Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu chuyển gen codA mã hóa enzyme sinh tổng hợp glycine betain dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng khô hạn RD29A vào cây đậu tương

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:78

Thêm vào BST

Báo xấu

20
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đậu tương là cây trồng chịu hạn kém khi thiếu nước ở các thời kỳ khác nhau đều có ảnh hưởng xấu đến năng suất. Như vậy, việc chọn tạo được các giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn là một nhu cầu cần thiết trong sản xuất và được xem như định hướng nghiên cứu phát triển cây đậu tương ở Việt Nam. Đề tài đã tiến hành ghiên cứu chuyển gen codA mã hóa enzyme sinh tổng hợp glycine betain dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng khô hạn RD29A vào cây đậu tương

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu chuyển gen codA mã hóa enzyme sinh tổng hợp glycine betain dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng khô hạn RD29A vào cây đậu tương

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT TẠ THỊ ĐÔNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN codA MÃ HÓA ENZYME SINH TỔNG HỢP GLYCINE BETAIN DƯỚI SỰ ĐIỀU KHIỂN CỦA PROMOTER CẢM ỨNG KHÔ HẠN rd29A VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC (Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm) Mã số: 60 42 01 14 Người hướng dẫn: PGS. TS. CHU HOÀNG HÀ Đơn vị: Viện Công nghệ sinh học,Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Hà Nội, 10/2017
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi được thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Chu Hoàng Hà. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào. Luận văn sử dụng thông tin, số liệu và hình ảnh từ các bài báo và nguồn tài liệu của các tác giả khác đều được chú thích và trích dẫn đầy đủ. Nếu có bất kỳ sự gian lận nào, tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về nội dung luận văn. Hà Nội, tháng 10 năm 2017 Học viên Tạ Thị Đông
ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Chu Hoàng Hà đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, làm việc và hoàn thành luận văn. Xin chân thành cảm ơn TS. Phạm Bích Ngọc, Ths. Nguyễn Văn Đoài, cùng tập thể cán bộ, nghiên cứu sinh, học viên Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo và Ban đào tạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn đến bạn bè và gia đình đã giúp đỡ và chia sẻ, động viên trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện luận văn. Hà Nội, tháng 10 năm 2017 Học viên Tạ Thị Đông
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. ii MỤC LỤC ..................................................................................................................... iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ..............................................................vi DANH MỤC BẢNG .................................................................................................... vii DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... viii MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1 NỘI DUNG......................................................................................................................2 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................2 1.1. CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX) GIÁ TRỊ KINH TẾ VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG .............................................................................................................................. 2 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại ........................................................................................ 2 1.1.2. Đặc điểm sinh học ................................................................................................ 3 1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây đậu tương............................................. 4 1.1.4. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam .................................. 5 1.2. HẠN VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬU TƯƠNG .......................... 7 1.2.1. Tác động của hạn đến hệ rễ .................................................................................. 8 1.2.2. Tác động của hạn đến khả năng cố định đạm ....................................................... 8 1.2.3. Tác động của hạn đến hình thái lá ...................................................................... 10 1.3. GLYCINE BETAINE (GB) VÀ CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP GB ......... 10 1.3.1. Cơ chế chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường ở thực vật .................. 10 1.3.2. Các con đường sinh tổng hợp GB ...................................................................... 12 1.3.3. Cây trồng chuyển gen sinh tổng hợp GB tăng cường khả năng chống chịu điều kiện môi trường bất lợi .................................................................................................. 14 1.4. PROMOTER VÀ PROMOTER CẢM ỨNG KHÔ HẠN RD29A ................... 20 1.4.1. Cấu trúc và chức năng của promoter .................................................................. 20 1.4.2. Promoter cảm ứng khô hạn RD29A ................................................................... 20 1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG BIẾN ĐỔI GEN ...... 21 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 28 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................................................................ 28
