Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu tinh sạch protein p53 tái tổ hợp từ chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 và ảnh hưởng của nó đến tế bào ung thư nuôi cấy

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:58

Thêm vào BST

Báo xấu

39
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là kiểm nghiệm các điều kiện nuôi cấy nấm men Pichia pastoris X33-36 đã được tối ưu hóa biểu hiện trong nghiên cứu trước đây; tối ưu hóa quá trình tinh sạch sản phẩm protein p53 tái tổ hợp nhằm tạo ra một lượng protein p53 tái tổ hợp có độ tinh sạch cao và đủ lớn cho thử nghiệm ở mức độ tế bào và cao hơn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu tinh sạch protein p53 tái tổ hợp từ chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 và ảnh hưởng của nó đến tế bào ung thư nuôi cấy

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Quang Hòa NGHIÊN CỨU TINH SẠCH PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33-36 VÀ ẢNH HƯỞNG CỦ A NÓ ĐẾN TẾ BÀ O UNG THƯ NUÔI CẤY LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2020
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Quang Hòa NGHIÊN CỨU TINH SẠCH PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33-36 VÀ ẢNH HƯỞNG CỦ A NÓ ĐẾN TẾ BÀ O UNG THƯ NUÔI CẤY Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 8420101.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Đinh Nho Thái Hà Nội - 2020
LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Đinh Nho Thái đã trực tiếp giảng dạy, hướng dẫn và giúp đỡ tận tình cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là các thầy, cô trong Bộ môn Di truyền học đã truyền đạt cho tôi những tri thức quý báu trong thời gian tôi học tập và nghiên cứu tại trường. Đồng thời tôi cũng xin cảm ơn ThS. Bùi Thị Vân Khánh đã hướng dẫn tôi trong quá trình làm thí nghiệm nuôi cấy tế bào và thử nghiệm độc tính trên tế bào. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô thuộc Phòng thí nghiệm Môi trường Đất, Khoa Môi Trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã cho phép sử dụng thiết bị trong nuôi cấy vi sinh. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các học viên cao học và các em sinh viên trong Bộ môn Di truyền học cùng các cán bộ và các em sinh viên trong Phòng Protein tái tổ hợp, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein đã nhiệt tình hỗ trợ tôi rất nhiều trong thời gian làm việc tại phòng thí nghiệm. Lời cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã nhiệt tình động viên, chia sẻ kinh nghiệm và ủng hộ tôi hoàn thành tốt nhất đề tài nghiên cứu này. Hà Nội, ngày 15 tháng 02 năm 2020 Học viên Nguyễn Quang Hòa 1
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AIDS Acquired immuno deficiency syndrome BMMY Buffered methanol complex medium Bps Base pairs CI 24 Chloroform : 1 isopropanol DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxy ribonucleotide triphosphates EtBr Ethidium bromide FBS Fetal bovine serum HBV Hepatitis B virus HIV Human immunodeficiency virus HPV Human papilloma virus kDa Kilo Daltons NST Nhiễm sắc thể PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase chain reaction PMS Phenazine methyl sulfate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis TAE Tris base-acetic-EDTA TBE Tris base-axit boric-EDTA WHO World Health Organization YPD Yeast extract-peptone-dextrose medium
