phosphatidylinositol (4,5)- PPIP2 phosphatidylinositol (4,5) -bisphosphat bisphosphate PLCζ Phospholipase C zeta Phospholipase C zeta RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic TE Trophectoderm Tế bào lá nuôi WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới ZP Zona pellucida Màng trong suốt
vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Đánh giá tinh dịch theo tiêu chuẩn WHO 2010 ................................. 21 Bảng 2.2: Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng phôi ngày 3 dựa theo chuẩn đồng thuận của ALPHA 2011 ...................................................................................... 23 Bảng 2.3: Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng phôi ngày 5 dựa theo chuẩn đồng thuận ALPHA 2011 ............................................................................................. 24 Bảng 2.4: Xếp loại chất lượng phôi ngày 5 dựa theo chuẩn đồng thuận ALPHA 2011 ..................................................................................................................... 25 Bảng 3.1: Các trường hợp bất thường tinh trùng trong nghiên cứu.................... 28 Bảng 3.2: So sánh tỉ lệ thụ tinh giữa 2 nhóm noãn điều trị và nhóm đối chứng 29 Bảng 3.3: So sánh chất lượng phôi ngày 3 giữa nhóm bệnh nhân sử dụng phương pháp AOA và đối chứng ........................................................................ 30 Bảng 3.4: So sánh tỉ lệ lên phôi ngày 5 giữa 2 nhóm nghiên cứu và đối chứng 35 Bảng 3.5: So sánh chất lượng phôi ngày 3 giữa nhóm bệnh nhân sử dụng phương pháp AOA và đối chứng ........................................................................ 38 Bảng 3.6: So sánh giữa 2 nhóm AOA và đối chứng ........................................... 39
viii DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Phản ứng cực đầu ................................................................................. 6 Hình 1.2: Quá trình hoạt hóa noãn của tinh trùng ................................................ 9 Hình 1.3: Các đợt tăng Ca2+ sau khi tinh trùng xâm nhập ................................. 10 Hình 1.4: Noãn thụ tinh ....................................................................................... 12 Hình 1.5: Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn ................................................... 14 Hình 3.1: Sự phát triển của phôi giai đoạn phân chia ......................................... 32 Hình 3.2. Hình ảnh phôi nang ............................. Error! Bookmark not defined. Đồ thị 3.1: Chất lượng phôi nuôi ngày 5 giữa 2 nhóm nghiên cứu và đối chứng...................................................................................................................34
ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Nghiên cứu nhằm đánh giá hiệu quả sử dụng phương pháp hoạt hóa noãn bằng calcium ionomycin trong các trường hợp thụ tinh trong ống nghiệm sử dụng phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI) do tinh trùng ít, yếu và dị dạng nặng, tinh trùng từ phẫu thuật thủ thuật. Phương pháp: Nghiên cứu so sánh hai giá trị trung bình. Noãn được chia thành 2 nhóm: Nhóm 1 gồm 30 bệnh nhân được thực hiện hỗ trợ hoạt hóa noãn (AOA) bằng calcium ionomycin 10 μM sau khi ICSI và nhóm 2 là nhóm đối chứng (nghiên cứu hồi cứu) không thực hiện AOA sau ICSI. Tỉ lệ thụ tinh, tỉ lệ tạo phôi có chất lượng khá/tốt, tỉ lệ lên phôi ngày 5 và tỉ lệ có thai được so sánh giữa hai nhóm. Kết quả: Nhóm 1 (ICSI + AOA) có 284 noãn từ 30 chu kỳ điều trị ICSI do bất thường tinh trùng nặng từ tháng 8 /2019 đến tháng 8/2020, nhóm 2 (ICSI) có 1445 noãn từ 176 chu kỳ đã điều trị tại Bệnh viện A Thái Nguyên. Có sự gia tăng đáng kể về tỉ lệ thụ tinh ở nhóm 1 so với nhóm 2 (93% so với 89%, P