iv 2.1.1. Vật liệu thực vật.................................................................................................. 28 2.1.2. Chủng vi khuẩn và vector ................................................................................... 28 2.1.3. Hóa chất thiết bị .................................................................................................. 29 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 29 2.2.1. Các phương pháp thiết kế vector chuyển gen pIBTII- rd29A-codA .................. 29 2.2.2. Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua Agrobacterium .............. 34 2.2.3. Phương pháp đánh giá cây thuốc lá chuyển gen codA ....................................... 34 2.2.4. Phương pháp tạo cây đậu tương chuyển gen ...................................................... 34 2.2.5. Phương pháp phân tích cây đậu tương chuyển gen bằng phản ứng PCR........... 36 2.2.6. Phương pháp phân tích cây đậu tương chuyển gen bằng Phosphinothricin ....... 36 2.2.7. Xây dựng đường chuẩn xử lý hạn ở giống đậu tương ĐT22.............................. 37 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.................................................................38 3.1. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN CODA DƯỚI SỰ ĐIỀU KHIỂN CỦA PROMOTER CẢM ỨNG KHÔ HẠN RD29A..................... 38 3.1.1. PCR nhân promoter rd29A từ cây Arabidopsis với mồi RD29A-HindIII-F và RD29A-Xbal-R. .............................................................................................................. 38 3.1.2. Tách dòng rd29A bằng vector pBT, cắt pBT-rd29A và pIBTII-35S-codA với HindIII và Xbal .............................................................................................................. 38 3.1.3. Nối rd29A với pIBTII-codA, biến nạp vào E.coli, chọn dòng băng phản ứng cloni PCR với mồi RD29A-HindIII-F và RD29A-XbaL-R ........................................... 39 3.1.4. Biến nạp pIBTII-rd29A-codA vào Agrobacterium chọn dòng băng phản ứng colony PCR với mồi RD29A-HindIII-F và RD29A-Xbal-R .......................................... 40 3.2. KẾT QUẢ CHUYỂN GEN CODA VÀO THUỐC LÁ THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM. ...................................................................................... 41 3.2.1. Kết quả chuyển cấu trúc pIBTII-rd29A-codA vào giống thuốc lá K326. ........... 41 3.2.2. Kết quả đánh giá và phân tích các dòng thuốc lá chuyển gen ............................ 42 3.2.3. Kết quả đánh giá khả năng chống chịu của các dòng thuốc lá chuyển gen........ 43 3.3. KẾT QUẢ CHUYỂN GEN CODA VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT22 ......... 44 3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn A. Tumefacien sử dụng cho biến nạp đến khả năng cảm ứng tạo chồi ................................................................................................... 44 3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ ppt (Phosphinothricin) đến hiệu quả chuyển gen ...... 45
v 3.3.3. Kết quả chuyển cấu trúc pIBTII-rd29A-codA vào đậu tương ............................ 46 3.4. PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC DÒNG ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN .. 49 3.4.1. Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T0, T1 chuyển cấu trúc rd29A - codA bằng phản ứng PCR ....................................................................................................... 49 3.4.2. Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T0 và T1 chuyển cấu trúc rd29A-codA bằng ppt ......................................................................................................................... 50 3.4.3. Kết quả xây dựng đường xử lý hạn ở giống đậu tương DT22 ........................... 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 58 PHỤ LỤC ......................................................................................................................68
vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU AS Acetosyrigone A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-benzyladenine purin GB Glycine Betain bp Base pair CCM Cocultivation medium DNA Deoxyribonucleic acid E. coli Escherichia coli GA3 Gibberellic acid GM Germination medium - Môi trường nảy mầm IAA Indoleacetic acid IBA Indole-3-butyric acid MS Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (1962) NAA α-Naphthaleneacetic acid OD Optical density PCR Polymerase Chain Reaction PPT Phosphinothricin RM Rooting medium - Môi trường ra rễ SIM Shoot induction medium - Môi trường tạo chồi SEM Shoot elongation medium - Môi trường kéo dài chồi T-DNA Vùng DNA plasmid chuyển vào thực vật T0, T1 Các thế hệ cây đậu tương chuyển gen YEP Yeast extract peptone
vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Sản lượng đậu tương Việt Nam (2011-2015) .................................................6 Bảng 1.2. Một số loài cây trồng chuyển gen mã hóa enzyme tham gia sinh tổng hợp GB, tăng khả năng chống chịu với điều kiện môi trường bất lợi. .................................18 Bảng 1.3 Tổng hợp nghiên cứu chuyển gen vào nốt lá mầm đậu tương trên thế giới ..23 Bảng 1.4 Tổng hợp nghiên cứu chuyển gen vào nốt lá mầm đậu tương ở Việt Nam..26 Bảng 2.1 Các cặp mồi dung cho phản ứng PCR đậu tương ..........................................28 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR ............................................................................29 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR nhân promoter rd29A .......................................30 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng ghép nối promoter rd29A với vector tách dòng pBT .30 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme HindIII và XbaI .............................. 