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 1. Tổng quan về tình hình ung thư hiện nay trên thế giới và Việt Nam .................................................................................................................... 3 1.1. Tình hình ung thư trên thế giới ........................................................ 3 1.2. Tình hình ung thư ở Việt Nam ......................................................... 3 1.3. Các nguyên nhân gây ung thư .......................................................... 4 1.4. Các biện pháp phòng ngừa bệnh ung thư ......................................... 4 2. Tổng quan về gen TP53 và protein p53 .................................................. 5 2.1. Cấu trúc của gen TP53 và protein p53 ............................................. 5 2.2. Cấu trúc không gian của protein p53 ............................................... 6 2.3. Các trình tự nhận biết đặc hiệu của protein p53 với gen mục tiêu .... 7 2.4. Chức năng của protein p53 .............................................................. 8 2.5. Cơ chế protein p53 gây nên apoptosis và ảnh hưởng đến sự ức chế tế bào khối u ..................................................................................................... 9 2.6. Tổng quan về các nghiên cứu biểu hiện protein cho liệu pháp điều trị đích trong ung thư ........................................................................................... 11 2.6.1. Liệu pháp điều trị ung thư dựa vào protein p53 ....................... 13 3. Nghiên cứu biểu hiện protein p53 trong nấm men trên thế giới và ở Việt Nam ................................................................................................................... 13 4. Vector pPicZαA-TAT-p53-his và cơ chế thử nghiệm protein p53 tái tổ hợp trên mức độ tế bào ....................................................................................... 14 i
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 16 2.1. Vật liệu và hóa chất .......................................................................... 16 2.1.1. Vật liệu ................................................................................... 16 2.1.2. Hóa chất .................................................................................. 18 2.1.3. Các dung dịch và đệm ............................................................. 18 2.1.4. Thiết bị dùng trong nghiên cứu................................................ 19 2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................. 20 2.2.1. Kiểm tra chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 và nuôi biểu hiện thu sinh khối protein p53 tái tổ hợp ...................................................... 20 2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số của nấm men ................ 20 2.2.3. Phương pháp điện di DNA trên gel Agarose ............................ 21 2.2.4. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide (SDS- PAGE) ......................................................................................................... 22 2.2.5. Phương pháp sắc ký ái lực ....................................................... 23 2.2.6. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford ..................... 24 2.2.7. Phương pháp nuôi cấy tế bào ung thư trong điều kiện in vitro . 25 2.2.8. Phương pháp kiểm tra sự ảnh hưởng của dung dịch P lên tế bào ung thư trong điều kiện in vitro.................................................................... 25 2.2.9. Phương pháp thử độc tính tế bào MTS (3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) ....... 25 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 29 3.1. Kết quả nuôi biểu hiện protein p53 trong nấm men Pichia pastoris X33-36. .............................................................................................................. 29 ii
