Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Xác định genotype HPV (Human Papilloma Virus) ở một số phụ nữ tới khám tại khoa sản của Bệnh viện Trường Đại học Y khoa Thái Nguyên nhiễm virus bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:52

Thêm vào BST

Báo xấu

29
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm phát hiện được HPV ở phụ nữ bằng kỹ thuật Realtime-PCR; xác định được genotype HPV bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Xác định genotype HPV (Human Papilloma Virus) ở một số phụ nữ tới khám tại khoa sản của Bệnh viện Trường Đại học Y khoa Thái Nguyên nhiễm virus bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ----------------------- VŨ KỲ LIÊN XÁC ĐỊNH GENOTYPE HPV (HUMAN PAPILLOMA VIRUS) Ở MỘT SỐ PHỤ NỮ TỚI KHÁM TẠI KHOA SẢN CỦA BỆNH VIỆN TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y KHOA THÁI NGUYÊNNHIỄM VIRUS BẰNG KỸ THUẬT LAI PHÂN TỬ REVERSE DOT BLOT LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên, 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
ii MỤC LỤC MỤC LỤC ............................................................................................................... i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... iv DANH MỤC HÌNH ẢNH ....................................................................................... v DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. vi MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2 3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3 1.1. HPV – Human Papilloma Virus .................................................................... 3 1.1.1. Đặc điểm HPV........................................................................................ 3 1.1.2. Bộ gen HPV ........................................................................................... 4 1.1.3. Phân type HPV ....................................................................................... 9 1.1.4. Chu kỳ sống.......................................................................................... 10 1.2. Ung thƣ cổ tử cung do HPV ở ngƣời ........................................................... 13 1.2.1. Các bệnh do HPV ................................................................................. 13 1.2.2. Ung thƣ cổ tử cung ............................................................................... 14 1.2.3. Dịch tễ học HPV................................................................................... 18 1.3. Các phƣơng pháp phát hiện HPV ................................................................ 20 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 20 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc .......................................................... 21 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 24 2.1. Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................... 24 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................... 24 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ................................................................ 24 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................... 25 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 26 2.3.1. Phƣơng pháp thu nhận và xử lý mẫu bệnh phẩm ................................... 26 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
iii 2.3.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA bằng phenol - chloroform ....................... 26 2.3.3. Phƣơng pháp Realtime-PCR phát hiện HPV-DNA ............................... 27 2.3.4. Phƣơng pháp lai Reverse Dot Blot (RDB) ............................................ 28 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 31 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số và phát hiện HPV-DNA ............................ 31 3.2. Kết quả xác định type (genotype) virus HPV............................................... 34 3.2.1. Kiểu type HPV đƣợc phát hiện ............................................................. 36 3.2.2. Sự phân bố của các types HPV đƣợc phát hiện ..................................... 37 3.2.3. Sự đồng nhiễm các type HPV ............................................................... 38 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ ........................................................................ 41 KẾT LUẬN ....................................................................................................... 41 KHUYẾN NGHỊ ............................................................................................... 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt 1 ASCUS Atypical Squamous cell of Thay đổi tế bào biểu mô Undetermined Significance gai không điển hình 2 CIN Cervical Intraepithelial Tân sinh trong biểu mô Neoplasia cổ tử cung 3 EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid 4 EV Epidermaldysplasia Rối loạn mụn cóc da biểu Vereuciform mô 5 HGSIL High-grade Squamous Tổn thƣơng biểu mô lát Intraepithelial Lesion mức độ cao 6 IARC International Agency for Tổ chức nghiên cứu ung Resegrch on Cancer thƣ quốc tế 7 kb Kilo base 8 kDa Kilodalton 9 LCR Long Control Region Vùng điều khiển dài 10 LSIL Low-grade Squamous Tổn thƣơng biểu mô lát Intraepithelial Lesion mức thấp 11 ORF Open reading frame Khung đọc mở 12 PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp 13 RDB Reverse Dot Blot Lai phân tử 14 SIL Squamuos Intraepithelial Tổn thƣơng biểu mô vảy Lesion 15 URR Upstream Regulatory Region Vùng điều hòa thƣợng nguồn 16 VLPs Virus like particles Hạt virus giả Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Sự hình thành capsid của genome HPV .................................................... 