Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Định lượng đồng thời Amoxicillin và Cloxacillin trong viên nang Faclacin 2 bằng phương pháp phổ đạo hàm

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:63

Thêm vào BST

Báo xấu

22
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn xây dựng phép định lượng đồng thời hỗn hợp hai thành phần Amoxicillin và Cloxacillin bằng các phương pháp quang phổ tử ngoại lấy phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao làm phương pháp đối chiếu. Đồng thời ứng dụng các phương pháp này để định lượng Amoxicillin và Cloxacillin trong một số lô của chế phẩm Faclacin 2 của Công ty Cổ phần Dược phẩm Trung Ương I - Pharbaco.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Định lượng đồng thời Amoxicillin và Cloxacillin trong viên nang Faclacin 2 bằng phương pháp phổ đạo hàm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------------------- Vũ Tùng Lâm ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI AMOXICILLIN VÀ CLOXACILLIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP PHỔ ĐẠO HÀM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 1
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------------------- Vũ Tùng Lâm ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI AMOXICILLIN VÀ CLOXACILLIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP PHỔ ĐẠO HÀM Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.VŨ ĐẶNG HOÀNGAA TS. LÊ THỊ HỒNG HẢO A Hà Nội - 2014
LỜI CẢM ƠN Nhân dịp hoàn thành luận văn Thạc sĩ dƣợc học, tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn tới các thầy cô giáo, gia đình, bạn bè và những ngƣời đã giúp đỡ tôi trong thời gian qua. Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Vũ Đặng Hoàng ngƣời thầy kính mến đã hƣớng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Lê Thị Hồng Hảo - Viện Phó Viện Vệ Sinh An Toàn Thực Phẩm Quốc Gia, ngƣời đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong Bộ môn Hóa Phân Tích đã hết giúp quan tâm, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học, và các thầy cô giáo trường Khoa Học Tự Nhiên Hà Nội đã giảng dạy và tạo điều kiện tốt nhất cho quá trình học tập và nghiên cứu của tôi tại trƣờng. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới những ngƣời bạn đã luôn sát cánh, động viên tôi trong học tập cũng nhƣ trong cuộc sống. Và cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình thân yêu, những ngƣời đã luôn ở bên cạnh tôi trong suốt cuộc đời. Hà Nội, tháng 12 năm 2014 Học viên Vũ Tùng Lâm 1
MỤC LỤC Trang bìa Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình LỜI CẢM ƠN MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................3 1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG PHÂN TÍCH ..........................................3 1.1.1. Một số đặc điểm hóa lý của Amoxicillin trihydrat và Cloxacillin ...........3 1.1.2. Đặc điểm dƣợc động học và độc tính của Amoxicillin trihydrat và Cloxacillin [5] .....................................................................................................4 1.1.2.2. Cloxacilin [5]. ........................................................................................5 1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH. ...............................6 1.2.1. Các phƣơng pháp định lƣợng