31 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng nối với nhờ enzyme T4 ligase ...................................31 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng phản ứng colony PCR ................................................32 Bảng 2.8 Thành phần dung dịch đệm tách chiết ........................................................... 33 Bảng 2.9 Chu trình nhiệt của PCR ................................................................................33 Bảng 3.1. Tỷ lệ sống sót của các mảnh thuốc lá biến nạp qua các giai đoạn chọn lọc 41 Bảng 3.2 Kết quả gây hạn nhân tạo các dòng thuốc lá chuyển gen .............................. 43 Báng 3.3 Ảnh hưởng cuả nồng độ khuẩn đến khả năng cảm ứng tạo chồi...................45 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ ppt đến khả năng tạo chồi ......................................46 Bảng 3.5. Kết quả biến nạp vector chuyển gen vào mảnh lá mầm đậu tương ..............47 Bảng 3.6 Kết quả kiểm tra các dòng T1 bằng Phosphinothricin 250mg/l ....................52 Bảng 3.7 Sự phát triển của thân và rễ các cây đậu tương ĐT22 thí nghiệm ...............54
viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Diện tích trồng và sản lượng cây đậu tương tại Việt Nam (2011-2015) .........6 Hình 1.2 Sinh tổng hợp GB ở thực vật bậc cao ........................................................... 13 Hình 1.3 Sinh tổng hợp GB ở A. globiformis ............................................................. 13 Hình 2.1 Sơ đồ khái quát thí nghiệm tái sinh cây đậu tương qua đa chồi từ nách lá mầm hạt chín .................................................................................................................35 Hình 3.1 Kết quả PCR nhân promoter rd29A từ cây Arabidopsis ............................... 38 Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR được xử lý bởi HindIII / XbaI ...................39 Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm colony – PCR ......................................................40 Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm colony – PCR với cặp mồi đặc hiệu....................41 Hình 3.5 Các giai đoạn của quá trình chuyển gen ở thuốc lá. ......................................42 Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng thuốc lá .........................................42 Hình 3.7 Kết quả gây hạn nhân tạo các dòng thuốc lá chuyển gen .............................. 44 Hình 3.8 Các mảnh lá mầm trên môi trường chọn lọc với nồng độ ppt khác nhau ......46 Hình 3.9 Các giai đoạn của quá trình chuyển gen ở đậu tương. ...................................48 Hình 3.10 Kết quả kiểm tra cây T0 bằng PCR ............................................................. 49 Hình 3.11 Kết quả kiểm tra cây T1 bằng PCR ............................................................. 50 Hình 3.12 Kết quả kiểm tra các dòng Đậu Tương T0 bằng Phosphinothricin .............50 Hình 3.13 Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T1 bằng Phosphinothricin ...............51 Hình 3.14 Sinh trưởng của giống DT22 sau 3,6,9,12 thí nghiệm .................................53 Hình 3.15 Sự phát triển thân và rễ ở giống DT22 ........................................................54 Hình 3.16 Các cây được phục hồi sau 3, 6, 9,10, 11 ngày gây hạn nhân tạo ...............55
1 MỞ ĐẦU Đậu tương là cây trồng quan trọng cho nền nông nghiệp thế giới, là một loại cây trồng được sử dụng làm nguồn thức ăn cho con người và vật nuôi, cũng như trong công nghiệp… Hạt đậu tương có chứa hàm lượng protein và dầu cao, ngoài ra, còn có các chất khác như carbohydrate, vitamin và các khoáng chất. Do vậy, đậu tương trở thành đối tượng cho các nghiên cứu về nâng cao các tính trạng số lượng, chất lượng và khả năng chống chịu. Hiện nay, chuyển gen đang là một trong những phương pháp ứng dụng trong nghiên cứu chọn giống cây trồng nói chung và đậu tương nói riêng. Cây đậu tương là một trong những loại cây trồng quan trọng bậc nhất ở nhiều quốc gia với vị trí chỉ đứng sau lúa, ngô và lúa mì, có khả năng thích nghi rộng với các điều kiện khí hậu và sinh thái khác nhau nên đậu tương được trồng rộng rãi trên cả năm châu lục, tập trung nhiều nhất ở Châu Mỹ tiếp đến là Châu Á. Bình quân hàng năm trên thế giới có khoảng 91 triệu ha đậu tương được gieo trồng với năng suất bình quân khá cao 22-23 tấn/ha. Mỹ là nước có diện tích gieo trồng cũng như sản lượng đậu tương lớn nhất thế giới, tiếp theo là Brazil, Achentina, Trung Quốc. Trong năm 2014 sản lượng đậu tương của brazil đạt 90.700.000 ha. Ngày 11/4/17, IBGE- Viện Địa lý và Thống kê Brazil dự báo sản lượng đậu tương nước này trong năm nay sẽ đạt mức kỷ lục 110,9 triệu tấn tăng 15,9% so với năm 2016 Bước vào thời kỳ hiện tại, biến đổi khí hậu đang ảnh hưởng tới năng suất và chất lượng của cây trồng, các yếu tố bất lợi của môi trường đang là những thách thức lớn cho mục tiêu duy trì phát triển bền vững cho sản xuất lương thực cho con người, trong đó hạn mặn là hai trong số những yếu tố quan trọng kìm hãm sự phát triển sản xuất nông nghiệp. Những năm gần đây, thế giới cũng như Việt Nam thường xuyên phải gánh chịu những biến động lớn. Sự gia tăng của hạn hán, lũ lụt, xói mòn, thoái hóa đất gây ảnh hưởng đến cây trồng. Đậu tương là cây trồng chịu hạn kém khi thiếu nước ở các thời kỳ khác nhau đều có ảnh hưởng xấu đến năng suất. Như vậy, việc chọn tạo được các giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn là một nhu cầu cần thiết trong sản xuất và được xem như định hướng nghiên cứu phát triển cây đậu tương ở Việt Nam.