3.1.1. Kết quả kiểm tra gen TAT-p53-His chứa trong hệ gen nấm men Pichia pastoris X33-36 ................................................................................ 29 3.1.2. Kết quả nuôi biểu hiện chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 .................................................................................................................... 30 3.1.3. Kết quả điện di dịch nuôi biểu hiện thô và sau khi tinh sạch .... 31 3.1.4. Kết quả định lượng protein bằng phương pháp Bradford ......... 33 3.2. Kết quả nuôi tế bào ung thư in vitro .................................................. 35 3.2.1. Kết quả kiểm tra khả năng ảnh hưởng của môi trường pha thuốc tới tế bào ung thư nuôi cấy........................................................................... 36 3.2.2. Kết quả thử độc tính tế bào và khả năng ức chế tăng trưởng tế bào ung thư với thuốc thử là protein p53 tái tổ hợp ...................................... 38 KẾT LUẬN .......................................................................................................... 42 KIẾN NGHỊ ......................................................................................................... 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 43 PHỤ LỤC ............................................................................................................... 1 iii
DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cấu trúc của protein p53 ở người ................................................................ 5 Hình 2. Cấu trúc phân tử của protein p53................................................................. 7 Hình 3: Các khảo sát nghiên cứu protein p53 từ 319 nghiên cứu độc lập. ................ 8 Hình 4: Điều chỉnh mức độ biểu hiện của protein p53 trong tế bào bị tác động bất lợi và bình thường. ................................................................................................ 10 Hình 5: Hai con đường phổ biến nhất dẫn tới apoptosis [3]. .................................. 11 Hình 6: Cấu trúc vector pPicZαA-TAT-p53-his. .................................................... 15 Hình 7: Tế bào HeLa dưới kính hiểm vi soi ngược Axiovert 40 CFL..................... 17 Hình 8: Tế bào KMS-20 dưới kính hiểm vi soi ngược Axiovert 40 CFL ................ 17 Hình 9: Cấu trúc hóa học của muối MTS và sản phẩm Formazan .......................... 26 Hình 10: Hình ảnh điện di kết quả kiểm tra gen bằng phản ứng PCR ..................... 29 Hình 11: Đường sinh trưởng của chủng nấm men Pichia pastoris X33-36 mang đi nuôi biểu hiện ........................................................................................................ 30 Hình 12. Kết quả điện di SDS-PAGE sản phẩm protein tinh sạch .......................... 31 Hình 13: Kết quả điện di SDS-PAGE sản phẩm tinh sạch protein p53 ở các nồng độ Imidazol khác nhau. .............................................................................................. 32 Hình 14: Kết quả điện di SDS-PAGE sản phẩm protein thu được và sau tinh sạch ở 2 điều kiện pH 6.0 và 8.0 ....................................................................................... 33 Hình 15. Đường chuẩn Bradford............................................................................ 34 Hình 16: Tế bào HeLa (A) và tế bào KMS-20 (B) sau 48h nuôi cấy in vitro (VK10, room 5.6) ............................................................................................................... 36 iv