amoxicillin và cloxacillin trong chế phẩm6 1.2.2. Kết luận về các phƣơng pháp phân tích tham khảo. .................................7 1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP QUANG PHỔ ĐẠO HÀM (Derivative spectrophotometry)...........................................................................7 1.3.1. Khái niệm .................................................................................................7 1.3.2. Các phƣơng pháp định lƣợng hỗn hợp đa thành phần bằng quang phổ đạo hàm.............................................................................................................15 1.3.3. Phƣơng pháp đạo hàm giao điểm không (zero-crossing derivative spectrophotometry) ...........................................................................................16 1.3.4. Phƣơng pháp đạo hàm phổ tỷ số phổ (Ratio Spectra Derivative Spectrophotometry) ..........................................................................................17 1.3.5. Ứng dụng quang phổ đạo hàm trong định lƣợng thuốc đa thành phần ở Việt Nam...........................................................................................................19 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................22 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU. ....................................................................22 2.2. THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ..........................................................................22 ii
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ........................................................................23 2.3.1. Xây đựng phƣơng pháp định lƣợng đồng thời AMO và CLO bằng các phƣơng pháp quang phổ UV-VIS và sắc ký lỏng hiệu năng cao .....................23 2.3.2. Ứng dụng để định lƣợng đồng thời AMO và CLO trong viên nang Faclacin 2 ..........................................................................................................24 2.3.3. Xử lý kết quả thực nghiệm [3]................................................................24 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................25 3.1. PHƢƠNG PHÁP QUANG PHỔ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AMO VÀ CLO ......................................................................................................................25 3.1.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu .......................................................................25 3.1.2. Xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời Amo và Clo.......................26 3.1.3. Độ lặp của phƣơng pháp .........................................................................34 3.1.4. Độ đúng của các phƣơng pháp ...............................................................36 3.2. PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ...........................37 3.2.