2 NỘI DUNG CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX) GIÁ TRỊ KINH TẾ VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại Dựa vào sự đa dạng về hình thái của hạt, Fukuda và nhiều nhà khoa học đã thống nhất rằng cây đậu tương có nguồn gốc từ vùng Mãn Châu (Trung Quốc, xuất phát từ một loại đậu tương dại, thân mảnh, dạng dây leo, có tên khoa học là Glycile Soja Sieb và Zucc[26]. Từ Trung Quốc đậu tương được lan truyền dần ra khắp thế giới. Theo các nhà nghiên cứu Nhật Bản vào khoảng 200 năm trước công nguyên, đậu tương được đưa vào Triều Tiên và sau đó phát triển sang Nhật đến giữa thế kỷ 17 đậu tương được nhà thựcvật học người Đức Engellbert Caempler đưa về Châu Âu và đến năm 1954 đậu tương mới được du nhập vào Hoa Kỳ. Sau chiến tranh thế giới thứ hai, đậu tương phát triển mạnh ở Mỹ, Brazin và Canada. Ở nước ta đậu tương có lịch sử phát triển lâu đời nhưng trải qua thời gian dài cây đậu tương vẫn chiếm một vị trí rất khiêm tốn trong nền sản xuất của nông nghiệp Việt Nam. Đậu tương được trồng lấy hạt, là loại cây thực phẩm quan trọng sau lúa mì, lúa nước và ngô. Đậu tương được trồng nhiều nhất ở Châu Mỹ trên 70%, tiếp đến là Châu Á. Ở nước ta hiện nay có 6 vùng sản xuất đậu tương: vùng Đông Nam Bộ 26,2%, miền núi Bắc Bộ 24,7%, đồng bằng Sông Hồng 17,5%, đồng bằng Sông Cửu Long 12,4%, hai vùng còn lại trồng đậu tương với tỷ lệ thấp hơn là đồng bằng ven biển miền Trung và Tây Nguyên. Cây đậu tương thuộc bộ Phaseoleae, họ đậu Fabaceae, họ phụ cánh bướm Papilionoideae chi Glycine với tên khoa học là Glycine max. Căn cứ vào đặc điểm hình thái, sự phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể thì Hymowit và Newell (1984) cho rằng ngoài chi Glycine còn có chi phụ Soja[35]. Chi Glycine được chia thành 7 loài hoang dại lâu năm, chi Soja gồm 2 loài trong đó có loài đậu tương trồng Glycine max [1].