3 Hình 1.2. Hình dạng HPV........................................................................................ 4 Hình 1.3. Cấu trúc bộ gene HPV ............................................................................. 5 Hình 1.4. Bộ gene HPV dạng mạch thẳng................................................................ 6 Hình 1.5. Cấu tạo hạt giả virus ................................................................................ 6 Hình 1.6. Hình ảnh HPV gây mụn cóc trên da và sùi mào gà miệng ...................... 14 Hình 1.7. Sơ đồ tóm tắt cơ chế gây ung thƣ của HPV ............................................ 15 Hình 1.8. Hình ảnh ung thƣ cổ tử cung .................................................................. 17 Hình 1.9. Hình ảnh tế bào biểu mô cổ tử cung bình thƣờng (trái) và tế bào ung thƣ cổ tử cung (phải).................................................................................................... 18 Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình xác định type HPV trên mẫu bệnh phẩm ........... 26 Hình 3.1. Kết quả phát hiện HPV (HPV-DNA dƣơng tính).................................... 32 bằng kỹ thuật Realtime-PCR. ................................................................................ 32 Hình 3.2. Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM và mầu JOE của chứng dƣơng. ........... 32 Hình 3.3. Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM và mầu JOE ........................................ 33 của chứng âm. ....................................................................................................... 33 Hình 3.4. Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM và mầu JOE ........................................ 33 của mẫu xét nghiệm ............................................................................................... 33 Hình 3.5. Sơ đồ vị trí gắn các mẫu dò probes đặc hiệu cho 24 types HPV trên màng lai. ......................................................................................................................... 36 Hình 3.6. Biểu đồ phân bố các types HPV ............................................................. 37 Hình 3.7. Tỷ lệ đồng nhiễm các type HPV ............................................................. 39 Hình 3.8. Kết quả màng lai với nhóm HPV nguy cơ thấp (type 6, 11 và 81) .......... 40 Hình 3.9. Kết quả màng lai với nhóm HPV nguy cơ cao (type 16 và 18) ............... 40 Hình 3.10. Kết quả màng lai với kiểu đồng nhiễm HPV nguy cơ thấp-thấp ........... 40 Hình 3.11. Kết quả màng lai với kiểu đồng nhiễm HPV nguy cơ cao-thấp............. 40 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm ................................... 24 Bảng 2.2. Các thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ........................................... 25 Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm các type HPV ..................................................................... 37 Bảng 3.2. Tỷ lệ nhiễm đơn thuần và đồng nhiễm các types HPV ........................... 38 Bảng 3.3. Tỷ lệ đồng nhiễm các types HPV ........................................................... 38 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Hiện nay ung thƣ cổ tử cung là loại ung thƣ xếp thứ hai trong các bệnh ung thƣ phổ biến của phụ nữ trên thế giới nhƣng lại chiếm vị trí đầu trong các bệnh ung thƣ của phụ nữ ở các nƣớc đang phát triển. HPV (Human Papilloma Vius) đã và đang là mối nguy hiểm đe dọa sức khỏe của những ngƣời phụ nữ mắc ung thƣ cổ tử cung hoặc những phụ nữ mang virus này. HPV đƣợc định type (genotype) dựa trên sự khác biệt về trình tự DNA của virus. Đến nay các nhà khoa học đã xác định đƣợc trên 100 type HPV khác nhau trong đó hơn 80 type đã đƣợc giải trình tự toàn bộ hệ gen và các type còn lại cũng đã đƣợc giải mã một phần. Dựa trên khả năng gây ra các tổn thƣơng mô học, đặc biệt là khả năng gây ung thƣ cổ tử cung, HPV đƣợc chia làm hai nhóm: nhóm HPV nguy cơ cao (High-risk HPV) gồm các type HPV16, 18, 31, 45, 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 66, 68 ,70... trong đó HPV16, 18 chiếm tỷ lệ cao nhất. Các type HPV nguy cơ cao là nguyên nhân chính gây ra các tổn thƣơng nghiêm trọng và phát triển thành ung thƣ cổ tử cung. Nhóm HPV nguy cơ thấp (Low-risk HPV) gồm các type HPV1, 2, 6, 8, 9, 11, 42, 43, 44, 48, 49, 50, 64... phổ biến nhất là HPV6, 11. Các type nguy cơ thấp là tác nhân gây nên đa số các dạng sùi mào gà sinh dục (HPV6, 11), mụn cóc ở chân (HPV1), mụn cơm ở tay (HPV2) và các dạng viêm nhiễm khác. Mối liên quan giữa nhiễm HPV và ung thƣ cổ tử cung đã đƣợc xác định từ những năm 70 của thể kỷ trƣớc, theo đó HPV gây ra rối loạn sinh sản của tế bào biểu mô cổ tử cung, với diễn tiến tự nhiên từ viêm nhiễm mạn tính, đến dị sản nhẹ, dị sản vừa, dị sản nặng, rồi ung thƣ cổ tử cung. Tuy hầu hết (khoảng 98%) tình trạng nhiễm HPV sẽ tự khỏi, nhƣng các types HPV thuộc nhóm nguy cơ cao có thể làm tổn thƣơng cổ tử cung nặng hơn hoặc thành ung thƣ, thƣờng sau khoảng 10 năm. Khi đã bị nhiễm và có tổn thƣơng do HPV, không có thuốc điều trị đặc hiệu cho HPV, để tránh nguy cơ tổn thƣơng diễn tiến nặng hơn, chỉ có một cách điều trị là lấy đi tổn thƣơng này.