Hình 17: Tế bào HeLa trong điều kiện có môi trường pha mẫu P và không có môi trường pha mẫu P soi dưới kính hiển vi (VK10, room 5.6) .................................... 37 Hình 18: Tế bào KMS-20 trong điều kiện có môi trường pha mẫu P và không có môi trường pha mẫu P soi dưới kính hiển vi (VK10, room 5.6) ............................. 37 Hình 19: Hình thái tế bào HeLa sau 48h ủ với chế phẩm p53 với các nồng độ thử nghiệm khác nhau (VK10, room 5.6) ..................................................................... 38 Hình 20: Hình thái tế bào KMS-20 sau 48h ủ với chế phẩm p53-his với các nồng độ thử nghiệm khác nhau (VK10, room 5.6) .......................................................... 39 Hình 21: Dải màu sau khi thêm MTS vào dòng tế bào KMS-20 sau khi thử hoạt tính của protein p53 tái tổ hợp ...................................................................................... 40 Hình 22: Biểu đồ mối tương quan giữa logarit nồng độ chất thử và chỉ số tăng sinh A% ........................................................................................................................ 41 v
DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm Bảng 2: Thành phần các dung dịch, đệm và môi trường nuôi cấy Bảng 3: Thành phần gel polyacrylamide 12% Bảng 4: Thành phần của phản ứng Bradford Bảng 5: Dải nồng độ thuốc sử dụng trong thử nghiệm Bảng 6: Quy trình tiến hành thí nghiệm MTS Bảng 7: Kết quả đo OD595 nm dựng đường chuẩn Bảng 8: Kết quả Bradford của quá trình tinh sạch Bảng 9: Kết quả đo OD490 nm với dòng tế bào KMS-20 thử nghiệm thuốc vi
MỞ ĐẦU Ung thư là tên bệnh dùng chung để mô tả một nhóm các bệnh phản ảnh những sự thay đổi về sinh sản, tăng trưởng và chức năng của tế bào không kiểm soát. Khi ung thư phát triển, tế bào bị phân chia mất kiểm soát và hình thành khối u gây chèn ép lên các mô, cơ quan bên cạnh. Khối u có thể là lành tính hay ác tính trong đó các khối u ác tính có khả năng di căn sang các phần khác của cơ thể thông qua máu hoặc hệ bạch huyết. Trong khi đó khối u lành tính lại không di căn đồng thời sau khi loại bỏ chúng thường sẽ không phát triển trở lại và ít gây nguy hiểm cho người. Loại bỏ khối u ác tính cần phải sử dụng phương pháp phức tạp hơn như thường được điều trị bởi sự kết hợp của các phương pháp như phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, miễn dịch, hormone, hoặc điều trị đích. Ở Việt Nam, số ca mắc bệnh ung thư ngày một tăng, xuất hiện ở mọi lứa tuổi, ngành nghề. Nguyên nhân mắc bệnh có thể do các tác nhân như vật lý, hóa học, sinh học,… Thường khi phát hiện bệnh thì bệnh đã ở tình trạng nặng gây khó khăn và tốn kém trong chữa trị. Trong khi đó các liệu pháp như hóa trị hay xạ trị chi phí điều trị cao, gây nhiều tác dụng phụ ảnh hưởng đến sức khỏe bệnh nhân trong và sau điều trị, với tỉ lệ thành công thấp. Vì thế, vấn đề cấp thiết hiện nay là tìm ra một giải pháp điều trị ung thư hiệu quả, ít tốn kém và hạn chế gây ra tác dụng phụ. Trước tình hình thực tế hiện nay, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã và đang nghiên cứu các phương pháp điều trị đích – Tiêu diệt hoặc ức chế tế bào ung thư mà không làm ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào bình thường khác. Trong đó protein p53 cũng được lựa chọn dựa vào những chức năng của nó như kiểm soát chu trình tế bào, sửa chữa DNA và kích hoạt quá trình apoptosis. Protein p53 tái tổ hợp cũng được báo cáo là có hoạt tính sinh học trong việc ức chế khối u [31]. Tuy vậy, ở Việt Nam phương pháp điều trị đích chưa được ứng dụng mạnh mẽ đồng thời chưa có nghiên cứu nào ở Việt Nam báo cáo về việc sử dụng protein p53 ngoại lai như là một phương pháp điều trị đích đối với tế bào ung thư. Từ những lý do trên, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu tinh sa ̣ch protein p53 tái tổ hợp từ chủng nấ m men Pichia pastoris 1