3 1.1.2. Đặc điểm sinh học Đậu tương là cây hai lá mầm, thân thảo. Thân cây có nhiều lông nhỏ, khi còn non thân có màu xanh hoặc tím, khi về già chuyển màu nâu nhạt. Màu sắc của thân cây cho ta biết màu của hoa sau này, nếu thân có màu xanh hoa sẽ có màu trắng, nếu thân có màu tím thì sau hoa sẽ có màu tím đỏ, chiều cao của thân từ 0,3 - 1m tùy theo giống. Cây đậu tương có ba loại lá: lá mầm, lá đơn, lá kép. Mỗi lá kép thường có 3 thuỳ (lá chét), lá kép mọc so le, trên phiến lá có nhiều lông tơ. Hình dạng của lá thay đổi theo giống, những giống có lá dài và nhỏ chịu hạn tốt, nhưng cho năng suất thấp, những giống lá to thường cho năng suất cao hơn nhưng cũng chịu hạn kém hơn. Hoa đậu tương được phát sinh từ nách lá, đầu cành hoặc đầu thân. Hoa mọc thành chùm, mỗi chùm thường có từ 3 - 5 hoa. Hoa lưỡng tính nên đậu tương là cây tự thụ phấn, tỷ lệ giao phấn rất thấp chỉ chiếm 0,5 - 1%. Quả đậu tương thẳng hoặc hơi cong, dài từ 2 - 7cm. Mỗi quả thường có 2 - 3 hạt. Hạt đậu tương có hình tròn, bầu dục… những giống có hạt màu vàng có giá trị thương phẩm cao. Khối lượng 1000 hạt dao động trung bình từ 100 - 200g. Hình dạng và màu sắc của rốn hạt đặc trưng cho mỗi giống. Bộ rễ đậu tương gồm rễ chính và rễ phụ. Trên rễ có rất nhiều nốt sần, đó là kết quả của sự cộng sinh giữa vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ. Nốt sần có thể dài 1cm, đường kính 5 - 6mm, khi mới hình thành nó có màu trắng sữa, khi phát triển tốt nhất nốt sần có màu hồng. Nốt sần tập trung nhiều ở tầng đất có độ sâu từ 0 - 20cm, có vai trò quan trọng trong việc cố định đạm từ nitơ không khí, với lượng đạm cung cấp cho cây khoảng 30 - 60 kg/ha. Dựa vào thời gian sinh trưởng, đậu tương được chia thành các loại: chín rất sớm: thu hoạch sau 80-90 ngày; chín sớm: thu hoạch sau 90 - 100 ngày; chín trung bình: thu hoạch sau 100 - 110 ngày; chín muộn trung bình: thu hoạch sau 110 - 120 ngày; chín muộn: thu hoạch sau 130 - 140 ngày; chín rất muộn: thu hoạch sau 140 - 150 ngày [1].
4 1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây đậu tương Đậu tương là cây thực phẩm ngắn ngày, giàu dinh dưỡng, có giá trị kinh tế cao, sản phẩm của nó được dùng làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, làm hàng xuất khẩu và là loài cây cải tạo đất trồng rất tốt. Giá trị dinh dưỡng: Trong hạt đậu tương có các thành phần hoá học sau protein (40%), lipid (12-25%), glucid (10-15%); các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin A, B1, B2, D, E, F; các enzyme, sáp, nhựa, cellulose. Trong đậu tương có đủ các acid amin cơ bản isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin, tryptophan, valin. Ngoài ra, đậu tương được coi là một nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một lượng đáng kể các amino acid không thay thế cần thiết cho cơ thể. Các thực phẩm làm từ đậu tương được xem là một loại "thịt không xương" vì chứa tỷ lệ đạm thực vật dồi dào, có thể thay thế cho nguồn đạm từ thịt động vật. Thậm chí, lượng đạm (protein) trong 100 g đậu tương có thể tương đương với lượng đạm trong 800 g thịt bò. Tại các quốc gia như Nhật Bản, Trung Quốc, 60% lượng đạm tiêu thụ hằng ngày là do đậu tương cung cấp. Hàm lượng chất đạm chứa trong đậu tương cao hơn nhiều so với lượng chất đạm chứa trong các loại đậu khác. Giá trị về mặt thực phẩm: Hàm lượng protein trong đậu tương cao hơn trong cá, thịt và cao gấp 2 lần các loại đậu đỗ khác, protein trong hạt đậu chiếm khoảng 35 - 50% (phụ thuộc vào giống và điều kiện chăm sóc), dễ tiêu hóa hơn thịt và không có thành phần tạo cholesterol. Đậu tương còn được xem là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng, lipit