2 Hạn chế quan hệ tình dục sớm, không quan hệ tình dục với nhiều ngƣời và tình dục an toàn là những cách có thể giúp giảm nguy cơ nhiễm HPV. Tuy nhiên, cách phòng ngừa nhiễm HPV hiệu quả nhất là tiêm ngừa vacxin, hiện nay ở Việt Nam đang lƣu hành 3 loại vacxin phòng 4 types HPV phổ biến (type 6, 11, 16 và 18) đó là vacxin Vacxin Gardasil (MERCK &CO., Inc.,) và vacxin Cervarix (GlaxoSmithKline). Với những tiến bộ của y khoa hiện đại, ung thƣ cổ tử cung có thể đƣợc chữa khỏi nếu bệnh đƣợc phát hiện sớm. Do đó bên cạnh việc tầm soát ung thƣ cổ tử cung bằng xét nghiệm tế bào học cổ tử cung (xét nghiệm PAP) thì việc phát hiện tình trạng nhiễm HPV và định type virus này cũng có vai trò rất quan trọng. Trên cơ sở các kết quả thu đƣợc từ những đề tài nghiên cứu về HPV trƣớc đây, chúng tôi thực hiện đề tài “Xác định genotype HPV (Human Papilloma Virus) ở một số phụ nữ tới khám tại khoa sản của Bệnh viện Trƣờng Đại học Y khoa Thái Nguyên nhiễm virus bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot”. 2. Mục tiêu nghiên cứu 1. Phát hiện đƣợc HPV ở phụ nữ bằng kỹ thuật Realtime-PCR. 2. Xác định đƣợc genotype HPV bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot. 3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu và phát hiện tình trạng nhiễm HPV ở nhóm phụ nữ đƣợc lựa chọn bằng kỹ thuật Realtime-PCR. - Xác định các genotype HPV ở những trƣờng hợp nhiễm virus này bằng kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot.
3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. HPV – Human Papilloma Virus 1.1.1. Đặc điểm HPV Human Papilloma Virus (HPV) là nhóm virus có kích thƣớc nhỏ, mang vật liệu di truyền là DNA, gây bệnh ở ngƣời thuộc họ Papovaviridae. HPV có cấu trúc capsid không vỏ và đối xứng xoắn ốc, đƣờng kính hạt virus khoảng 52- 55nm chứa DNA dạng vòng, mạch đôi, liên kết với protein giống histone. Vỏ capsid đƣợc tạo thành từ 72 đơn vị capsomere, mỗi đơn vị là một pentamer của protein cấu trúc L1 và một protein cấu trúc L2 (protein này là thành phần kháng nguyên đƣợc sử dụng trong miễn dịch đặc hiệu). Cả hai protein cấu trúc đều do virus tự mã hóa: Protein capsid chính (L1) chiếm khoảng 80% tổng số protein của virus. Protein capsid phụ (L2) chiếm khoảng 20%. Riboxom có hệ số lắng là 21S. Tiểu phần lớn có một vòng xoắn cuộn có thể chuyển đổi thành tiểu phần nhỏ trong quá trình sao chép. Ngoài ra, một tiểu phần thứ 3 có hệ số lắng là 14S sẽ xuất hiện chịu trách nhiệm sao chép lại DNA tế bào chủ khi bao trong Virion. Khi đó, capsid chứa DNA tế bào chủ đƣợc gọi là Virion giả hay Pseudovirion. Hình 1.1. Sự hình thành capsid của genome HPV
4 Hình 1.2. Hình dạng HPV HPV không phát triển trong điều kiện nuôi cấy trong phòng thí nghiệm, do đó muốn thực hiện đề tài này chỉ có thể dựa trên nghiên cứu invivo trên ngƣời bị nhiễm và những mẫu bị nhiễm sẽ đƣợc lƣu giữ ở nhiệt độ -700C trong một thời gian dài mà không làm ảnh hƣởng tới khả năng hoạt động của virus [22]. 1.1.2. Bộ gen HPV Genome của HPV là một phân tử ADN kép không hoàn chỉnh, siêu xoắn vòng tức là capsome sắp xếp xung quanh theo chiều xoắn của acid nucleic (ở đây là DNA) tạo thành ống giống nhƣ cầu thang xoắn, chiều dài của capsid phụ thuộc chiều dài sợi acid nucleic, bộ gen virus chiếm 12% trọng lƣợng hạt virus, có kích thƣớc nằm trong khoảng 7,2 kb đến 8,1 kb (trong đó các base Guanine và Cytosine chiếm 42%), 10 khung đọc mở ORF. Khung đọc mở mã hoá cho toàn bộ protein của HPV nằm trên một mạch của phân tử ADN kép, tức là sự sao chép, phiên mã xảy ra trên một mạch và chỉ theo một chiều duy nhất [22].
