Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:73

Thêm vào BST

Báo xấu

31
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro được thực hiện với mục tiêu nhằm nghiên cứu và xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch cho loài Dây thìa canh nhằm xác định đúng loài cây phục vụ bảo tồn và phát triển cây dược liệu. Mời các bạn cùng tham khảo,

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP ĐÀO THỊ THÚY HẰNG XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU ADN MÃ VẠCH VÀ NHÂN GIỐNG DÂY THÌA CANH (GYMNEMA SYLVESTRE) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO. CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 842 02 01 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN VĂN VIỆT Hà Nội, 2018
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Nguyễn Văn Việt. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào. Luận văn cũng sử dụng thông tin, số liệu từ các bài báo và nguồn tài liệu của các tác giả khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc đầy đủ. Nếu có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn. Học viên Đào Thị Thúy Hằng
ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm Nghiệp đã trang bị kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Văn Việt đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh bản Luận văn Thạc sĩ này. Tôi xin cảm ơn các cán bộ Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp – Trường Đại học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn sát cánh hỗ trợ và động viên tôi về cả vật chất và tinh thần trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 11 tháng 11 năm 2018 Học viên Đào Thị Thúy Hằng
iii M CL C LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii M C L C ....................................................................................................... iii DANH M C CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................ v DANH M C BẢNG ....................................................................................... vi DANH M C BIỂU ĐỒ ................................................................................. vii DANH M C H NH ...................................................................................... viii ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 3 1.1. Giới thiệu về Chi Gymnema ........................................................................... 3 1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gymnema ............................................. 3 1.1.2. Các loài thuộc chi Gymnema.................................................................................. 4 1.1.3. Các loài thuộc chi Gymnema ở Việt Nam............................................................ 5 1.2. Giới thiệu chung về cây Dây thìa canh .......................................................... 6 1.2.1. Nguồn gốc, phân loại................................................................................................ 6 1.2.2. Đặc điểm thực vật học của cây Dây thìa canh.................................................... 6 1.3. Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào. ........................................................................ 7 1.3.1. Cơ sở của khoa học của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật ........... 8 1.3.2. Các bước tiến hành của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật ........... 8 1.4. Thành tựu nuôi cấy mô tế bào cây dược liệu và Dây thìa canh.................10 1.4.1. Nghiên cứu trong nước...........................................................................................10 1.4.2. Thế giới ......................................................................................................................12 1.5. Tổng quan về mã vạch ADN ........................................................................12 1.5.1. Giới thiệu về mã vạch ADN (DNA barcode) ....................................................12 1.5.2. Một số locus được sử dụng làm chỉ thị mã vạch ADN ở thực vật.................14 1.5.3. Tình hình nghiên cứu mã vạch ADN ở thực vật ...............................................18 Chƣơng 2 M C TIÊU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 22 2.1. Mục tiêu tổng quát .........................................................................................22 2.2. Mục tiêu cụ thể ...............................................................................................22 2.3. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu ....................................................................22