đậu tương chứa thành phần các axit béo không no cao, tổng số chất béo chiếm khoảng 18%. Trong hạt đậu tương còn chứa nhiều loại vitamin, đáng kể là các vitamin nhóm B như: B1, B2, B6, vitamin E,… Ngoài ra, nó còn chứa sắt, canxi, photpho và các thành phần giúp ích cho sức khỏe con người như phytosterol, lecithin, isoflavon, phytoestogen và những sản phẩm ức chế phân hủy protein[1]. Giá trị về mặt công nghiệp: Hiện nay trên thế giới, đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% dầu thực vật, dầu đậu tương khô chậm, chỉ số iốt cao 120 - 127, nhiệt độ ngưng tụ -15 đến -18°C và từ dầu người ta có thể làm nến, xà phòng, nilon,…Đậu tương còn là nguyên liệu của nhiều
5 ngành công nghiệp khác như: chế biến cao su nhân tạo, mực in, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng[1]. Giá trị về mặt nông nghiệp: Toàn bộ cây đậu tương cả khi tươi và khô đều có thể dùng làm thức ăn cho gia súc. Đậu tương có vai trò quan trọng trong cải tạo đất trồng, một ha đậu tương nếu sinh trưởng và phát triển tốt sẽ để lại trong đất 30 - 60 kg nitơ, thân và lá với hàm lượng đạm cao có thể dùng để bón cho đất thay cho phân hữu cơ. Việc luân canh đậu tương với cây trồng khác có thể xem là biện pháp cải tạo đất trồng hữu hiệu. 1.1.4. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam Thế giới: Nhận thấy với những giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao của cây đậu tương, nên đây được xem là một trong những loại cây trồng quan trọng bậc nhất ở nhiều quốc gia với vị trí chỉ đứng sau lúa, ngô và lúa mì. Do có khả năng thích nghi rộng với các điều kiện khí hậu và sinh thái khác nhau nên đậu tương được trồng rộng rãi trên cả năm châu lục, tập trung nhiều nhất ở Châu Mỹ, tiếp đến là Châu Á. Bình quân hàng năm trên thế giới có khoảng 91 triệu ha đậu tương được gieo trồng với năng suất bình quân khá cao 22-23 tấn/ha. Mỹ là nước có diện tích gieo trồng cũng như sản lượng đậu tương lớn nhất thế giới, tiếp theo là Brazil, Achentina, Trung Quốc. Trong năm 2014, 82% (90.700.000 ha) trong số 111 triệu ha đậu tương trồng trên toàn cầu là đậu tương chuyển gen. Việt Nam: Đậu tương được gieo trồng từ rất sớm, nó được trồng trước cây đậu xanh và đậu đen. Tuy nhiên với các phương pháp canh tác truyền thống, bộ giống năng suất thấp, sản xuất nhỏ lẻ, giá thành cao, lãi suất thấp, giá thành đậu tương trong nước không có khả năng cạnh tranh với đậu tương nhập khẩu là nguyên nhân khiến cho nông dân không mặn mà với cây đậu tương. Vì vậy, diện tích và sản lượng đậu tương của nước ta phát triển chậm. Năm 2012, sản lượng đậu tương nước ta giảm 34,3% so với cùng kỳ năm trước, xuống còn 175,2 nghìn tấn do thời tiết lạnh khác nghiệt vào cuối năm 2011 và đầu năm 2012 khiến cho năng suất và diện tích gieo trồng giảm mạnh. Quy mô sản xuất vẫn còn tương đối nhỏ và tiếp tục không đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ trong nước. USDA dự báo diện tích trồng đậu tương năm 2013 nước ta tăng khoảng 180 nghìn ha so với năm 2011 và sản lượng đạt ở mức 270.000 tấn. Theo
6 số liệu thống kê chính thức, đậu tương đang được trồng tại 25 trong số 63 tỉnh thành cả nước, với khoảng 65% tại các khu vực phía Bắc và 35% tại các khu vực phía Nam. Thủ tướng Chính phủ cũng đã phê duyệt Quy hoạch tổng thể phát triển sản xuất ngành nông nghiệp đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030. Theo đó, diện tích đất quy hoạch khoảng 100 ngàn ha, tận dụng tăng vụ trên đất lúa để năm 2020 diện tích gieo trồng khoảng 350.000 ha, sản lượng 700.000 tấn; vùng sản xuất chính là đồng bằng sông Hồng, trung du miền núi phía Bắc, Tây Nguyên. Theo Hiệp hội chăn nuôi