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Năm 1978, sự kiện em bé thụ tinh trong ống nghiệm đầu tiên ra đời đánh dấu bước ngoặt trong ngành y học thế giới [44]. Đến nay, ước tính đã có hơn 8 triệu trẻ em ra đời từ IVF, hàng năm trên toàn thế giới có hơn 2 triệu trường hợp IVF và các kỹ thuật tương đương được thực hiện. Ở các nước phát triển, có từ 1-5% trẻ em ra đời từ IVF. Người ta ước tính mỗi năm số trường hợp thực hiện IVF trên thế giới tăng khoảng 10%. Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF - Invitro Fertilizaton) ra đời kết hợp với Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI – Intra cytoplasmic Sperm Injection) đã giúp tỉ lệ thành công của IVF tăng đáng kể. Đây là một kỹ thuật rất hiệu quả được sử dụng ở các cặp vợ chồng được chẩn đoán có bất thường tinh trùng nghiêm trọng. Mặc dù tỷ lệ thành công cao, thất bại thụ tinh sau ICSI vẫn xảy ra ở 1- 3% các cặp vợ chồng. Tỉ lệ thụ tinh thường dao động trong khoảng 70-80%, trong đó có các chu kì thất bại thụ tinh hoàn toàn. Kết quả này có thể do noãn không được hoạt hóa hay bất thường nhiễm sắc thể (NST) của noãn hoặc tinh trùng. Sau ICSI, noãn không thụ tinh có thể chứa đầu tinh trùng còn cô đặc, tinh trùng còn nguyên hay bị đẩy ra khỏi noãn, tình trạng này phải chiếm 12% trong tổng số noãn không thụ tinh. Ngoài ra khoảng 7% noãn trưởng thành chứa đầu tinh trùng có nhân chưa được giải nén, DNA của tinh trùng hiện diện ở trạng thái NST chưa trưởng thành, còn cô đặc. Chỉ có một vài xét nghiệm chẩn đoán hiện có sẵn để đánh giá lý do thất bại trong thụ tinh ICSI. Việc thất bại thụ tinh dẫn đến giảm số lượng hoặc không có phôi để chuyển là một thử thách cho những bệnh nhân thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm. Những tinh trùng bất thường nặng, cụ thể là trường hợp chỉ có vài tinh trùng trong mẫu (cryptozoospermia) hay tinh trùng đầu tròn (globozoospermia) không có thể cực đầu, dẫn đến trong quá trình di chuyển dễ thất thoát zeta (PLCζ) làm
2 giảm khả năng hoạt hóa noãn từ đó dẫn đến noãn không thể vượt qua giai đoạn nghỉ trong phân bào, kết quả là thất bại thụ tinh [39]. Để giải quyết vấn đề thất bại trong việc hoạt hóa noãn, người ta đã nghiên cứu nhiều phương pháp để khởi phát quá trình hoạt hóa noãn. Hoạt hóa noãn (AOA - Assisted oocyte activation) đang ngày càng được áp dụng trong sinh sản có sự trợ giúp của con người để khôi phục tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ mang thai ở các cặp vợ chồng có tiền sử thất bại trong thụ tinh ICSI [22], [52]. Từ cuối những năm 1990 [35], nhiều trung tâm đã thực hiện AOA trong nhóm bệnh nhân hiếm gặp này, cho tỉ lệ của thụ tinh và tỷ lệ mang thai khả quan hơn ở nhiều cặp vợ chồng. Hiện nay, nhiều phương pháp hoạt hóa noãn nhân tạo khác nhau được sử dụng như hoạt hóa bằng dòng điện, vật lý hay hóa học. Trong đó, phương pháp phổ biến nhất là hoạt hóa noãn sử dụng chất hóa học, bao gồm calcium ionophores, như ionomycin và calcimycin (A23197), hoặc là tổ hợp protein tổng hợp như 6- dimethylaminopurine (6-DMAP). Bên cạnh việc thiếu hụt PLCζ dẫn đến không thể hoạt hóa noãn, vẫn còn nhiều nguyên nhân khác dẫn đến giảm tỉ lệ thụ tinh. Vì vậy, việc hoạt hóa noãn nhân tạo được cho rằng không phải phù hợp với tất cả trường hợp thất bại thụ tinh, mà chỉ có hiệu quả với trường hợp tiền sử thất bại thụ tinh do tinh trùng bất thường nặng không thể hoạt hóa noãn [14], [48]. Sử dụng phương pháp hoạt hóa noãn hiện nay được cho là phương án tối ưu nhất đối với những trường hợp bất thường tinh trùng nặng nhằm cải thiện tỉ lệ thụ tinh sau ICSI. Tuy nhiên, vẫn chưa có nhiều bằng chứng khoa học về tính an toàn và hiệu quả về sử dụng phương pháp hoạt hóa noãn nhân tạo nên kỹ thuật này vẫn chưa thể được coi là một phương pháp điều trị thường quy.