iv 2.3.1. Đối tượng nghiên cứu.............................................................................................22 2.3.2. Hóa chất ....................................................................................................................22 2.3.3. Dụng cụ - máy móc .................................................................................................23 2.4. Nội dung và phương pháp nghiên cứu.........................................................24 2.4.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................24 2.4.3. Chỉ tiêu theo dõi, đánh giá.....................................................................................31 2.4.4. Phương pháp theo dõi ............................................................................................32 2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu .....................................................................................32 2.5. Địa điểm và thời gian bố trí thí nghiệm .......................................................32 Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................... 33 3.1. Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch cây Dây thìa canh ........................33 3.1.1. ết quả tách chiết D t ng số ...........................................................................33 3.1.2. Kết quả PCR các đoạn mã vạch ADN ...............................................................34 3.1.3. Phân tích trình tự các đoạn mã vạch ADN với các đoạn mồi khác nhau ................................................................................................................................ 37 3.2. Kết quả nhân giống Dây thìa canh bằng phương pháp nuôi cấy in vitro.......41 3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% tỷ lệ tạo mẫu sạch và tái sinh chồi...................................................................................41 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng nhân nhanh chồi ............................................................................................................................43 3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ B P đến nhân nhanh chồi .................45 3.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin và NAA đến nhân nhanh chồi. ...............................................................................................47 3.2.5. Ảnh hưởng của hàm lượng sucrose đến khả năng ra rễ.................................50 3.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và IB đến khả năng ra rễ .......51 KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ ........................................................................... 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 56 PH L C
v DANH M C CÁC TỪ VIẾT TẮT MS Murashige & Skoog, 1962 BAP 6-Bezyl amino purine KIN Kinetin (6 -furfurol amino purine) IBA Indole -3 -Butyric Acid -NAA 1 -Naphthalene Acetic Acid CT Công thức ĐC Đối chứng ĐHST Điều hòa sinh trưởng WPM Woody Plant Medium CS Cộng sự TB Trung bình
vi DANH M C BẢNG Bảng 1.1. Vị trí phân loại của chi Gymnema .................................................... 3 Bảng 2.1. Trình tự và thông tin về cặp mồi đặc hiệu ...................................... 23 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR ............................................................. 26 Bảng 2.3. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR ..................................................... 26 Bảng 2.4. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến kết quả tạo mẫu sạch ...... 28 Bảng 2.5. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến nhân nhanh chồi....... 29 Bảng 2.6. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến nhân nhanh chồi ..................... 29 Bảng 2.7. Ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin và α-NAA đến nhân nhanh chồi30 Bảng 2.8. Ảnh hưởng của hàm lượng sucrose đến khả năng ra rễ ................. 30 Bảng 2.9. Ảnh hưởng tổ hợp nồng độ IBA và NAA đến khả năng ra rễ........ 31 Bảng 3.1. Đánh giá ba vùng ADN đề xuất ..................................................... 36 Bảng 3.2. Kết quả ảnh hưởng thời gian khử trùng đến tỷ lệ mẫu sạch và tái sinh chồi .......................................................................................................... 41 Bảng 3.3. Kết quả ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng nhân nhanh chồi ....................................................................................................... 43 Bảng 3.4. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BAP đến nhân nhanh chồi .......... 45 Bảng 3.5. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin và NAA đến nhân nhanh chồi ....................................................................................................... 48 Bảng 3.6. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng sucrose đến khả năng ra rễ ..... 50 Bảng 3.7. Kết quả ảnh hưởng nồng độ IBA và NAA đến khả năng ra rễ ...... 52