Việt Nam (VNFA), đậu tương sản xuất trong nước có mức giá bán kém cạnh tranh so với đậu tương nhập khẩu. Ví dụ, đậu tương sản xuất trong nước hiện có giá từ 16.000 VND – 17.000 VND/kg (tương đương 0,77 – 0.82 USD/kg), trong khi giá đậu tương nhập khẩu chỉ khoảng từ 14.600 – 15.000 VND/kg (tương đương 0,70 – 0,71 USD/kg). Bảng 1.1 Sản lượng đậu tương Việt Nam (2011-2015) 2011 2012 2013 2014* 2015* Diện tích gieo trồng (nghìn ha) 181,1 119,6 117,8 120 130 Năng suất (tấn/ha) 1,47 1,45 1,43 1,47 1,48 Tổng sản lượng (nghìn tấn) 266,9 173,7 168,4 176,4 192,4 Nguồn: Tổng cục Thống kê Việt Nam (GSO), Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, *số liệu dự báo của USDA Hình 1.1 Diện tích trồng và sản lượng cây đậu tương tại Việt Nam (2011-2015) Nguồn: Tổng cục Thống kê Việt Nam, *số liệu dự báo Nguồn: Tổng Cục thống kê Việt Nam, *số liệu 2011: ước tính của FAS
7 1.2. HẠN VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬU TƯƠNG Hạn đối với thực vật là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nước do môi trường gây nên làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây. Những cây có khả năng duy trì và cho năng suất ổn định trong điều kiện khô hạn gọi là cây chịu hạn. Khả năng của thực vật có thể làm giảm mức độ tổn thương do thiếu nước gây ra gọi là tính chống chịu hạn. Có 2 loại hạn cơ bản: hạn thật (gồm hạn đất, hạn không khí, hạn toàn diện) và hạn sinh lý hạn đất là do lượng nước trong đất giảm làm hệ rễ cây không thể lấy nước từ đất vào tế bào, đã đến cây có hiện tượng bị héo lâu dài. Hạn không khí thường đặc trưng ở nhiệt độ cao (39oC - 42 oC) và độ ẩm thấp hơn 62%. Hạn không khí thường gây ra hiện tượng héo tạm thời, vì rễ không hút đủ nước mà quá trình thoát hơi nước xảy ra quá nhanh do nhiệt độ cao. Hạn sinh lý khác với 2 loại hạn trên ở chỗ môi trường vẫn đầy đủ nước nhưng do mất cân bằng áp suất thẩm thấu giữa môi trường tế bào và môi trường bên ngoài rễ nên rễ cây không có khả năng hút nước [10]. Khi gặp các điều kiện bất lợi về nước, thực vật có những phản ứng để có thể thích ứng, sinh trưởng và phát triển. Các cơ chế này khá đa dạng nhưng có thể chia thành ba cơ chế chủ đạo bao gồm: cơ chế trốn thoát điều kiện hạn (drought escape), cơ chế tránh hạn (drought avoiandgce) và cơ chế chống chịu hạn (drought tolerance). Cơ chế trốn thoát điều kiện hạn cho phép cây có thể hoàn thành chu kì sống của mình trong giai đoạn được cung cấp đủ nước trước khi hạn xảy ra. Các giống đậu tương ngắn ngày được trồng khá phổ biến ở khu vực Nam Mỹ chủ yếu sử dụng cơ chế này để thích ứng với các điều kiện bất lợi về nước. Các giống này có tính chín sớm và bắt đầu nở hoa vào cuối tháng 4 và tạo quả trong tháng 5, chính vì thế mà các giống này có thể hoàn thành chu kì sinh sản của mình trước khi tình trạng khan hiếm về nước xảy ra từ tháng 6 tới tháng 8. Đối với cơ chế tránh hạn thì các giống đậu tương sẽ có các cơ chế để duy trì lượng nước trong cơ thể trong giai đoạn hạn thông qua việc tăng khả năng hấp thu nước từ rễ hoặc giảm quá trình thoát hơi nước ở các bộ phận khác nhau của cây. Ở các giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn, thì cây có thể duy trì sức căng của các mô và tế bào, chính vì thế các quá trình trao đổi chất có thể diễn ra bình thường trong điều kiện lượng nước bên ngoài môi trường xuống rất