3 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Mục tiêu chung Đánh giá hiệu quả của phương pháp hỗ trợ hoạt hóa noãn bằng hóa học trong thụ tinh ống nghiệm. 2.2. Mục tiêu cụ thể Đánh giá hiệu quả của phương pháp hỗ trợ hoạt hóa noãn bằng ionomycin tới tỉ lệ thụ tinh, chất lượng phôi ngày 3, tỉ lệ lên phôi ngày 5, chất lượng phôi ngày 5 và tỉ lệ có thai của các trường hợp làm thụ tinh trong ống nghiệm. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3.1. Ý nghĩa khoa học Cung cấp thêm cơ sở khoa học cho áp dụng kỹ thuật hoạt hóa noãn trên các trường hợp bệnh nhân vô sinh hiếm muộn bất thường tinh trùng. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở để tư vấn, áp dụng từ đó nâng cao được tỉ lệ thụ tinh, có thai cho bệnh nhân đến khám và điều trị. Xây dựng quy trình chuẩn để áp dụng thường quy đối với những bệnh nhân bất thường tinh trùng.
4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Cở sở khoa học của vấn đề nghiên cứu 1.1.1. Thụ tinh tự nhiên Sự thụ tinh là hiện tượng kết hợp giữa tinh trùng và noãn để tạo thành hợp tử có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội. Trong invivo, quá trình thụ tinh thường xảy ra ở 1/3 ngoài của vòi trứng. Sự thụ tinh diễn ra bên trong ống sinh dục nữ phụ thuộc vào hai cấu trúc: cực đầu của tinh trùng và màng trong suốt của noãn. Ba sự kiện chính liên quan đến sự tương tác của tinh trùng và noãn gồm: 1) tinh trùng gắn vào màng trong suốt; 2) tinh trùng xảy ra phản ứng cực đầu, phóng thích các enzyme phân hủy và lộ ra màng cực đầu bên trong; 3) màng tinh trùng tương tác với màng bào tương của noãn và hai màng hòa vào nhau [49]. Để phát triển đầy đủ các đặc điểm cần thiết cho quá trình thụ tinh, sau khi xuất tinh tinh trùng cần di chuyển đến hệ thống ống sinh dục nữ để trải qua các biến đổi về phân tử, sinh hóa và sinh lý [38]. Các thay đổi được khởi phát bởi các tín hiệu từ môi trường, sự tương tác của tinh trùng với noãn và các yếu tố ngoại bào. Sự biến đổi của tinh trùng bao gồm biến đổi trong độ di động, hoạt hóa, phản ứng cực đầu, sự xâm nhập vào màng trong suốt, gắn kết với noãn và sự hòa màng. Ở người, sự thụ tinh có thể chia làm 6 giai đoạn: - Tiếp xúc giữa tinh trùng và màng trong suốt - Phản ứng cực đầu - Xâm nhập qua màng trong suốt - Hòa màng bào tương của noãn - Hoạt hóa noãn - Sự hình thành và hòa nhập ở hai tiền nhân 1.1.2. Tiếp xúc màng trong suốt Sự gắn sơ cấp đầu là tương tác vật lý đầu tiên của các giao tử liên quan đến nhận diện đặc trưng loài của cấu trúc và phân tử. Theo nguyên tắc, một phân tử
5 trên tinh trùng sẽ nhận diện và gắn với phân tử bổ sung trên vỏ của noãn. Cấu trúc chính liên quan đến sự gắn kết giữa các giao tử tương tự ở tinh trùng của các loài khác nhưng có sự khác biệt ở noãn. Cơ chế nhận diện giao tử ở động vật có vú dựa trên tương tác protein – carbohydrate giữa tinh trùng và noãn. Màng trong suốt (ZP – Zona pellucida) được cấu tạo chủ yếu bởi các glycoprotein, đây là một cấu trúc đàn hồi được hình thành bởi mạng lưới sợi và tơ trong đó bao gồm 4 lớp glycoprotein là ZP1, ZP2, ZP3 và ZP4. ZP3 chính là nơi tinh trùng sẽ gắn kết và có nhiệm vụ khởi phát phản