vii DANH M C BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến tỷ lệ tạo mẫu sạch và tái sinh chồi........................................................................... 42 Biểu đồ 3.2 a. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến tỷ lệ tạo cụm chồi .... 44 Biểu đồ 3.2 b. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến nhân nhanh chồi ..... 44 Biểu đồ 3.3 a. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến tỷ lệ tạo cụm chồi ............. 46 Biểu đồ 3.3 b. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến nhân nhanh chồi ............... 46 Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin và NAA đến nhân nhanh chồi .... 48 Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng sucrose đến khả năng ra rễ .............. 51 Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng nồng độ IAA và NAA đến khả năng ra rễ............... 52
viii DANH M C H NH Hình 1.1. Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex. Sehunlt.................................. 7 Hình 3.1. Kết quả điện di ADN tổng số của 5 mẫu Dây thìa canh ................. 33 Hình 3.2. Kết quả nhân đoạn gen psbA-trnH từ các mẫu Dây thìa canh thu được dùng mồi P10 ......................................................................................... 34 Hình 3.3. Kết quả nhân đoạn gen trnL từ các mẫu Dây thìa canh thu được dùng mồi p11 ................................................................................................... 35 Hình 3.4. Kết quả nhân đoạn gen ITS1 từ các mẫu Dây thìa canh dùng mồi p12 .. 35 Hình 3.5. Vị trí nucleotide sai khác so sánh trên vùng psbA-trnH.................. 38 Hình 3.6. Vị trí nucleotide sai khác so sánh trên vùng trnL ........................... 39 Hình 3.7. Vị trí nucleotide sai khác so sánh trên vùng ITS1........................... 40 Hình 3.8. Mẫu sạch tái sinh chồi tại môi trường dinh dưỡng MS .................. 42 Hình 3.9. Một số hình ảnh Dây thìa canh trong thí nghiệm 3 ........................ 46 Hình 3.10. Một số hình ảnh Dây thìa canh trong giai đoạn nhanh nhanh chồi..... 49 Hình 3.11. Dây thìa canh hoàn chỉnh .............................................................. 53
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) được đánh giá là một trong những cây dược liệu quan trọng trong chiến lược phát triển thảo dược ở Việt Nam. Thành phần hóa học có hoạt tính sinh học chính của dây thìa canh là axit gymnemic, một hoạt chất thuộc nhóm saponin triterpenoid. Ngoài ra, Dây thìa canh còn chứa các thành phần khác như flavone, anthraquinone, hentri- acontane, pentatriacontane, α và β-chlorophylls, phytin, resins, d-quercitol, axít tartaric, axit formic, axit butyric, lupeol. Axit gymnemic có tác dụng kích thích sản sinh tế bào beta của tuyến tụy, giúp cơ thể tái thiết lập được khả năng cân bằng đường huyết tự nhiên; ức chế hấp thu đường ở ruột; ức chế gan tân tạo glucose vào máu, đồng thời kích thích các enzyme chịu trách nhiệm tiêu thụ, sử dụng đường tại các mô cơ. Lá dây thìa canh được sử dụng rộng rãi trong điều trị đái tháo đường và thuốc lợi tiểu trên khắp thế giới, đặc biệt tại Ấn Độ, Việt Nam và một số nước khác. Một số hợp chất hoạt tính sinh học đã được phân lập từ thảo dược để chữa bệnh tiểu đường. Ngoài ra có thể sử dụng chống đầy hơi khó tiêu, táo bón, vàng da, bệnh trĩ, bệnh tim, hen suyễn, viêm phế quản. Hiện nay nhu cầu của con người về nguồn dược liệu trên ngày càng tăng, tuy nhiên loài cây này trong tự nhiên đang bị giảm về số lượng và chất lượng bởi sự khai thác quá mức, các điều kiện ngày càng bất lợi của môi trường tự nhiên, nên việc nghiên cứu nhân giống và bảo tồn là rất cần thiết, cấp bách đối với việc lưu giữ nguồn gen quý này. Mã vạch ADN là những đoạn ADN ngắn, nằm trong hệ gen (nhân, lục lạp và ty thể) đặc trưng của mỗi loài sinh vật. Do đó việc xác định loài bằng mã vạch ADN có độ chính xác rất cao. Phương pháp này trở thành công cụ hữu hiệu cho các nhà khoa học trong việc phân loại, đánh giá đa dạng di truyền và quan hệ di truyền các loài.
2 Dây thìa canh có thể được nhân giống bằng các phương pháp, gieo hạt và giâm hom, những biện pháp nhân giống này đều có những ưu điểm nhất định nhưng không tránh khỏi những nhược điểm như cây sinh trưởng không đồng đều, hệ số nhân thấp, phụ thuộc mùa vụ v.v. Để giải quyết những nhược điểm trên, phương pháp nuôi cấy mô tế bào đã rút ngắn được thời gian và cho phép nhân nhanh để tạo được số lượng rất lớn cây giống Dây thìa canh trong thời gian ngắn, vẫn đảm bảo hàm lượng hoạt chất ổn định, không nhiễm bệnh, ưu việt hơn so với các phương pháp truyền thống trên. Với mục tiêu xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch cho loài Dây thìa canh nhằm xác định đúng loài cây phục vụ bảo tồn và phát triển cây dược liệu, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: Xây dựng cơ sở dữ liệu ADN mã vạch và nhân giống Dây thìa canh (Gymnema sylvestre) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro.