X33-36 và ảnh hưởng của nó đế n tế bào ung thư nuôi cấy” nhằm nghiên cứu tăng cường độ tinh sạch và bước đầu kiểm tra khả năng tác động ức chế của protein p53 tái tổ hợp lên sự phát triển của tế bào ung thư, là cơ sở cho các thử nghiệm ở mức độ cao hơn như ở các cấp độ mô và cơ thể. Mục tiêu nghiên cứu:  Kiểm nghiệm các điều kiện nuôi cấy nấ m men Pichia pastoris X33-36 đã được tối ưu hóa biểu hiện trong nghiên cứu trước đây.  Tối ưu hóa quá trình tinh sạch sản phẩm protein p53 tái tổ hợp nhằm tạo ra một lượng protein p53 tái tổ hợp có độ tinh sạch cao và đủ lớn cho thử nghiệm ở mức độ tế bào và cao hơn. 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về tình hình ung thư hiện nay trên thế giới và Việt Nam 1.1. Tình hình ung thư trên thế giới Ung thư là một trong những nguyên nhân tử vong hàng đầu trên toàn thế giới, với khoảng 18,1 triệu trường hợp mới vào năm 2018. Số ca tử vong do ung thư lên đến 9,6 triệu người, chiếm gần 1/6 các ca tử vong. Trong cả hai giới, số ca mắc bệnh do ung thư phổi chiếm tỷ lệ lớn nhất chiếm 11,6% trong tổng số ca và chiếm 18,4% trong tổng số ca tử vong do ung thư. Theo sau đó là ung thư vú ở nữ với 11,6% số ca mắc, ung thư tuyến tiền liệt với 7,1%...[10]. Đa số các ca mắc bệnh thường được chuẩn đoán ở giai đoạn cuối khi mà không thể can thiệp và điều trị được nữa. Khoảng 70% số ca tử vong do ung thư xảy ra ở các nước có thu nhập thấp và trung bình. Năm 2017, chỉ có 26% các quốc gia có thu nhập thấp báo cáo có dịch vụ khám bệnh công cộng trong khi ở các nước có thu nhập cao là 90%. Áp lực của ung thư đến nền kinh tế là vô cùng đáng kể và đang ngày một gia tăng. Tổng kinh phí hàng năm chi trả cho điều trị trong năm 2010 ước tính khoảng 1,16 nghìn tỉ USD [26]. Dù vậy cũng chỉ có 1 trong 5 nước có thu nhập thấp và trung bình có những dữ liệu cần thiết để thúc đẩy các chính sách phòng chống ung thư. 1.2. Tình hình ung thư ở Việt Nam Năm 2018, theo dữ liệu từ cơ quan nghiên cứu quốc tế về ung thư (IARC). Ở Việt Nam, số ca được chuẩn đoán mắc bệnh ung thư mới là 164 671người ( không tính du học sinh ), và 114 871 theo số liệu ước tính từ hệ thống ghi nhận ung thư từ 6 tỉnh, thành phố năm 2010. Dự báo vào năm 2020 sẽ có ít nhất 189 344 ca ung thư mới mắc. Trong số ca ung thư, 5 loại ung thư hàng đầu ở nam giới Việt Nam là ung thư gan (21,5%), phổi (18,4%), dạ dày (12,3%), đại trực tràng (8,4%) và vòm họng (5,0%) và ở phụ nữ là ung thư vú (20,6%), đại trực tràng (9,6%), phổi (9,4%), dạ dày (8,6%) ) và gan (7,8%). Tỷ lệ bệnh nhân ung thư đến khám và điều trị sớm còn thấp, năm 2009 một nghiên cứu tại 5 bệnh viện ung thư cho thấy chung các loại ung thư 28,6% bệnh nhân đến giai đoạn I và II, đối với ung thư vú 50,5% đến sớm, ung thư cổ tử cung 46,0% đến sớm và ung thư đại trực tràng 32,2% đến sớm Số người chết vì ung thư trên năm là 94 700 người [26]. 3
Dự án phòng chống ung thư là một dự án trong Chương trình mục tiêu quốc gia phòng, chống một số bệnh xã hội, bệnh dịch nguy hiểm và HIV/AIDS giai đoạn 2006-2010, được Thủ tướng Chính phủ phê duyệt ngày 17/7/2007 tại quyết định số 108/2007/QĐ-TTG. Mục tiêu của dự án là từng bước giảm tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết do ung thư và cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân ung thư. Giai đoạn 2012-2015 mục tiêu khiêm tốn hơn, cụ thể là nâng cao nhận thức của cộng đồng về phòng và phát hiện sớm bệnh ung thư và tăng 10-15% tỷ lệ bệnh nhân ung thư được phát hiện ở giai đoạn sớm, đồng thời giảm tỷ lệ tử vong của một số loại ung thư: vú, cổ tử cung, khoang miệng và đại trực tràng [35] 1.3. Các nguyên nhân gây ung thư Ung thư xảy ra do nhiều nguyên nhân khác nhau. Là quá trình chuyển đổi từ tế bào bình thường thành tế bào khối u bằng một chuỗi các quá trình biến đổi sinh hóa khác nhau, thường phát triển từ các tổn thương tiền ung thư