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu .......................................................................37 3.2.2. Kiểm tra lại phƣơng pháp sắc ký lỏng áp dụng tại Công ty Cổ phần Dƣợc phẩm Trung ƣơng 1 ................................................................................37 3.2.3. Khảo sát tính tích hợp của hệ thống. ......................................................41 3.2.4. Khảo sát độ lặp của phƣơng pháp ..........................................................42 3.2.5. Khảo sát độ đúng của phƣơng pháp .......................................................43 3.3. KẾT QUẢ PHÉP ĐỊNH LƢỢNG ..............................................................44 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .............................................................46 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................47 iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AMO : Amoxicilin CLO : Cloxacilin HPLC : Sắc ký lỏng hiệu nâng cao PĐH : Phổ đạo hàm PĐHTĐ : Phổ đạo hàm tỷ đối TLTK : Tài liệu tham khảo VKNTW : Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ƣơng iv
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số đặc điểm hoá lý của AMOXICILLIN TRIHYDRAT và CLOXACILLIN NATRI .............................................................................................3 Bảng 1.2. Ứng dụng quang phổ đạo hàm ở Việt Nam từ năm 1990 đến nay ...........20 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của CLO.................................................32 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của AMO. ..............................................33 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của các phƣơng pháp quang phổ UV-VIS. ...................................................................................................................................34 Bảng 3.6. Độ lặp của các phƣơng pháp quang phổ UV-VIS...........................................35 Bảng 3.7. Kết quả định lƣợng hỗn hợp mẫu tự tạo AMO 100mg/L và CLO 100mg/L bằng các phƣơng pháp quang phổ .............................................................................36 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của AMO 100mg/L. ...............................38 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của CLO 100 mg/L .................................39 Bảng 3.10. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính giữa diện tích pic với nồng độ của AMO và CLO ............................................................................................................40 Bảng 3.11. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký ............................41 Bảng 3.12. Độ lặp của phƣơng pháp HPLC ..............................................................42 Bảng 3.13. Kết quả định lƣợng hỗn hợp mẫu tự tạo bằng phƣơng pháp HPLC .......43 Bảng 3.14. Kết quả định lƣợng AMO trong viên nang FACLACIN 2 .....................44 Bảng 3.15. Kết quả định lƣợng CLO trong viên nang FACLACIN 2 ......................45 v
Danh môc c¸c h×nh Hình 1.1. Phổ hấp thụ và đạo hàm của dải phổ tuân theo định luật phân bố Gauss ...9 Hình 1.2. Phổ hấp thụ (a), phổ đạo hàm bậc 1 (b), phổ đạo hàm bậc 4 (c) (dải phổ của 2 chất có cùng vị trí và cùng độ cao nhƣng có độ rộng gấp đôi); phổ hấp thụ của trans – stillben trong cyclohexan (d) và phổ đạo hàm bậc 2 (e), bậc 4 (f) tƣơng ứng ...................................................................................................................................10 Hình 1.3. Ảnh hƣởng của tán xạ ánh sáng lên phổ hấp thụ và phổ đạo hàm bậc 1 [ 11 Hình 1.4. Phân biệt các dải phổ bằng phép toán đạo hàm ........................................12 Hình 1.5. Phƣơng pháp peak – zero (zn tỷ lệ với nồng độ của chất phân tích) ........13 Hình 1.6. Đạo hàm bậc 1 của lamivudin (1) 15µg/ml; (2) 20 µg/ml; (3) 30 µg/ml (đƣờng nét liền) và zidovudin (1) 30 µg/ml; (2) 50 µg/ml; (3) 75 µg/ml (đƣờng nét đứt) trong methanol. Mũi tên chỉ bƣớc sóng định lƣợng ..........................................16 Hình 1.7. (a) Phổ tỷ số phổ của acetaminophen tại các nồng độ (a) 5,0 µg/ml, (b) 17,5 µg/ml, (c) 25,0 µg/ml, (d) 37,5 µg/ml, (e) 50,0 µg/ml khi nồng độ của số chia (mephenoxalon) là 12,5 µg/ml trong methanol (Δλ = 4 nm). (b) Phổ đạo hàm tỷ số phổ bậc 1 của acetaminophen tại các nồng độ (a) 5,0 µg/ml, (b) 17,5 µg/ml, (c) 25,0 µg/ml, (d) 37,5 µg/ml, (e) 50,0 µg/ml khi nồng độ của số chia (mephenoxalon) là 12,5 µg/ml trong methanol (Δλ = 4 nm) ...............................................................18 Hình 3.8. Phổ hấp thụ của dung dịch AMO 100 mg/L, CLO 100 mg/L và hỗn hợp AMO 100 mg/L + CLO 100 mg/L ............................................................................26 Hình 3.9. PĐH bậc nhất của dung dịch AMO nồng độ (60 – 140 mg/L) .................28 Hình 3.10. PĐH bậc 2 của dung dịch CLO nồng độ (60 – 140 mg/L) .....................29 Hình 3.11. PĐHTĐ của dung dịch AMO nồng độ (60 – 140 mg/L) với số chia CLO 60 mg/L ............................................................................................................30 vi
Hình 3.12. PĐHTĐ của dung dịch CLO nồng độ (60-140 mg/L) với số chia AMO 60 mg/L .....................................................................................................................31 Hình 3.13. Phổ đạo hàm bậc nhất của CLO tại bƣớc sóng 258,7 nm .......................32 Hình 3.14. Phổ đạo hàm tỉ đối số chia AMO tại bƣớc sóng 258 nm ........................33 Hình 3.15. Sắc kí đồ tách 2 chất AMO 100 mg và CLO 100 mg .............................38 Hình 3.16. Khoảng tuyến tính của AMO từ 60 mg/L đến 140 mg/L. ......................39 Hình 3.17. Khoảng tuyến tính của AMO từ 60 mg/L đến 140 mg/L. ......................40 vii
MỞ ĐẦU Kháng sinh là nhóm thuốc đƣợc sử dụng nhiều nhất ở Việt Nam do mô hình bệnh tật của nƣớc ta chủ yếu vẫn là các bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm ký sinh trùng và nhiễm nấm. Do sự kháng thuốc của vi khuẩn và tính phức tạp của các bệnh nhiễm khuẩn ngày càng gia tăng, việc sử dụng kháng sinh đơn thành phần trong nhiều trƣờng hợp không còn đáp ứng đƣợc yêu cầu điều trị. Nhìn vào các đơn thuốc đƣợc kê hiện nay, phổ biến có đến 2-3 loại kháng sinh đƣợc sử dụng cùng lúc để tăng hiệu quả trong điều trị. Mặc dù vậy, việc phối hợp kháng sinh này có thể gặp phải một số tƣơng tác bất lợi gây ra những tai biến đáng tiếc và hiện tƣợng vi khuẩn kháng thuốc hết sức nguy hiểm. Amoxicillin và Cloxacillin là 2 kháng sinh thuộc nhóm Penicillin đƣợc sử dụng phổ biến hiện nay. Amoxicillin bền vững với dịch vị có khả năng hấp thu qua đƣờng tiêu hoá tốt nên kháng sinh nhóm Penicillin có hoạt phổ rộng này hay đƣợc sử dụng để điều trị nhiễm khuẩn toàn thân. Cloxacillin có tác dụng kháng penicillinase nên đƣợc chỉ định trong các bệnh do vi khuẩn gram dƣơng tiết ra penicillinase nhất là các liên cầu khuẩn [1]. Để nâng cao hiệu quả điều trị cũng nhƣ tạo điều kiện cho việc sử dụng