3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về Chi Gymnema Lịch sử phân loại chi Gymnema gắn liền với lịch sử quan điểm phân loại của hai họ Thiên lý (Asclepiadaceae) và họ Trúc đào (Apocynaceae). Trong đa số các tài liệu phân loại thực vật kinh điển, chi Gymnema được xếp trong họ Thiên lý (Asclepiadaceae) [52], [58]. Tuy nhiên, theo hệ thống phân loại công bố năm 2009, Takhtajan đã theo quan điểm của Hallier (1905, 1912), Stebbins (1974), Thorne (2006), Endress & Bruyns (2000) và Endress & Stevins (2001) để gộp Apocynaceae và Asclepiadaceae thành một họ duy nhất, và Gymnema trở thành một chi trong phân họ Asclepiadoideae của một họ lớn là Apocynaceae [47]. Cho đến nay quan điểm này được thừa nhận rộng rãi trong các hệ thống phân loại quốc tế [59]. Bảng 1.1. Vị trí phân loại của chi Gymnema Theo thực vật chí Hệ thống của Bậc phân loại Trung Quốc [2], [52] Takhtajan (2009) [47] Ngành Magnoliophyta Magnoliophyta Lớp Magnoliopsida Magnoliopsida Phân lớp Lamiidae Lamiidae Bộ Gentianales Gentianales Họ Asclepiadaceae Apocynaceae Phân họ Asclepiadoideae Chi Gymnema Gymnema 1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gymnema Các loài thuộc chi Gymnema là cây leo, không có rễ phụ trên thân. Lá mọc đối, không nạc. Cụm hoa xim, dạng tán hoặc chùm. Hoa nhỏ. Thùy đài nhỏ, hình trứng, đầu tù, gốc đài có tuyến, ít khi không có tuyến. Tràng hình
4 bánh xe, thùy tràng không gập trong nụ, tiền khai vặn phải. Tràng phụ đơn,vảy tràng phụ dính ở tràng, thường có các hàng lông xếp dọc theo tràng. Chỉ nhị dính nhau, bao phấn 2 ô, có phần phụ ở đỉnh, hạt phấn dính thành khối phấn và có sáp bao bên ngoài vách khối phấn, khối phấn không có mỏm ở đỉnh, cơ quan truyền phấn có gót đính và 2 chuôi, khối phấn hướng lên, chỉ có một khối phấn trong mỗi ô phấn. Đầu nhụy phình lên hình trứng, đỉnh bầu không thót lại thành dạng vòi nhụy; cột nhị - nhụy hình ống nhọn đầu [14], [52]. Phân bố của chi Gymnema khá rộng, ở vùng Tây châu Phi đến Australia, châu Á. 1.1.2. Các loài thuộc chi Gymnema Theo dự án “The plant list” thực hiện bởi Royal Botanic Gardens, Kew và Missouri Botanical Garden khởi động từ năm 2010 đã xác định được 120 loài thuộc chi Gymnema thu thập từ các cơ sở dữ liệu khác nhau trên thế giới trong đó có 52 tên khoa học được chấp nhận (43,3%), 50 tên được xác định là tên đồng nghĩa (41,67%), và 18 tên chưa xác định được chính xác thông tin (15%) [58]. Dưới đây là 52 loài thuộc chi Gymnema đã được chấp nhận theo “The plant list” [58]. Gymnema acuminatum Wall. Gymnema longiretinaculatumTsiang. Gymnema albidum Decne. Gymnema lushaiense M.A.Rahman & Gymnema albiflorum Costantin Wilcock. Gymnema brevifolium Benth. Gymnema macrothyrsa Warb. Gymnema calycinum Schltr. Gymnema maingayi Hook.f. Gymnema chalmersii Schltr. Gymnema mariae Schltr. Gymnema cumingii Schltr. Gymnema micradenium Benth. Gymnema cuspidatum (Thunb.) Kuntze Gymnema molle Wall. ex Wight. Gymnema decaisneanum Wight Gymnema montanum Hook.f. Gymnema dissitiflorum Ridl. Gymnema montanum var. beddomei Gymnema dunnii (Maiden & Betche) Hook.f. P.I.Forst. Gymnema muelleri Benth. Gymnema elegans Wight & Arn. Gymnema pachyglossum Schltr. Gymnema erianthum Decne. Gymnema piperii Schltr. Gymnema foetidum Tsiang. Gymnema pleiadenium F.Muell.