5 Hình 1.3. Cấu trúc bộ gene HPV Dựa theo chức năng, genome của HPV đƣợc chia thành ba vùng chính: Vùng gene mã hoá cho protein muộn bao gồm các gene mã hoá cho các protein cấu trúc L1 và L2 hình thành vỏ capsid của virus. Gene L1 và L2, vùng L1 mã hóa protein L1 là thành phần chủ yếu cấu tạo vỏ capsid của virus, đây là vùng bảo tồn nhất của virus và cũng là vùng để phát hiện cũng nhƣ phân loại virus. L1 có trọng lƣợng phân tử 56-60 kDa, đƣợc phosporyl hóa yếu và không gắn với DNA. Vùng L2 mã hóa protein vỏ capsid phụ, có trọng lƣợng phân tử 49-60 kDa, lại đƣợc phosphoryl hóa cao và có khả năng gắn DNA [22].
6 Hình 1.4. Bộ gene HPV dạng mạch thẳng Khi chỉ gen L1 bộc lộ, có thể hình thành các hạt giả virus hoặc phân tử giống virus (Virus like particles - VLPs), các thành phần này khó phân biệt với virus thực sự và đóng vai trò quyết định trong sản xuất virus, sản xuất vaccine. Hình 1.5. Cấu tạo hạt giả virus Nếu L2 bộc lộ cùng với L1, nó cũng góp phần tạo ra VLPs, nhƣng L2 không cần thiết cho việc hình thành vỏ capsid. L1 và L2 bộc lộ đặc hiệu trong hầu hết lớp ngoài cùng của tế bào sừng (nơi giải phóng các virus mới đƣợc hình thành). Mặc dù L2 không đặc biệt cần thiết cho việc hình thành vỏ capsid nhƣng có vai trò quan trọng trong chu kỳ sống và trong quá trình xâm nhập của virus do L2 có khả năng tạo sự gắn kết giữa receptor bề mặt tế bào với actin và với PML, cần thiết cho giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm [22].
7 Vùng gene mã hoá cho các protein sớm gồm 6 gene: E1, E2, E4, E5, E6 và E7 và khung đọc mở ORF. Các gene này mã hóa cho các protein có vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của virus và sự tiến triển của ung thƣ cổ tử cung. - Gene E1 là một trong 2 vùng bảo tồn nhất ở HPV (cùng với vùng L1). Chức năng chính của E1 là mã hóa cho protein gắn đặc hiệu vào DNA, Gene E1 gắn vào vị trí khởi đầu của quá trình nhân lên (ori), thực hiện quá trình chia tách DNA (helicase) và giúp các chuỗi gene của virus duỗi ra trong quá trình sao chép. E1 có hoạt động tháo xoắn không phụ thuộc ATP, rất cần thiết cho sự sao chép của virus [22]. - Gene E2, ngoài chức năng trong sao chép DNA của virus, E2 là gene mã hóa chủ yếu cho các nhân tố phiên mã của tế bào, duy trì chuỗi gene virus ngoài nhiếm sắc thể. Chức năng điều hòa giải mã của gene E2 đƣợc thực hiện do sự gắn kết với E2BSs trong chuỗi gene của virus có ái lực với gene E2 và những vị trí liên quan này xác định hiệu quả của gene E2 trong quá trình giải mã. Bên cạnh đó, E2 còn tƣơng tác với E1, giúp E1 dễ dàng gắn với điểm khởi đầu sao chép và có thể bắt đầu sao chép tăng cƣờng hơn [22]. Gene E1 và E2 đóng vai trò quan trọng trong điều chỉnh quá trình nhân lên của virus. Gene E2 còn có khả năng gắn với chuỗi DNA đặc hiệu (vị trí gắn E2 - E2BSs) và protein E1. Tuy nhiên, cả hai chức năng của E2 đều do gene E1 điều chỉnh. Trong quá trình sao chép virus, có nhiều thành phần tế bào phụ thuộc gene E1 nhƣ DNA polymerase, chaperone protein, histone H1 và yếu tố sao chép A vì gene E1 có khả năng trực tiếp thúc đẩy các thành phần này [22]. - Gene E4 mã hóa cho protein E4, có vai trò trợ giúp trong sự trƣởng thành và phóng thích HPV ra khỏi tế bào mà không làm tan tế bào chủ. - Gene E5 tổng hợp protein E5 một protein chuỗi đôi kỵ nƣớc, kích thƣớc nhỏ nằm ở phần màng Golgi và lƣới nguyên sinh chất của tế bào, giúp HPV xâm nhập và tồn tại trong tế bào chủ. Protein E5 tác động ngay trong giai đoạn đầu của sự xâm nhiễm, chúng tạo ra các phức hợp với các thụ thể của nhân tố tăng trƣởng và biệt hóa, từ đó kích thích sự phát triển của tế bào và giúp virus lẩn trốn khả năng