thuốc thuận tiện, sự kết hợp Amoxicillin trihydrate và Cloxacillin Natri trong cùng một chế phẩm đã và đang đƣợc chỉ định cho các bệnh nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp, sinh dục tiết niệu, da và mô mềm, điều trị cấp cứu các nhiễm khuẩn có nguy cơ cao khi chờ đợi kết quả kháng sinh đồ. Tuy các thuốc có chứa đồng thời Amoxicillin và Cloxacillin đang lƣu hành rộng rãi trên thị trƣờng dƣới dạng viên nang nhƣng cho tới nay Dƣợc điển Việt Nam vẫn chƣa có chuyên luận riêng nào cho dạng chế phẩm này. Việc định lƣợng Amoxicillin và Cloxacillin trong viên nang đƣợc tiến hành chủ yếu bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao dựa vào các công trình nghiên cứu đã biết [2, 4, 21, 23, 30, 31]. Đây là kỹ thuật phân tích hiện đại, có khả năng định tính và định lƣợng 1
đồng thời các chất trong hỗn hợp với tính chọn lọc, độ nhạy, độ đúng và độ lặp cao; đặc biệt với khả năng tích hợp nhiều loại detector khác nhau nhƣ UV-VIS, khối phổ, huỳnh quang, điện hóa, HPLC cho phép phân tích đƣợc hầu hết các dƣợc chất. Tuy nhiên, khi số lƣợng mẫu lớn kỹ thuật này thƣờng đòi hỏi chi phí tốn kém (trang thiết bị, dung môi hóa chất) và thời gian phân tích kéo dài. Ngày nay với sự hỗ trợ của công nghệ tin học, các kỹ thuật quang phổ đƣợc ứng dụng nhiều trong công tác kiểm nghiệm thuốc. Trong số các kỹ thuật này, phƣơng pháp quang phổ đạo hàm và đạo hàm tỉ đối đƣợc biết đến với ƣu điểm nổi bật cho phép định lƣợng đồng thời và trực tiếp, không đòi hỏi quá trình tách chiết hoặc tinh chế đối với hỗn hợp đa thành phần, giúp giảm thiểu thời gian và chi phí [18, 22, 26]. Do vậy, nghiên cứu ứng dụng quang phổ để định lƣợng đồng thời các hoạt chất trong hỗn hợp đa thành phần sẽ góp phần giảm sự phụ thuộc vào HPLC trong kiểm nghiệm thƣờng qui. Cho tới nay, đây là hƣớng nghiên cứu còn ít đƣợc phát triển ở Việt Nam. Với mong muốn đề xuất một phƣơng pháp định lƣợng đồng thời hỗn hợp hai thành phần có khả năng ứng dụng trong công tác kiểm nghiệm thuốc, chúng tôi tiến hành đề tài “Định lƣợng đồng thời Amoxicillin và Cloxacillin trong viên nang Faclacin 2 bằng phƣơng pháp phổ đạo hàm” với hai mục tiêu sau: 1. Xây dựng phép định lƣợng đồng thời hỗn hợp hai thành phần Amoxicillin và Cloxacillin bằng các phƣơng pháp quang phổ tử ngoại lấy phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao làm phƣơng pháp đối chiếu. 2. Ứng dụng các phƣơng pháp này để định lƣợng Amoxicillin và Cloxacillin trong một số lô của chế phẩm Faclacin 2 của Công ty Cổ phần Dƣợc phẩm Trung Ƣơng I - Pharbaco. 2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG PHÂN TÍCH 1.1.1. Một số đặc điểm hóa lý của Amoxicillin trihydrat và Cloxacillin Một số đặc điểm hóa lý của Amoxicilin trihydrat và Cloxacillin đƣợc tóm tắt trong bảng 1.1: Bảng 1.1. Một số đặc điểm hoá lý của AMOXICILLIN TRIHYDRAT và CLOXACILLIN NATRI TL AMOXICILLIN TRIHYDRAT CLOXACILLIN NATRI TK C16H19O5S. 3H2O (M = 419,4) C19H17ClN3NaO5 S. H2O (M = 475,9) Công thức [4] Hóa học .3H2O Tên Acid (6R)-6-(α-D-4 Natri ((6R)-6-3-(2-clorophenyl)-5- [4] khoa hydroxyphenylglycylamino) methylisoxazol-4-carboxamido) học penicilanic trihydrat. penicilat monohydrat. Bột kết tinh màu trắng dạng tinh thể, Bột kết tinh màu trắng, hoặc gần vị đắng. trắng, có mùi, vị đắng, dễ hút ẩm. Tính Khó tan trong nƣớc (1g/370mL), Dễ tan trong nƣớc, methanol. Tan chất [2, alcol (1g/2000mL); thực tế không trong ethanol. Không tan trong hóa, 4] tan trong ether, cloroform, dầu; tan ethylacetat. lý trong các dung dịch acid hoặc pH (dung dịch nƣớc) = 5,0  7,0 hydroxyd kiềm loãng (do là một acid 3