5 Gymnema glabrum Wight. Gymnema recurvifolium Blume. Gymnema griffithii Craib. Gymnema rotundatum Thwaites. Gymnema hainanense Tsiang. Gymnema rufescens Decne. Gymnema hirtum Ridl. Gymnema schlechterianum Warb. Gymnema inodorum (Lour.) Decne. Gymnema spirei Costantin. Gymnema javanicum Koord. Gymnema suborbiculare K.Schum. Gymnema khandalense Santapau. Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Sm. Gymnema kollimalayanum A.Ramach. & Gymnema syringaefolium (Decne.) M.B.Viswan. Costantin. Gymnema lacei Craib. Gymnema thorelii Costantin. Gymnema lactiferum (L.) R.Br. ex Schult. Gymnema tricholepis Schltr. Gymnema latifolium Wall. ex Wight. Gymnema trinerve R.Br. Gymnema littorale Blume. Gymnema uncarioides Schltr. Gymnema yunnanense Tsiang 1.1.3. Các loài thuộc chi Gymnema ở Việt Nam Tổng hợp thông tin các tài liệu thực vật trong nước của tác giả Phạm Hoàng Hộ (2000), Võ Văn Chi (2004) [3] và Trần Thế Bách (2007) [4], đồng thời với địa điểm thu mẫu của các nghiên cứu liên quan đến chi Gymnema, một số loài thuộc chi Gymnema phân bố ở Việt Nam sẽ được liệt kê trong bảng 1.2 với tên chính thức đã được đối chiếu theo hệ thống danh pháp quốc tế. Bảng 1.2. Các loài trong chi Gymnema ở Việt Nam TT Tên loài Tên thƣờng gọi Phân bố TLTK Gymnema albiflorum Bát Bạc 1 Lõa ti hoa trắng [4] Cost. (Hà Sơn Bình) Gymnema inodorum - Nam Bộ, Nha Trang, Bắc (Lour). Deene Lõa ti không mùi, Lõa Cạn, Thái Nguyên, Hòa [1], [2], [4], 2 (Tên khác: Gymnema ti nhuộm, Rau mỏ, Bình, Vĩnh Phúc [13], tingens (Roxb.) Dây thìa canh lá to - Rộng khắp trên đất rừng, [14] Sprengel cạnh suối và lùm bụi
6 TT Tên loài Tên thƣờng gọi Phân bố TLTK Hà Sơn Bình,Hòa Bình, Gymnema latifolium Dây thìa canh lá to, Ninh Bình, Kom Tum,Thái [1], [4], [13], 3 Wall. ex Wight Lõa ti lá rộng Nguyên, Tuyên Quang, Gia [14] Lai, Tây Ninh. Gymnema Kiên Giang, Kom Tum, Gia 4 Lõa ti Nam Vân [1], [13], [14] yunnanense Tsiang Lai, Đăk Lăk Gymnema Lõa ti mạng, 5 reticulatum Dây thìa canh gân Núi Dinh, Tuyên Quang [1], [2], [4] (Moon) Alst. ) mạng Hà Bắc, Sầm Sơn, Thanh Hóa,Quảng Trị,Quảng Ninh, Gymnema sylvestre Dây thìa canh, dây Phú Yên, Vĩnh Phúc, Nam [1], [2], [4], 6 (Retz) R. Br. Ex muôi, Lõa ti rừng Định, Quảng Trị, Khánh [13], [14] Schult Hòa, Quảng Nam Bờ bụi, hàng rào 1.2. Giới thiệu chung về cây Dây thìa canh 1.2.1. Nguồn gốc, phân loại Dây thìa canh hay còn gọi là Dây muôi, với danh pháp khoa học là Gymnema sylvetre (Retz), chi Lõa ti (Gymnema), họ Thiên lý (Asclepiada ceae), ở Việt Nam, chi Lõa ti (Gymnema) có khoảng 8 loài [16],[36],[37]. Cây thường mọc trong các bờ bụi, hàng rào tại một số nơi ở miền Bắc Việt Nam từ Hải Hưng, Hải Phòng, Ninh Bình, Thanh Hóa, Kon Tum,…Ngoài ra, còn phân bố ở Trung Quốc, Ấn độ, Inđonexia. 1.2.2. Đặc điểm thực vật học của cây Dây thìa canh Dây leo, cao từ 3 - 5 m; thân non màu xanh, phủ lông mịn, thân già màu nâu; có lỗ vỏ, đường kính lỗ vỏ từ 0,5 - 1 mm. Toàn cây có nhựa mủ màu trắng hay hơi vàng. Lá mọc đối, cuống dài 3 - 5 mm; đường kính cuống lá 2 - 3 mm; phiến lá hình bầu dục hoặc trứng hay trứng ngược, chiều dài lá 6 - 7 cm và
7 rộng 2,5 - 5 cm, mép nguyên; có 4 - 6 cặp gân phụ, rõ ở mặt dưới. Hoa nhỏ màu trắng hơi vàng, xếp thành xim dạng tán ở nách lá. Có 5 lá đài, các thuỳ dài 1 mm, có lông mịn và rìa lông. Tràng 5, dính nhau thành ống, dài 1,8 - 2 mm, mặt ngoài nhẵn; tràng phụ gắn với tràng, có 5 răng, dính với họng tràng. Cột nhị nhụy hình trụ, dài khoảng 1,5 mm, rộng 0,8 - 1 mm. Bộ nhị có bao phấn ngắn; khối phấn gồm hai thùy, dài khoảng 0,2 mm, liên kết với nhau nhờ trung đới màu vàng nâu. Bộ nhụy có vòi với đầu rộng hình nón vượt quá bao phấn. Quả đại dài 5 - 6 cm, rộng ở dưới, đường kính chỗ lớn nhất khoảng 1,5 cm. Hạt dẹp, dài 3 mm, có mào lông màu trắng, dài khoảng 3 - 3,5 cm, thường có khoảng 40 hạt trong một quả [16],[36],[37]. Ghi chú: 1. cành mang hoa: 2. hoa: 3. đài mở với các tuyến: 4. cột nhị nhụy: 5. nhụy: 6. cơ quan truyền phấn và khối phấn (pollinarium): 7. quả: 8. hạt (hình theo Tsiang & Li. 1977) Hình 1.1. Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex. Sehunlt 1.3. Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào. Nhân giống bằng nuôi cấy mô (propagation by tisue culture), hoặc vi nhân giống (micropropagation) là tên gọi chung cho các phương pháp nuôi cấy in vitro cho các bộ phận nhỏ được tách khỏi cây [15] đang được dùng phổ biến để nhân giống thực vật.