8 miễn dịch của tế bào chủ. Protein E5 còn có vai trò trong việc ngăn chặn sự chết theo chƣơng trình của tế bào khi có sự sai hỏng DNA do chính virus gây ra [22]. - Gene E6 mã hóa protein E6, cực kỳ quan trọng trong vai trò gây ung thƣ, nhất là ở những types đƣợc xếp vào nhóm nguy cơ cao gây ung thƣ. Protein E6 gồm 151 amino acid hình thành 4 cấu trúc Cys-X-X-Cys gắn với kẽm điều hòa. Ba chức năng chủ yếu của E6 cũng là những chức năng rất nguy hiểm đối với tế bào chủ: Thứ nhất, liên kết hoặc không liên kết với protein E7 đều có khả năng kích thích tế bào chủ phân bào mạnh mẽ và sự phân chia là mãi mãi gây bất tử hóa tế bào. Thứ hai, gắn kết với protein p53 (một protein ức chế khối u của tế bào) và làm tăng sự phân giải của protein p53 bởi hệ thống protein ubiquitin của tế bào và làm tăng khả năng ức chế khối u của protein này, E6 còn có khả năng gắn kết với protein PDZ dẫn đến sự thoái triển của protein PDZ, một protein đƣợc bảo tồn trong quá trình tiến hóa, cần thiết cho sự phát triển, kết dính, tăng sinh, biệt hóa và duy trì chu kỳ sống của tế bào. Thứ ba, là liên kết với gene ras trong quá trình bất tử hóa tế bào, kích thích sự phát triển của tế bào NIH 3T3, hoạt hóa promoter E2 của Adenovirus [22]. - Gene E7, tuy nhỏ hơn E6, protein E7 đƣợc mã hóa từ gene này chỉ gồm 98 amino acid và hình thành 2 cấu trúc gắn kẽm, nhƣng E7 cũng có vai trò không kém phần quan trọng trong việc gây ung thƣ ở tế bào chủ. Trƣớc hết là sự tƣơng đồng ở cấu trúc gắn kẽm với E6, đều là cấu trúc Cys-X-X-Cys, góp phần liên kết chặt chẽ với E6 hơn, hỗ trợ nhau tác động lên sự bất tử hoá tế bào chủ. Nếu nhƣ E6 cản trở quá trình tự sửa sai của tế bào chủ thông qua liên kết với p53 thì E7 thực hiện vai trò này thông qua kiên kết với pRB, cũng là một gene ức chế khối u. Ái lực liên kết này cao gấp 10 lần ở những types thuộc nhóm nguy cơ cao so với nhóm nguy cơ thấp. Điều này làm giải phóng số lƣợng lớn nhân tố phiên mã E2F tự do, kích thích quá trình phiên mã, kéo dài tuổi thọ tế bào [22]. Vùng điều hoà ngƣợc còn gọi là vùng điều khiển dài (LCR) không có chức năng mã hoá (chứa DNA không mã hóa, có chức năng điều hòa quá trình sao chép và quá trình phiên mã), vùng này có kích thƣớc 400-1000 bp. Vùng LCR mang các trình tự điều khiển quá trình sao chép của HPV. Vùng điều hòa thƣợng nguồn URR
9 (Upstream Regulatory Region) hay cũng còn gọi là vùng điều hòa dài LCR (Long Control Region): Chiếm 10% chiều dài bộ gene, chứa khoảng 800-1000 cặp base tùy từng type. Đây cũng là vùng biến động nhất trong bộ gene HPV. Trình tự của vùng bao gồm: - Trình tự tăng cƣờng: Là nơi gắn của các nhân tố phiên mã (TEF1, TEF2, YY1...). - Promoter bao gồm cấu trúc TATA và vùng khởi đầu cho quá trình phiên mã tổng hợp RNA (ở HPV 16 và HPV 18). - Điểm khởi đầu sao chép ORI, các tiểu phần kích hoạt và một số chuỗi gene câm (Silencing gene)... 1.1.3. Phân type HPV HPV đƣợc định type dựa trên sự khác biệt về trình tự ADN. Đến nay các nhà khoa học đã xác định đƣợc trên 100 types HPV khác nhau trong đó hơn 80 types đã đƣợc giải trình tự toàn bộ hệ gen và các types còn lại cũng đã đƣợc giải mã một phần. Có thể nói HPV là một trong số virus có nhiều types nhất. Việc định type HPV không dựa vào huyết thanh nhƣ định type virus khác (virus gây viêm gan, HIV…) mà đƣợc dựa trên sự tƣơng đồng DNA. Khi một type HPV có ít nhất 10% gene vùng E6, E7, L1 khác với những types HPV đã biết trƣớc đó thì đƣợc xem là một type HPV mới. Ngoài ra, ngƣời ta còn phân loại đến mức type phụ và những dạng dễ thay đổi. Đƣợc xếp vào type phụ khi bộ gene của chúng khác nhau 2-10% trong cùng 1 type đã biết. Nếu sự khác nhau chiếm 1-2% nằm trong vùng mã hóa, hoặc 5% trong vùng không mã hóa thì đƣợc xem là dạng dễ thay đổi [32]. Dựa trên khả năng gây ra các tổn thƣơng mô học, đặc biệt là khả năng gây ung thƣ cổ tử cung, HPV đƣợc chia làm hai nhóm: Nhóm HPV nguy cơ cao (High-risk HPV) gồm các types HPV16, 18, 31, 45, 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 66, 68 ,70... Trong đó HPV16, 18 chiếm tỷ lệ cao nhất. Các types HPV nguy cơ cao là nguyên nhân chính gây ra các tổn thƣơng nghiêm trọng và phát triển thành ung thƣ cổ tử cung.