cho đến ung thư ác tính. Những thay đổi này là do sự tương tác giữa các yếu tố di truyền của một người với các tác nhân bên ngoài như: tác nhân vật lý với tia cực tím, bức xạ ion; tác nhân hóa học như khói thuốc lá, aflatoxin, arsenic; và các tác nhân sinh học do nhiễm vi khuẩn, virus. Tuổi tác cũng là nguyên nhân cơ bản cho sự phát triển ung thư. Tỷ lệ mắc bệnh ung thư tăng đáng kể theo độ tuổi. Khoảng 1/3 số ca tử vong do ung thư do lối sống và chế độ ăn uống với: các chỉ số trong cơ thể tăng cao bất thường, ăn ít trái cây và rau quả, thiếu hoạt động thể lực, sử dụng thuốc lá và rượu. Trong đó sử dụng thuốc lá là yếu tố gây nguy cơ cao nhất đến ung thư với khoảng 22% số ca tử vong do ung thư [12]. Ung thư cũng có thể do vi khuẩn hoặc virus ví dụ HPV gây ung thư cổ tử cung với khoảng 25% số ca ở các nước có thu nhập thấp và trung bình [23]. 1.4. Các biện pháp phòng ngừa bệnh ung thư Từ các nguyên nhân kể trên, các biện pháp làm giảm nguy cơ mắc bệnh ung thư bao gồm: tránh các tác nhân có nguy cơ mắc bệnh cao như sử dụng thuốc lá, rượu, thừa cân – béo phì, chế độ ăn không lành mạnh với ít rau củ quả, thiếu hoạt động thể chất, nhiễm HPV, HBV do lây nhiễm qua đường tình dục, bức xạ ion, tia cực tím dưới ánh mặt trời, ô nhiễm không khí [5]. Đồng thời cũng tăng khả năng phát hiện sớm ung thư bằng cách khám tổng thể định kỳ thường xuyên bởi điều trị ở giai đoạn sớm ung thư, các bệnh nhân có nhiều khả năng sống sót cao hơn, chi phí 4
điều trị cũng thấp hơn. Để làm được điều đó cần tăng cường tuyên truyền cho người dân nhận thức được nguy cơ tiềm ẩn của bệnh ung thư đồng thời tiếp cận và chăm sóc, đánh giá lâm sàng cũng như chuẩn đoán và phân giai đoạn kịp thời để đưa ra hướng điều trị phù hợp nhất. Mỗi loại ung thư có một phác đồ điều trị cụ thể bao gồm một hoặc nhiều phương thức như phẫu thuật, hóa trị hay xạ trị. Mục tiêu chính là kéo dài tuổi thọ đồng thời cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân. Tuy nhiên điều trị ung thư bằng các phương pháp truyền thống thì lại tốn kém, đồng thời gây ra nhiều tác dụng phụ cho bệnh nhân. Vì vậy hiện nay các nhà khoa học đang hướng đến nghiên cứu liệu pháp điều trị đích. Khi đó thuốc chỉ tác động vào các tế bào ung thư mà không gây ảnh hưởng đến các tế bào khác của cơ thể. Và giúp làm giảm thời gian, chi phí điều trị ung thư lên nhiều lần giúp cải thiện cuộc sống cho các bệnh nhân ung thư. 2. Tổng quan về gen TP53 và protein p53 2.1. Cấu trúc của gen TP53 và protein p53 Năm 1979, sáu nhóm nghiên cứu làm việc độc lập cùng công bố phát hiện một protein có khối lượng 53 kDa có mặt trong các tế bào chuột và người (DeLeo et al. 1979, Kress et al. 1979, Lane & Crawford 1979, Linzer & Levine 1979, Melero et al. 1979, Smith et al. 1979). Ngay sau đó nhiều nghiên cứu đã được thực hiện trên protein này và sau đó với gen mã hóa cho protein là TP53, cho thấy TP53 này là một gen ức chế khối u (tumor suppressor gene) [2]. Hình 1: Cấu trúc của protein p53 ở người [34] 5
Protein p53 là một phosphoprotein dạng tetrameric, là một trong những protein có vai trò trong chu trình tế bào giúp ức chế quá trình hình thành khối u, ngăn ngừa đột biến gen và sửa chữa DNA [27]. Tuy nhiên thực tế thì protein p53 dài đầy đủ có kích thước khoảng 43,7 kDa. Sự khác biệt này là do số axit amin proline lớn nên protein di chuyển chậm hơn trên SDS-PAGE [33]. Ngoài các protein có độ dài đầy đủ, gen TP53 ở người còn mã hóa cho ít nhất 15 đồng vị protein có khối lượng từ 3,5 đến 43,7 kDa. Đồng thời các gen TP53 cũng là gen có tần số đột biến cao nhất (>50%) trong tế bào ung thư ở người [27]. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng protein p53 cũng liên kết với DNA và điều chỉnh mức độ hoạt động của gen và ngăn chặn sự hình thành đột biến [16]. Ở người, gen TP53 nằm trên cánh ngắn của NST số 17 (17p13.1) [20]. Protein p53 là một polypeptide có độ dài khoảng 400 aa (393 aa với p53 ở người). Monomer của p53 được gấp nếp bởi trong cơ thể, protein p53 tồn tại ở dạng tetramers [1, 20, 27]. Cấu trúc protein p53 gồm có: miền kích hoạt phiên mã (1-42), vùng giàu proline (64-92), khu vực lõi chứa một nguyên tử kẽm (102-292), miền homo-oligomerisation (OD) cần thiết cho hoạt động của p53 trong cơ thể (307-355), và vùng đầu mút C (356-393). 2.2. Cấu trúc không gian của protein p53 Protein p53 ở dạng monomer bao bao gồm 2 nếp gấp β song song với nhau. Trong tế bào, protein p53 thường tồn tại ở dạng tetramer liên kết với nhau thông qua vùng oligomer ở đầu C và liên kết với DNA tại vùng gắn đặc hiệu với DNA (hình 2). Mỗi tetramer bao gồm hai dimer liên kết lại với nhau thông qua DNA. Mỗi dimer lại được hình thành từ hai monomer thông qua liên kết liên phân tử giữa các tấm β song song. Hai dimer lại liên kết với nhau thông qua tương tác kỵ nước tạo thành tetramer chặt chẽ và có sự ổn định cao. Trung tâm của tetramer là các chuỗi bên Leu344 từ tất cả các monomer tiếp xúc trực tiếp với nhau. Phần đầu của vùng kích hoạt trên bốn monomer có thể liên kết được với bốn phân tử MDM2. Bình thường trong tế bào, cấu trúc tetramer của protein p53 bao gồm bốn monomer liên kết với phân tử DNA đích và bốn phân tử MDM2 [1, 11, 28]. 6
Hình 2. Cấu trúc phân tử của protein p53 [24]. Chú thích: A: protein p53 nhìn từ phía trên; B: chồng chất protein không có DNA (vàng) bên trong phức hợp p53-DNA; C: cấu trúc tinh thể của 2 miền lõi liên kết với DNA; D: lắp các miền lõi và DNA lại với nhau trong cấu trúc tinh thể [36]. 2.3. Các trình tự nhận biết đặc hiệu của protein p53 với gen mục tiêu Protein p53 hoạt động chủ yếu như một nhân tố phiên mã. Được kích hoạt để đáp ứng các căng thẳng của tế bào như tổn thương DNA, căng thẳng ribosome, thiếu oxy,… bằng cách ngừng chu trình tế bào hoặc gây ra apoptosis. Thông thường trong tế bào protein p53 được liên kết với DNA ở dạng tetramer, gồm 2 dimer. Mỗi dimer liên kết với một trình tự đồng thuận RRRCWWGYYY (R = A / G, W = A / T, Y = C / T) [7]. Các gen mục tiêu đầu tiên được phát hiện bao gồm CDKN1A (p21, CIP1, WAF1), GADD45A, và MDM2 [8,9,15]. Các nghiên cứu các mục tiêu khác của p53 từ nghiên cứu tập trung đến nghiên cứu những gen riêng lẻ và đã đưa ra khoảng 346 gen được mô tả trong 319 nghiên cứu độc lập được công bố từ năm 1992 đến năm 2016, với tối đa 26 nghiên cứu được công bố năm 2006 (hình 3a). Trong số 346 gen, có 246 gen được báo cáo là được kích hoạt bởi p53, 26% là bị ức chế và 3% là cả hai được kích hoạt và bị ức chế (hình 3b). Các nghiên cứu 319 (399 7
cặp nghiên cứu gen) đã điều tra 358 gen người, 47 gen chuột, 5 gen chuột và 1 gen bò (Hình 3c). Cuối cùng, dữ liệu về protein của người được tập trung hơn cả. Hình 3: Các khảo sát nghiên cứu protein p53 từ 319 nghiên cứu độc lập. Chú thích: (a) Số lượng nghiên cứu báo cáo các gen mục tiêu p53 riêng lẻ được công bố trong một năm cụ thể. (b) Các gen được báo cáo là được kích hoạt, bị ức chế hoặc cả được kích hoạt và bị ức chế bởi p53. (c) Các thí nghiệm được thực hiện trong các tế bào từ người, chuột, chuột hoặc bò. Một số nghiên cứu đã sử dụng các tế bào từ nhiều hơn một loài. (d) Liên kết của p53 nằm ở các phần khác nhau của gen. (e) các vị trí liên kết của p53 được đặt ở các khoảng cách khác nhau từ vị trí khởi đầu phiên mã (Transcriptional start site, TSS). Một số gen hiển thị nhiều vị trí liên kết của p53. (f) Các phương pháp khác nhau đã được sử dụng để xác định các vị trí liên kết của p53. (g) Số lượng ấn phẩm đã sử dụng một phương pháp cụ thể để xác định vị trí liên kết của p53 [18]. 2.4. Chức năng của protein p53 Protein p53 hình thành bởi một homotetrameric đã được báo cáo có thể điều chỉnh trực tiếp việc phiên mã của khoảng 500 gen mục tiêu. Nó kiểm soát hàng loạt các quá trình tế bào bao gồm kiểm soát chu trình tế bào, lão hóa tế bào, sửa chữa DNA, kiểm soát trao đổi chất và chết theo chương trình của tế bào. 8