TL AMOXICILLIN TRIHYDRAT CLOXACILLIN NATRI TK amin). Bị phân huỷ ở độ ẩm cao và nhiệt độ trên 370C pH (dung dịch nƣớc) = 3,5  5,5 1.1.2. Đặc điểm dƣợc động học và độc tính của Amoxicillin trihydrat và Cloxacillin [5] 1.1.2.1. Amoxicilin a. Dƣợc động học của Amoxicilin. - Amoxicilin bền vững trong môi trƣờng acid dịch vị. Hấp thu không bị ảnh hƣởng bởi thức ăn, nhanh và hoàn toàn hơn qua đƣờng tiêu hóa so với ampicilin. Khi uống cùng liều lƣợng nhƣ ampicilin, nồng độ đỉnh amoxicilin trong huyết tƣơng cao hơn ít nhất 2 lần. Amoxicilin phân bố nhanh vào hầu hết các mô và dịch trong cơ thể, trừ mô não và dịch não tủy, nhƣng khi màng não bị viêm thì amoxicilin lại khuếch tán vào dễ dàng. Sau khi uống liều 250 mg amoxicilin 1 - 2 giờ, nồng độ amoxicilin trong máu đạt khoảng 4 - 5 microgam/ml, khi uống 500 mg, nồng độ amoxicilin đạt khoảng 8 - 10 microgam/ml. Tăng liều gấp đôi có thể làm nồng độ thuốc trong máu tăng gấp đôi. Amoxicilin uống hay tiêm đều cho những nồng độ thuốc nhƣ nhau trong huyết tƣơng. Nửa đời của amoxicilin khoảng 61,3 phút, dài hơn ở trẻ sơ sinh, và ngƣời cao tuổi. ở ngƣời suy thận, nửa đời của thuốc dài khoảng 7 - 20 giờ. - Khoảng 60% liều uống amoxicilin thải nguyên dạng ra nƣớc tiểu trong vòng 6 - 8 giờ. Probenecid kéo dài thời gian thải của amoxicilin qua đƣờng thận. Amoxicilin có nồng độ cao trong dịch mật và một phần thải qua phân. 4
b. Tính độc tính của Amoxicilin - Bệnh nhân đƣợc điều trị bằng Amoxicillin có thể gặp các hiện tƣợng nhƣ các phản ứng quá mẫn trầm trọng ở những ngƣời bệnh có tiền sử dị ứng với penicilin hoặc các dị nguyên khác, nên cần phải điều tra kỹ tiền sử dị ứng với penicilin, cephalosporin và các dị nguyên khác. - Nếu phản ứng dị ứng xảy ra nhƣ ban đỏ, phù Quincke, sốc phản vệ, hội chứng Stevens - Johnson, phải ngừng liệu pháp amoxicilin và ngay lập tức điều trị cấp cứu bằng adrenalin, thở oxy, liệu pháp corticoid tiêm tĩnh mạch và thông khí, kể cả đặt nội khí quản và không bao giờ đƣợc điều trị bằng penicilin hoặc cephalosporin nữa. 1.1.2.2. Cloxacilin [5]. a. Dƣợc động học của Cloxacilin - Cloxacilin là kháng sinh diệt khuẩn, ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn nhƣ benzylpenicilin, nhƣng kháng penicilinase của Staphylococcus. Vì vậy thuốc có hoạt tính chống Staphylococcus sinh hoặc không sinh penicilinase với nồng độ tối thiểu ức chế khoảng 0,25 - 0,5 microgam/ml. Nhƣng cloxacilin không có hoạt tính với Staphylococcus aureus kháng methicilin (MRSA) do vi khuẩn này có những protein gắn penicilin (PBP) biến đổi. Hoạt tính đối với Strepxococcus nhƣ Strepxococcus pneumoniae và Strepxococcus pyogenes thấp hơn benzylpenicilin, nhƣng thƣờng đủ tác dụng khi các vi khuẩn này cùng có mặt với Staphylococcus kháng penicilin. Cloxacilin không có hiệu lực với Enterococcus faecalis. b. Tính độc tính của Cloxacilin - Tác dụng không mong muốn thƣờng gặp nhất là phản ứng quá mẫn, đặc biệt là ban da, đôi khi có phản vệ. Ngƣời suy thận cũng có nguy cơ cao.Tác dụng không mong muốn thƣờng xảy ra là phát ban (khoảng 4% ngƣời bệnh tiêm cloxacilin). Ðối với ngƣời bệnh uống cloxacilin, các tác dụng không mong muốn thƣờng gặp là các triệu chứng tiêu hóa phụ thuộc theo liều uống. 5