10 Nhóm HPV nguy cơ thấp (Low-risk HPV) gồm các types HPV1, 2, 6, 8, 9, 11, 42, 43, 44, 48, 49, 50, 64... phổ biến nhất là HPV6, 11. Các types nguy cơ thấp là tác nhân gây nên đa số các dạng mụn cơm, mụn cóc sinh dục (HPV6, 11), sùi mào gà ở chân (HPV1), sùi mào gà ở tay (HPV2) và các dạng viêm nhiễm khác. Và có một nhóm chƣa xác định đƣợc nguy cơ (Unknown-risk type): Gồm đa số các genotype HPV chƣa xác định đƣợc khả năng gây ung thƣ nhƣ: HPV 2a, 3, 7, 10, 13, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 55, 57, 62, 67, 69, 71, 74… Điều dẫn đến sự khác nhau trong hoạt động của chúng là do vùng gene E6, E7. Ở nhóm nguy cơ thấp, protein E6, E7 liên kết rất yếu với p53, pRb của ngƣời và không có khả năng gắn xen vào DNA tế bào chủ [32]. 1.1.4. Chu kỳ sống Ung thƣ cổ tử cung là một hệ quả tất yếu có sự lan truyền lây lan qua đƣờng tình dục. Thời gian từ lúc tiếp xúc với mầm bệnh cho tới khi xuất hiện mụn cóc là khoảng 3 tháng, cũng có thể là vài tuần hoặc có thể là vài chục năm do tùy vào tình trạng sức khỏe và đặc điểm sinh lý của mỗi ngƣời. Sự biểu hiện này có thể chỉ thoáng qua và đƣợc xử lý bởi hệ miễn dịch của vật chủ. Sau đó, HPV sẽ vào giai đoạn tiềm ẩn. Tuy nhiên, đối với những ngƣời có quan hệ tình dục bừa bãi, sự biểu hiện có thể sẽ vƣợt khỏi sự kiểm soát của hệ miễn dịch và dẫn đến sự chuyển từ dạng ôn hoà sang dạng ác tính, đó là bƣớc tiếp theo cho sự tấn công của virus [21]. HPV không giết chết tế bào chủ. Thay vào đó, nó điều khiển tế bào chủ thông qua yếu tố gây mƣng mủ tế bào biểu mô tự nhiên. Sau đó, chúng sản xuất protein capsule trên lớp biểu mô bề mặt để bảo vệ DNA của nó trong quá trình di truyền. Với sự loại bỏ bề mặt nhuộm tự nhiên này, các tế bào chuyên chở HPV nhƣ là một vector di truyền. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sau khi lây nhiễm vào cơ thể, các gene gây ung thƣ (oncogen) của các virus này sẽ tƣơng tác với các yếu tố có mặt trong tế bào chủ để thúc đẩy sự chuyển dạng tế bào. Sau khi tích hợp vào hệ gene vật chủ, cấu trúc của gene E2 trong genome HPV bị phá vỡ và không còn khả năng kiểm soát hai gene gây ung thƣ E6 và E7, do đó hai gene này đƣợc sao mã và tổng hợp các
11 protein tƣơng ứng. Hai protein E6 và E7 sẽ tƣơng tác với hai protein của tế bào là protein RB (điều hoà chu trình tế bào) và protein p53 (điều hòa sinh trƣởng khối u). Kết quả là tế bào bị nhiễm HPV sinh sản tự phát, không bị kiểm soát và phát triển thành tế bào ung thƣ. HPV kìm chế hoạt động của hàng loạt các gene có vai trò trong quá trình sinh trƣởng của tế bào và đáp ứng interferon chống virus, đồng thời cũng làm tăng biểu hiện của hàng loạt các gene có vai trò trong hình thành các khối u. Có thể chia chu kỳ sống của HPV thành 4 giai đoạn chính sau: Giai đoạn xâm nhập: Chỗ xâm nhiễm đầu tiên của HPV là những tế bào nằm ở những vị trí dễ bị thƣơng (tế bào lớp đáy), có thể chỉ là những vết thƣơng rất nhỏ gây ra do quan hệ tình dục. Khả năng virus xâm nhập vào những tế bào cơ bản này là rất cao. Sau đó, chính sự lành lặn lại ở chỗ vết trầy xƣớt này bằng việc kích thích sự phân chia những tế bào cơ bản ban đầu đó sẽ dẫn đến làm tăng nhanh thêm sự sao chép của HPV trong tế bào chủ vì đây là giai đoạn mà HPV chỉ sao chép khi tế bào chủ sao chép. Chính vùng dễ bị tổn thƣơng nhất trong