ứng cực đầu [25], [24], [58] . ZP1, ZP3, ZP4 có vai trò hoạt hóa tinh trùng và khởi phát phản ứng cực đầu. Sau khi xảy ra phản ứng cực đầu, ZP2 sẽ thay thế ZP3 tiếp tục giữ cho tinh trùng gắn kết vào, để từ đó tinh trùng dễ dàng chui qua màng trong suốt để vào khoang quanh noãn. Trong khi đó, ZP1 chủ yếu là cầu nối để kết nối ZP2 và ZP3 với nhau. Nhiều nghiên cứu cho thấy việc tiếp xúc và gắn kết với ZP3 của tinh trùng có tính đặc hiệu loài, nghĩa là chỉ có tinh trùng và màng trong suốt của noãn cùng loài mới gắn kết được với nhau [43]. Như vậy, chức năng đầu tiên rất quan trọng của màng trong suốt, đó là thực hiện vai trò như một rào cản hữu hiệu ngăn chặn hiện tượng đa thụ tinh. 1.1.3. Phản ứng cực đầu Thể cực đầu (acrosome) nằm ở phần đầu của tinh trùng, chiếm 1/2 đến 2/3 thể tích đầu tinh trùng. Thể cực đầu tương đối rộng, có nguồn gốc từ thể golgi và là một tiểu thể giống lysosome. Đây là nơi chưa những enzyme quan trọng giúp cho tinh trùng có hể tiêu hủy và xuyên qua màng trong suốt để vào noãn. Thể cực đầu có 2 lớp màng, màng ngoài nằm ngoài ngay dưới màng bào tương và màng trong áp sát vào màng nhân tinh trùng, nơi chứa thông tin di truyền.
6 Khi tinh trùng vừa gắn với ZP3, phản ứng cực đầu sẽ xảy ra. Đây là một phản ứng quan trọng cần thiết cho sự thụ tinh của tinh trùng vì chỉ những tinh trùng nào đã xảy ra phản ứng cực đầu mới có thể xâm nhập qua màng trong suốt và hòa nhập với màng bào tương noãn. Tuy nhiên, để phản ứng cực đầu có thể xảy ra, tinh trùng cần trải qua quá trình hoạt hóa trước đó. Đây là quá trình nhằm làm thay đổi cấu trúc và tính bền vững của tế bào tinh trùng và là tiền đề cho phản ứng cực đầu xảy ra. Trong in-vitro, hoạt hóa có thể xảy ra trong quá trình chuẩn bị tinh trùng. Khi phản ứng cực đầu được khởi phát, màng ngoài của cực đầu sẽ hòa với bào tương của tinh trùng, giúp giải phóng các enzyme bên trong cực đầu. Trong số đó quan trọng nhất là hyaluronidase và acrosin. Acrosin được dự trữ dưới dạng tiền enzyme là pro-acrosin được chuyển hóa sang dạng hoạt động khi được phóng thích nhờ phản ứng cực đầu. Cả hai enzyme này đều đóng vai trò quan trọng trong sự xâm nhập của tinh trùng vào lớp vỏ quanh noãn, nhưng cơ chế thực sự mà chúng đóng góp vào việc này chưa được xác định rõ, bởi lẽ mạng lưới của tế bào hạt chủ yếu chứa carbonhydrate hơn là acid hyaluronic, và các enzyme khác khác của cực đầu như aryl sulphatase có thể cũng có vai trò kết hợp giúp tinh trùng xâm nhập vào noãn. Vì vậy, cần có thêm nhiều nghiên cứu để xác định vai trò của các enzyme được phóng thích trong phản ứng cực đầu. Hình 1.1. Phản ứng cực đầu [16]
7 Phản ứng cực đầu xảy ra với sự tham gia của ba thành phần chính là calcium ion (Ca2+), sự hoạt hóa phospholipase và enzyme protein kinase [45]. ZP3 ban đầu sẽ kích hoạt tyrosine kinase (dẫn đến sự gia tăng phosphoryl hóa protein tyrosine) và sự tự phosphoryl hóa cụ thể G-protein dẫn truyền tính hiệu tương tác với các enzyme gắn kết màng như phospholipase C và adenylate cylase. Sự hoạt hóa hai enzyme dẫn đến sự gia tăng tín hiệu truyền tin thứ hai là cAMP, inositol triphosphate (IP3) và diacylglycerol. Hậu quả của