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH. 1.2.1. Các phƣơng pháp định lƣợng amoxicillin và cloxacillin trong chế phẩm Để định lƣợng Amoxicillin và Cloxacillin trong các chế phẩm đơn thành phần, phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao thƣờng đƣợc sử dụng hiện nay tại Việt Nam. Theo qui định của các dƣợc điển quốc tế, các hoạt chất này đƣợc tách ra khỏi nền mẫu bằng cột pha đảo cột C18 và phát hiện bằng detector tử ngoại tại bƣớc sóng 254 nm (cho amoxicillin) và 225 nm (cho cloxacillin) [8, 19, 20]. Để định lƣợng amoxicillin, thành phần pha động đƣợc sử dụng gồm có MeOH: dd NaCH3COO 0,01M (5:95) [31], acetonitril: dd KH2PO4 45% w/w (4:96) [31]; hoặc acetonitril: dd KH2PO4 0,05M pH 5,0 (1:99) [22]. Để định lƣợng cloxacillin, thành phần pha động đƣợc sử dụng gồm có acetonitril: dd KH2PO4 0.05 M pH 5,0 (1:96) [29], acetonitril: dd KH2PO4 0,02M pH 6,8 (20:80) [31]; hoặc acetonitril: dd KH2PO4 2,7 g/L, pH 5,0 (25:75) [22]. Ngoài ra, có thể định lƣợng amoxicillin trong chế phẩm bằng phép chuẩn độ đo thế. Theo phƣơng pháp này, hàm lƣợng phần trăm của amoxicillin đƣợc tính bằng hàm lƣợng phần trăm của penicillin toàn phần trừ đi hàm lƣợng phần trăm của sản phẩm phân huỷ. Chế phẩm đƣợc hòa tan vào dung dịch đệm boric pH 9,0 và anhydrid acetic, trƣớc khi tiến hành phản ứng thuỷ phân trong môi trƣờng kiềm và chuẩn độ bằng bằng Hg(NO)2 0,02M trong môi trƣờng đệm acetate pH 4,6. Điểm kết thúc của chuẩn độ đo thế đƣợc xác định với điện cực so sánh là điện cực thuỷ ngân - thuỷ ngân (I) sulfat; điện cực chỉ thị là điện cực platin (hoặc điện cực thuỷ ngân) [2,4]. Amoxicillin cũng có thể định lƣợng bằng phép đo iod sau phản ứng thủy phân trong môi trƣờng kiểm. Sản phẩm phân hủy của amoxicillin đƣợc phản ứng với iod dƣ. Định lƣợng iod dƣ bằng NaS2O3 0,01N với chỉ thị hồ tinh bột cho vào thời điểm gần kết thúc định lƣợng [4]. Hàm lƣợng cloxacillin trong chế phẩm có thể định lƣợng bằng phƣơng pháp vi sinh dựa vào mối quan hệ đƣờng kính vòng vô khuẩn của mẫu thử và mẫu chuẩn 6
tỷ lệ thuận với lƣợng cloxacillin tƣơng ứng có trong mẫu. Phƣơng pháp này sử dụng chủng chỉ thị: Bacillus subtilis ATCC 6633 [30]. 1.2.2. Kết luận về các phƣơng pháp phân tích tham khảo. Qua phân tích tài liệu tham khảo, phƣơng pháp HPLC thƣờng đƣợc triển khai cho công tác kiểm nghiệm thƣờng qui chế phẩm đơn thành phần amoxicillin và cloxacillin. Cho tới nay, chƣa có phƣơng pháp nào đƣợc công bố để định lƣợng đồng thời amoxicillin và cloxacillin trong hỗn hợp. Có thể nhận thấy, phƣơng pháp HPLC thƣờng dùng dung môi hữu cơ có độc tính là acetonitril; chi phí kiểm nghiệm thuốc sẽ tăng khi số lƣợng mẫu phân tích lớn. Ngoài ra phƣơng pháp này cũng đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền và thời gian phân tích mẫu kéo dài. Do vậy, nghiên cứu này đƣợc tiến hành nhằm xây dựng một phƣơng pháp quang phổ tiến kiệm dung môi hóa chất, thời gian phân tích có khả năng thay thế HPLC trong công tác kiểm nghiệm. 1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP QUANG PHỔ ĐẠO HÀM (Derivative spectrophotometry) 1.3.1. Khái niệm Quang phổ đạo hàm là kỹ thuật phân tích đƣợc Giese và French giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1955 [20]. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc sử dụng thuật toán lấy đạo hàm phổ hấp thụ nhằm thu đƣợc nhiều hơn các thông tin định tính, định lƣợng đối với các dải phổ không đƣợc phân tách hoàn toàn. Phép lấy đạo hàm một đƣờng cong hay hàm toán học của đƣờng cong về bản chất là sự ƣớc lƣợng độ dốc tại mỗi điểm trên đƣờng cong khảo sát. Trong phƣơng pháp quang phổ UV-VIS, mối quan hệ giữa khả năng hấp thụ ánh sáng và nồng độ của một dung dịch đƣợc miêu tả qua biểu thức toán học của định luật Bouguer – Lambert – Beer: 7
(1) (2) : nồng độ của chất hấp thụ (mol/l) : cƣờng độ của ánh sáng sau khi đi : độ dài quang học (cm) qua chất hấp thụ : độ hấp thụ phân tử của chất hấp thụ tại : cƣờng độ ánh sáng tới ( bƣớc súng không đổi). : độ hấp thụ. : độ truyền qua. Thực tế, trong quang phổ đạo hàm A thƣờng đƣợc dùng nhiều hơn T do khi tăng bậc đạo hàm (n) mối tƣơng quan tuyến tính giữa đạo hàm T và nồng độ C chỉ có đƣợc trong các điều kiện đặc biệt trong khi giá trị đạo hàm của A luôn tỷ lệ với C dù n vô cùng lớn (phƣơng trình (3)). Đạo hàm bậc n của A: (3) 8
Hình 1.1. Phổ hấp thụ và đạo hàm của dải phổ tuân theo định luật phân bố Gauss [3] Hình 1.1 biểu diễn phổ hấp thụ và các phổ đạo hàm tƣơng ứng của một dải phổ tuân theo định luật phân bố Gauss. Theo tính chất của đạo hàm, ta có thể nhận thấy: - Các cực trị ở đạo hàm bậc n sẽ có giá trị 0 tại đạo hàm bậc n + 1 còn các điểm uốn ở đạo hàm bậc n lại trở thành cực trị ở đạo hàm bậc kế tiếp. Do đó, xuất phát từ 1 peak ban đầu sau n lần đạo hàm sẽ cho n cực trị mới đƣợc gọi là cực trị ảo (virtual extrema) hay các vệ tinh (satellites). 9
- Sự xuất hiện của các cực trị ảo này sẽ làm tăng khả năng phân tích phổ hấp thụ ban đầu. Hình 1.2 minh họa cho sự chuyển dạng từ phổ UV – VIS sang phổ đạo hàm cho thấy thông tin thu đƣợc trên phổ đạo hàm nhiều hơn phổ hấp thụ ban đầu (số cực trị tăng khi số bậc đạo hàm tăng) có thể ứng dụng đƣợc trong phân tích định tính. Hình 1.2. Phổ hấp thụ (a), phổ đạo hàm bậc 1 (b), phổ đạo hàm bậc 4 (c) (dải phổ của 2 chất có cùng vị trí và cùng độ cao nhƣng có độ rộng gấp đôi); phổ hấp thụ của trans – stillben trong cyclohexan (d) và phổ đạo hàm bậc 2 (e), bậc 4 (f) tƣơng ứng [29] - Khi tăng bậc đạo hàm, độ nhọn của các dải phổ tăng lên tuy nhiên tín hiệu đạo hàm giảm và độ rộng của các dải phổ thu hẹp lại. Đáng chú ý, khi tăng n tỷ số tín hiệu – nhiễu (signal to noise ratio) lại giảm đặc biệt với các peak tù. Chính vì vậy, để ứng dụng quang phổ đạo hàm trong phân tích, phải cân nhắc giữa thuận lợi và khó khăn để lựa chọn đƣợc bậc đạo hàm thích hợp. 10
Một trong những ƣu điểm nổi bật của quang phổ đạo hàm là có thể loại bỏ đƣợc hiện tƣợng trôi nền gây bởi sự không ổn định của trang thiết bị hoặc thao tác và giảm ảnh hƣởng của tán xạ ánh sáng khi các tiểu phân nhỏ xuất hiện trong mẫu, qua đó cải thiện độ chính xác của phép định lƣợng (hình 1.3). Khi bậc đạo hàm tăng, cƣờng độ tín hiệu của các dải phổ rộng sẽ giảm nhiều so với các dải phổ hẹp. Do vậy việc định lƣợng các dải phổ hẹp sẽ chính xác hơn (hình 1.4). Điều này cũng đƣợc ứng dụng để giảm thiểu sai số trong trƣờng hợp tán xạ ánh sáng hoặc nhiễu nền do tia sáng lạc gây ra đối với các mẫu đục Hình 1.3. Ảnh hƣởng của tán xạ ánh sáng lên phổ hấp thụ và phổ đạo hàm bậc 1 [25] 11