quan hệ tình dục trở thành nơi phổ biến nhất cho virus phát triển [21]. Giai đoạn tiềm ẩn: DNA HPV có thể tồn tại rất lâu với số lƣợng ít và không sao chép, không tạo các hạt virus. Các gene E1, E2 rất cần thiết cho sự nhân lên của virus ở giai đoạn này. Đây là giai đoạn có sự xâm nhiễm của HPV nhƣng các kỹ thuật xét nghiệm tế bào, hình thái, soi phóng đại đều cho kết quả bình thƣờng. Chỉ những xét nghiệm sinh học phân tử có độ nhạy cao nhƣ PCR, lai phân tử mới có khả năng phát hiện HPV. Thời kỳ này có thể kéo dài 1-8 tháng, tuỳ tình trạng sức khoẻ mỗi ngƣời và ngƣời ta không xác định đƣợc là hệ miễn dịch có hoạt động hay không. Cũng có ý kiến cho rằng lúc này hệ miễn dịch không hoạt động vì đòi hỏi sự phát triển số lƣợng virus và những sản phẩm xâm nhiễm đến một giới hạn nào đó mới kích thích đƣợc hệ miễn dịch hoạt động. Hầu hết những bệnh nhân đều chỉ có những biểu hiện thoáng qua và không xác định đƣợc [21]. Giai đoạn nhân bản mạnh: Nếu nhƣ ở giai đoạn trên, HPV chỉ sao chép cùng tế bào chủ thì bƣớc vào giai đoạn này, HPV sẽ là tác nhân kích thích tế bào chủ phân chia mạnh. Từ sự hiện diện thấp lƣợng DNA virus ở những tế bào cơ bản,
12 sẽ có sự gia tăng mạnh số lƣợng DNA virus lẫn những sản phẩm xâm nhiễm ở những tế bào biểu mô gần bề mặt nhất (sự tích lũy protein và những dạng virion của chúng…). Sự xâm nhiễm có hiệu lực 3-8 tháng trƣớc khi hệ miễn dịch bắt đầu hoạt động. Chúng phát triển mạnh các mạch máu bao quanh (nhất là ở những types 6, 11) hình thành mụn nhỏ, dẹt, phẳng hoặc lồi, đến những biểu hiện ban đầu của bệnh condyloma, acanthosis, koilocytosis, nuclear attypia….[21]. Giai đoạn có hoạt động của tế bào chủ: Đây là giai đoạn quan trọng quyết định sự thành công hay thất bại của hệ miễn dịch khi đối phó với virus. Thời gian này thƣờng từ 3-6 tháng, sau khi đã qua giai đoạn nhân bản mạnh của virus, có thể nhanh hơn hoặc là không bao giờ. Nguyên nhân là vì HPV không xuyên xuống màng nền biểu mô, chúng chỉ xâm nhập vào các tế bào biểu mô lớp trên, mà các tế bào này lại rất kém trong hoạt động trình diện kháng nguyên. Nhờ đó, HPV có nhiều thuận lợi không bị hệ miễn dịch của tế bào chủ nhận diện và tiêu diệt. Chúng chỉ việc tồn tại an toàn trong những tế bào biểu mô nguyên vẹn. Chỉ khi có những tổn thƣơng tế bào (do cọ xát hay hóa chất điều trị) làm lộ HPV cho hệ miễn dịch nhận diện. Khi đó, hệ thống miễn dịch sẽ đƣợc hoạt hóa và tấn công các tế bào bị nhiễm, khởi đầu là hoạt động của các bạch cầu đa nhân (macrophages), bạch cầu đơn nhân (monocytes)… Chúng sẽ giải phóng các cytokine nhƣ interferon a, b, g, interleukine… Interferon có tác dụng làm chậm sự phát triển của virus, làm giảm những sản phẩm xâm nhiễm của chúng. Cytokine thì tấn công nhƣ là một tác nhân hóa học bằng những phần tử dính kết lên tế bào cạnh mạch máu, kêu gọi bạch cầu đến tiêu diệt vùng bị nhiễm. Kết quả của tất cả những hoạt động này là sự gia tăng cytokine của những tế bào langerhan hay tế bào dendritic. Tế bào dendritic hoạt động di chuyển qua kênh lymphatic đến vùng hạch lympho, nơi mà chúng thể hiện kháng nguyên HPV lên bề mặt để lympho T nhận diện. Khi đó sẽ hình thành các dòng lympho T đặc hiệu HPV, chúng di chuyển theo dòng máu đến vùng bị nhiễm. Đầu tiên, chúng sẽ tiếp cận các tế bào endothelial trong những mạch máu bên dƣới vùng rối loạn do HPV gây ra thông qua phân tử dính kết trên bề mặt kháng nguyên, từ đó, theo grandient nồng độ cytokine qua thành mạch máu vào bên trong biểu mô