sự gia tăng tín hiệu truyền thứ hai là sự hoạt hóa protein kinase như cAMP-dependent kinase và Ca2+ phospholipid dependent kinase với sự phosphoryl hóa protein. IP3 có thể làm tăng nồng độ Ca2+ nội bào bằng cách phóng thích các Ca2+ từ nguồn dự trữ Ca2+ nội bào. Sự gia tăng Ca2+ nội bào là hậu quả của sự kích thích thụ thể ZP3 do dòng nhập vào từ môi trường ngoài, phụ thuộc và sự hoạt hóa protein G, qua kênh Ca2+ và kèm theo sự xâm nhập của ion hydro dẫn đến sự gia tăng pH nội bào. Sự gia tăng nồng độ Ca2+ cùng với nồng độ pH nội bào dẫn đến phản ứng cực đầu. Người ta thấy rằng phản ứng cực đầu xảy ra trong suốt thời gian nồng độ Ca2+ tăng. 1.1.4. Xuyên màng trong suốt Sau khi phản ứng cực đầu xảy ra, tinh trùng vẫn gắn với màng trong suốt tại vị trí ZP2, tiếp theo tinh trùng sẽ phải xuyên qua màng trong suốt để đến và hòa màng với màng bào tương noãn. Sự xâm nhập qua màng trong suốt xảy ra sau khi tinh trùng trải qua hiện tượng tăng động và ly giải bằng enzyme. Hoạt động ly giải bằng enzyme được thực hiện bởi một enzyme protease của thể cực đầu gọi là acrosin. Nơi gắn kết của tinh trùng với ZP2 được cho là có vai trò tạo ra một vị thế chắc chắn để tại đó tinh trùng chui qua màng trong suốt bằng một đường hẹp tạo với bề mặt màng một góc 45 độ nhưng đôi khi cũng có thể xuyên vuông góc hoặc song song với bề mặt màng. 1.1.5. Sự hòa nhập tinh trùng và noãn Quá trình hòa màng giữa các giao tử phụ thuộc vào nhiệt độ, pH và Ca2+. Sự dung hợp xảy ra do dự hỗ trợ của các protein màng. Trong quá trình xâm nhập
8 vào màng trong suốt, tinh trùng mất dần cực đầu và chỉ màng cực đầu bên trong là trực tiếp tương tác với màng trong suốt [9]. Bề mặt của màng noãn được cấu tạo bởi các vi lông mao ngắn, có khoảng cách đều nhau tạo thuận lợi cho sự dung hợp ở người, vi lông mao hiện diện trên toàn bộ bề mặt noãn và không phân cực ở giai đoạn này. Màng bào tương tinh trùng còn lại hòa với màng bào tương noãn và đánh dấu điểm xâm nhập. Tinh trùng thụ tinh tiếp tục di chuyển một đoạn khoảng 20 giây sau khi gắn vào bề mặt noãn [9]. 1.1.6. Hoạt hóa noãn Sự trưởng thành tế bào chất: để có thể thụ tinh thành công va phát triển phôi ở giai đoạn sớm, noãn cần trưởng thành tế bào chất. Quá trình này song song diễn ra với quá trình hoạt hóa tinh trùng gồm [9]: - Nhân tố điều chỉnh pha M ( M – phase promoting factor – MPF) được biểu hiện ở mức độ cao. - Tăng nồng độ các nhân tố hiện diện trong noãn như c-mos, mitogen activate protein kinase (MAPK) và hoạt động của p34cdc2. - Trục xuất thể cực thứ nhất. - Hầu hết quá trình phiên mã kết thúc trước GVBD và chuyển sang dự trữ mRNA (Messenger Ribonucleic acid). Các nhân tố hoạt hóa noãn: Trong quá trình thụ tinh, sự xâm nhập tinh trùng vào noãn ngoài việc cung cấp các thành phần di truyền, còn gây một loạt các phản ứng sinh lý giúp noãn tiếp tục hoàn tất quá trình giảm phân và chuẩn bị cho quá trình hình thành phôi sau đó. Hiện tượng này gọi là hoạt hóa noãn. Sự kiện đầu tiên của quá trình hoạt hóa noãn là sự tăng các ion xuyên màng bào tương. Ở người, tinh trùng tạo ra một dòng điện bên ngoài bằng cách hoạt hóa kênh K+ được điều khiển qua cổng Ca2+.