Trong các tế bào bình thường mức độ biểu hiện của protein p53 rất thấp, nó là protein nhắm mục tiêu làm thoái hóa proteosomal của E3 ubiquitin ligase MDM2. Để đáp ứng với các kích thích căng thẳng khác nhau bao gồm việc kích hoạt gen gây ung thư, tổn thương DNA hoặc thiếu oxy dẫn tới protein p53 được kích hoạt để ngừng việc nhân bản của tế bào cũng như kích hoạt quá trình apoptosis gây chết tế bào theo chương trình, qua đó giúp giảm thiếu tối đa rủi ro do tế bào bị đột biến, ung thư… gây ra [21]. Protein p53 có nhiều chức năng khác nhau đặc biệt là ức chế tế bào tăng trưởng tại điểm checkpoint tại G1/S nếu nhận diện thấy sự tổn thương DNA. Hay kích hoạt quá trình sửa chữa DNA sai hỏng. Mà nếu không thể sửa chữa được nữa thì protein p53 sẽ kích hoạt apoptosis gây ra chết theo chương trình tế bào. Các p53 hoạt hóa gắn với DNA và kích hoạt biểu hiện của một số gen bao gồm cả viRNA miR-34a, WAF1 / CIP1 mã hóa cho p21 và hàng trăm các dòng khác [21]. Protein p21 (WAF1) liên kết với các phức hợp G1 - S / CDK (CDK4 / CDK6, CDK2 và CDK1) (các phân tử quan trọng trong quá trình chuyển đổi G1/S trong chu kỳ tế bào) ức chế hoạt động của chúng. Vì vậy protein p53 trở thành mục tiêu cho các nhà khoa học nghiên cứu về khả năng điều trị tế bào ung thư dựa vào p53 ngoại lai. 2.5. Cơ chế protein p53 gây nên apoptosis và ảnh hưởng đến sự ức chế tế bào khối u Apoptosis là quá trình tế bào chết theo chương trình. Trong đó tế bào chết theo một quy trình cụ thể, các thành phần của tế bào được đóng gói thành các bao màng nhỏ để đưa đi xử lý. Khi mà tế bào già đi, bị đột biến hay bị tổn thương, tế bào sẽ kích hoạt quá trình apoptosis để bảo vệ cơ thể khỏi tác động có hại của các tế bào này [24]. Để đáp ứng với các kích thích căng thẳng như tổn thương DNA, gen ung thư hay thiếu dinh dưỡng, mức độ protein p53 được tăng cường đáng kể thông qua việc ức chế MDM2, một số là sửa đổi như acetyl hóa hay phosphoryl hóa ngay bên trong protein p53, hình 4. 9
Hình 4: Điều chỉnh mức độ biểu hiện của protein p53 trong tế bào bị tác động bất lợi và bình thường [3]. Có 2 con đường chính dẫn tới apoptosis. Con đường đầu tiên được điều hòa bởi BCL-2, tế bào chết theo chương trình được bắt đầu bằng việc tăng cường dịch mã và/hoặc sau dịch mã được gọi là pro-apoptotic BH3-only, là một thành viên thuộc họ BCL-2 protein (BIM, PUMA, BID, BMF, BAD, BIK, NOXA, HRK). BH3-only liên kết và ức chế nhân tố tiền sống sót BCL-2 protein (BCL-2, BCL-XL, MCL-1, BCL-W and A1/BFL1). Bằng cách đó mà giải phóng nhân tố gây chết tế bào là BAX và BAK (nhân tố tiền apoptosis chứa đa cấu trúc BH – một họ thuộc protein BCL-2, có thể được bắt đầu bởi BOK). Việc kích hoạt BAX/BAK là nguyên nhân cho việc giải phóng màng ngoài ty thể - điểm mà không thể quay lại trong tín hiệu apotosis. Ngay sau đó kích hoạt caspase (điển hình là caspase-9) và APAF-1 dẫn tới phá hủy tế bào một cách triệt để [17]. Con đường ngược lại, bằng cách tăng cường và kích hoạt tiền cấu trúc của caspase-8 thông qua adaptor FADD, và trong những thành phần gây chết tế bào bên trong màng tế bào như TRADD. Trong dòng tế bào gọi là tế bào type-1, việc kích hoạt caspase-8 thông qua caspase-3 và caspase-7 là đủ để tiêu diệt tế bào [32]. Tuy nhiên đối với tế bào type-2, việc kích 10