8 1.3.1. Cơ sở của khoa học của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật Khái niệm: Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là lĩnh vực nuôi cấy các nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường nhân tạo, trong điều kiện vô trùng [11]. Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa trên học thuyết về tính toàn năng của tế bào của nhà sinh lý thực vật người Đức Haberlandt vào cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20: “Mọi tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền (ADN) cần thiết và đủ của sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh”. Ngày nay các nhà khoa học đã chứng minh được khả năng tái sinh cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Trong nuôi cấy in vitro, quá trình phát sinh hình thái thực chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin. Tỷ lệ hàm lượng hai nhóm chất này trong môi trường khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái khác nhau. Khi trong môi trường nuôi cấy có tỷ lệ nồng độ auxin (đại diện là IAA)/cytokinin (đại diện là kinetin) thấp thì sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy theo hướng tạo chồi, khi tỷ lệ này cao mô nuôi cấy sẽ phát sinh hình thái theo hướng tạo rễ còn ở tỷ lệ cân đối sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo (callus) [10]. 1.3.2. Các bước tiến hành của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật Giai đoạn chuẩn bị: Là bước đầu tiên của quy trình nhân giống. Giai đoạn này gồm các khâu
9 như: chọn lọc cây mẹ để lấy mẫu, chọn cơ quan để lấy mẫu. Mô chọn để nuôi cấy thường là các mô có khả năng tái sinh cao trong ống nghiệm, sạch bệnh, giữ được các đặc tính quý của cây mẹ. Sau đó chọn chế độ khử trùng thích hợp làm sao để mẫu cấy bị nhiễm là thấp nhất, đồng thời khả năng sinh trưởng và phát triển vẫn tốt. Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các tác nhân hoá học có tính sát trùng mạnh như cồn 70%, HgCl2, NaOCl, Ca(ClO3)2, H2O2,... để khử trùng mẫu. Nồng độ chất khử trùng được chọn trên cơ sở thực tiễn thí nghiệm, theo nguyên tắc mô non nồng độ thấp, mô già nồng độ cao, có nhiều trường hợp phải phối hợp hai hay nhiều chất khử trùng với nhau. Cũng có thể bổ sung các chất kháng nấm và vi khuẩn vào môi trường nhằm tăng hiệu quả khử trùng. Thời gian khử trùng được xác định bằng thực nghiệm đối với từng loài cây hoặc mô nuôi cấy. Nhìn chung, mô non khử trùng trong thời gian ngắn, mô già trong thời gian dài hơn. Giai đoạn nuôi cấy khởi động: Là giai đoạn ta đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo thích hợp để tái sinh mô cấy. Môi trường này được xác lập cho từng loại cây, loại mô nuôi cấy. Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm hoặc virus sẽ được lưu giữ ở phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp. Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy ban đầu sẽ xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các phôi vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính. Đây sẽ là những vật liệu khởi đầu để cho quá trình nhân nhanh tiếp sau đó. Giai đoạn nhân nhanh: Một khi mẫu cấy sạch đã được tạo ra và từ đó nhận được các cụm chồi, các phôi vô tính sinh trưởng tốt, quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn nhân nhanh. Người ta cần thu được tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường đã được tối ưu hóa nhằm đạt được mục tiêu này.