13 nhiễm HPV. Tế bào T đặc hiệu và tế bào giết tự nhiên (natural kill cell) sẽ vào bên trong những mụn cóc, tiêu diệt tế bào bị nhiễm HPV. Bạch cầu đơn nhân và đa nhân sẽ tiêu huỷ những mảnh vụn tế bào, bao gồm cả DNA của HPV. Sự liên kết những yếu tố này giúp làm giảm kích thƣớc mụn cóc, làm sạch vùng bị nhiễm. Tế bào T đặc hiệu sẽ trở thành tế bào nhớ ngăn chặn sự xâm nhiễm trở lại. Sau khoảng 9 tháng, bệnh nhân đƣợc chia thành 2 nhóm là hết bệnh hoặc bệnh vẫn tiếp diễn. Tuy nhiên ở những bệnh nhân hết bệnh, khả năng hết hoàn toàn HPV và khả năng HPV quay lại giai đoạn tiềm ẩn là không xác định đƣợc, nên vẫn phải tiếp tục theo dõi và hạn chế lây nhiễm. Còn ở những bệnh nhân không thuyên giảm thì khả năng chuyển sang ung thƣ ác tính là cực kỳ cao [21]. 1.2. Ung thƣ cổ tử cung do HPV ở ngƣời 1.2.1. Các bệnh do HPV Trên 99% ung thƣ cổ tử cung là liên quan đến HPV, điều đó cho thấy mức độ tác động và tầm quan trọng của HPV đối với các tổn thƣơng ở vùng cơ quan sinh dục. Bên cạnh đó, HPV còn gây các bệnh rối loạn khác. Trên da, chúng gây các mụn cóc phẳng, dẹt, đôi khi nổi to thành những u sần, thậm chí dày đặc mà ngƣời ta gọi là dạng hoa súp lơ. Khi có những tác động bất lợi nhƣ: Hệ miễn dịch của cơ thể kém, vùng da chịu tác động nhiều, lâu ngày của tia UV, các hoá chất gây ung thƣ… khả năng chuyển thành ung thƣ da là rất cao. Các types gây bệnh này chiếm tỷ lệ khoảng 10%. Thƣờng gặp nhƣ types: 1, 3, 4, 60, 65, 49, 29. . . Một bệnh cũng khá phổ biến do HPV gây ra là EV (Epidermaldysplasia Verruciform): Khoảng 20% types HPV là nguyên nhân gây ra EV. Đây là một bệnh rối loạn mụn cóc dạng biểu mô. 30% bệnh nhân EV chuyển sang ung thƣ da tế bào vảy. Phổ biến nhất là HPV types 5 và 8. Các bệnh ung thƣ (ung thƣ cổ tử cung, ung thƣ thanh quản…) phần lớn là do các types HPV nhóm nguy cơ cao làm rối loạn quá trình tế bào của tế bào chủ đẫn đến ung thƣ ở các vùng chúng xâm nhiễm đặc thù.
14 Hình 1.6. Hình ảnh HPV gây mụn cóc trên da và sùi mào gà miệng Hiện nay virus HPV đang là nguyên nhân gây ra một số bệnh nhƣ ung thƣ hậu môn, vòm họng còn nhanh và mạnh hơn uống rƣợu bia, ung thƣ dƣơng vật ở nam giới và đặc biệt HPV đang đƣợc coi là “thủ phạm” của nhiều bệnh ung thƣ nguy hiểm nhƣ: Ung thƣ cổ tử cung, ung thƣ âm hộ, ung thƣ âm đạo,....ở phụ nữ. Trong nhiều nghiên cứu cho thấy virus HPV có trong 93% các ca ung thƣ cổ tử cung. 1.2.2. Ung thư cổ tử cung Là loại ung thƣ mà tế bào đầu tiên chuyển thành tế bào ung thƣ là những tế bào ở vùng cổ tử cung, chủ yếu là tế bào biểu mô vảy. Đó là những tế bào dẹt, mỏng, hình chữ nhật, lót bên trong bề mặt cổ tử cung. Khả năng ung thƣ cổ tử cung do virus HPV gây nên là rất cao. Tùy từng type HPV xâm nhiễm, đặc điểm sinh lý và lối sống của mỗi ngƣời, vùng cổ tử cung bị nhiễm HPV có thể hình thành khối u lành hay ác tính. Các khối u ác tính có thể di căn đi bất cứ vùng nào của cơ thể. Nguy cơ cao nhất là mắc phải các types thuộc nhóm nguy cơ cao. Gene E6, E7 đóng vai trò là các oncogen (gene gây ung thƣ). Vào giai đoạn cuối cùng của quá trình xâm nhiễm, khi có sự mất kiểm soát của tế bào chủ và lƣợng HPV vẫn còn duy trì