10 Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi thường kéo dài trong khoảng 1-2 tháng tùy mỗi loại cây và nhìn chung cho cả giai đoạn nhân nhanh là vào khoảng 10 - 36 tháng. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh: Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh, nhưng thông thường các chồi này phải được cấy sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ, ở giai đoạn này phải tạo cây trong ống nghiệm phát triển cân đối về thân, lá, rễ để đạt tiêu chuẩn của một cây giống. Giai đoạn vườn ươm: Đây là giai đoạn đánh giá tính hiện thực của quá trình nhân giống in vitro khi chuyển cây từ điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra ngoài tự nhiên. Khi đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm, nhằm giảm đi hiện tượng “sốc” do thay đổi về điều kiện môi trường cần có giai đoạn thích nghi. Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây yêu cầu sự chăm sóc đặc biệt, do đó ở giai đoạn này cần chủ động để điều khiển được quá trình chiếu sáng, dinh dưỡng và giữ nước cũng như lựa chọn các giá thể thích hợp và trong điều kiện cách ly bệnh để các cây con đạt tỷ lệ sống cao. 1.4. Thành tựu nuôi cấy mô tế bào cây dƣợc liệu và Dây thìa canh Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trở thành một trong những phương thức quan trọng để nhân nhanh, đặc biệt là đối với những cây khó nhân nhanh bằng phương pháp truyền thống. Đã có nhiều nghiên cứu và ứng dụng thành công trong việc nhân nhanh và bảo tồn nguồn gen thực vật nói chung và nguồn gen cây thuốc nói riêng... 1.4.1. Nghiên cứu trong nước Những nghiên cứu của Trần Văn Minh và cộng sự (2003) cũng đã thành công trong việc nhân giống và bảo tồn nhiều loài cây quý hiếm như: Cây Trầm hương và cây Giá tỵ (Tectona grandis Linn F). Thành công trong việc nhân giống in vitro cây Trầm hương có ý nghĩa hết sức to lớn, nó cho phép phục hồi,
11 phát triển cho những khu vực trồng Trầm hương thuận lợi. Hơn thế nữa, việc sử dụng cây giống có nguồn gốc từ nuôi cấy mô có chất lượng cao sẽ giúp cho người trồng rừng Trầm hương tốt và đồng nhất về kiểu gen [7], [8]. Viện nghiên cứu và bảo tồn nguồn gen ở VQG Bạch Mã đã nghiên cứu thành công và bảo tồn một số loài quý hiếm có nguy cơ tuyệt chủng như: Cây Hồi hoa nhỏ (Illicium parvifolium Merr) là loài thực vật quý hiếm có trong sách đỏ Việt Nam, thuộc dạng nguy cấp. Đây là loài có giá trị trong sản xuất tinh dầu hồi, đã có chương trình khoanh vùng bảo vệ nghiêm ngặt những khu vực có sự phân bố của cây này theo hướng bảo tồn in situ ở VQG Bạch Mã [6]. Cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L) được sử dụng như là một vị thuốc trong việc phòng và chữa trị một số loại ung thư. Cây Trinh nữ hoàng cung có củ giống củ hành, chùm hoa giống chùm hoa cây láng trắng, thường được trồng làm cảnh hoặc làm thuốc. Trong lĩnh vực làm thuốc, người ta dùng lá cây Trinh nữ hoàng cung thái nhỏ rồi sao vàng sắc uống để đề phòng và chữa trị ung thư tử cung, u tiền liệt tuyến. Tác giả Lưu Trường Sinh và cộng sử (2005) đã nhân giống thành công cây Trinh nữ hoàng cung theo phương pháp in vitro có chất lượng tương đương với cây trồng theo phương pháp truyền thống [9]. Các tác giả Vũ Hoài Sâm và cộng sự (2014), nghiên cứu nhân giống invitro Dây thìa canh bằng nuôi cấy chồi đỉnh, các tác giả đã kết luận: Môi trường thích hợp cho tái sinh chồi là khoáng cơ bản MS bổ sung 30 g/l sucrose; 0,3 g/l than hoạt tính. Môi trường nhân nhanh chồi tối ưu là môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung 1,5 mg/l BA; 0,2 mg/l α-NAA; 30 g/l sucrose; 0,3 g/l than hoạt tính. Để tạo rễ, chồi tái sinh được nuôi cấy trong môi trường tạo rễ là môi trường khoáng cơ bản ½ MS bổ sung; 1mg/l α-NAA; 30 g/l sucrose; 0,3 mg/l than hoạt tính.