8 thấp. Sức căng của các mô và tế bào của cây được duy trì thông qua việc tổng hợp mạnh các chất chống áp suất thẩm thấu, các chất trao đổi [79]. 1.2.1. Tác động của hạn đến hệ rễ Bộ rễ là một trong những bộ phận quan trọng của cây thực hiện nhiệm vụ lấy nước cung cấp cho các hoạt động sống và phát triển của cơ thể thực vật. Ở cây đậu tương sự thích nghi với các điều kiện hạn hán chủ yếu thông qua việc phát triển rễ trụ để có thể tìm kiếm các nguồn nước từ các lớp đất sâu [80]. Bên cạnh đó hệ thống rễ sợi phát triển cũng giúp cho cây có thể vươn tới các lớp đất có độ ẩm cao và tìm kiếm các chất dinh dưỡng. Một trong những nhân tố chính ảnh hưởng đến độ sâu của rễ đậu tương là tỉ số kéo dài rễ trụ (taproot elongation rate). Do rễ trụ được hình thành đầu tiên ở đậu tương, chính vì thế việc xác định các giống đậu tương có đặc tính kéo dài rễ trụ nhanh sẽ cho phép xác định khả năng đâm sâu của rễ. Sự khác nhau về tính trạng kéo dài bộ rễ ở các giống đậu tương đã được nghiên cứu khá chi tiết ở trong điều kiện nhà lưới [81]. Đánh giá 105 giống đậu tương khác nhau cho thấy tỉ số kéo dài rễ trụ khác nhau giữa các giống vào khoảng 1,3cm/ngày. Những nghiên cứu tiếp theo trên các giống có tỉ số kéo dài rễ trụ cao cho thấy những giống này có thể lấy nước ở chiều sâu trên 120cm so với các giống còn lại. Một vài nghiên cứu cũng đã được thực hiện đối với hệ thống rễ nhánh của cây đậu tương cho thấy trong điều kiện hạn số lượng rễ nhánh trên đơn vị chiều dài rễ trụ tăng đáng kể, nhưng chiều dài và đường kính rễ trụ không thay đổi. Hạn chế về nước ở cây đậu tương thường làm tăng sinh khối của rễ, từ đó làm tăng tỉ lễ rễ : thân. Ở cây đậu tương không được tưới nước thì bộ rễ có chiều dài hơn hẳn ở cây đậu tương được tưới nước [82]. Ngoài ra các nhà khoa học cũng nhận thấy mối tương quan rất chặt chẽ đối với nhiều tính trạng rễ như khối lượng khô, chiều dài tổng số, cấu trúc và số lượng rễ nhánh ở các giống chịu hạn. Những tính trạng này thường được dùng như các chỉ tiêu quan trọng để đánh giá và nhận dạng các giống đậu tương có tính chịu hạn. 1.2.2. Tác động của hạn đến khả năng cố định đạm Các loài cây họ đậu thường rất nhạy cảm đối với tình trạng nước ở trong đất. Trong điều kiện hạn, cây đậu tương không chỉ giảm khả năng cố định CO2, giảm sự phát triển lá mà khả năng cố định nitơ cũng bị ảnh hưởng nghiêm trọng. Kết quả này
9 làm giảm sinh tổng hợp protein [83]. Nhiều nhân tố hạn chế khả năng cố định nitơ trong điều kiện hạn đã được xác định ở cây đậu tương bao gồm khả năng sử dụng O2 giảm, nguồn carbon tới các nốt sần giảm, hoạt tính của enzyme sucrose synthase giảm, hàm lượng ure và axit amin tự do tăng [84]. Đặc biệt, mối quan hệ về thế năng nước của lá và nốt sần đã được xác định ở cây đậu tương trong điều kiện hạn. Hoạt tính của enzym nitrogenase giảm 70% trong 4 ngày đầu tiên khi cây gặp hạn, trong khi đó quá trình quang hợp giảm khoảng 5%. Ngoài ra, sự thiếu hụt về nước cũng ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt tính của nốt sần thông qua sự tăng cường tính kháng đối với khả năng khuyếch tán oxy. Tình trạng thiếu nước ở trong đất cũng dẫn tới sự tích lũy ure ở lá của cây đậu tương và hậu quả này chính là một nhân tố ức chế quá trình hình thành nốt sần. Sự thay đổi về di truyền cũng được xác định ở các cá thể nhạy cảm với khả năng cố định nitơ trong điều kiện hạn. Khi so sánh các giống đậu tương có hoặc không có khả năng duy trì tính căng mô (tissue turgidity) dưới điều kiện hạn ở giai đoạn sinh trưởng sinh sản cho thấy, giống có khả năng duy trì tính căng mô tốt hơn có năng suất hạt tốt hơn với những giống còn lại (Hàm lượng ure ở cuống lá cũng là một trong những chỉ tiêu để sàng lọc các dòng cây đậu tương có khả năng tích lũy nitơ tốt hơn trong điều kiện khô hạn. Bằng việc sàng lọc số lượng lớn (>3000) dòng đậu tương dựa vào chỉ tiêu này, 8 dòng đậu tương có khả năng cố định nitơ tốt mang tính chịu hạn tốt hơn. Nghiên cứu sâu hơn các dòng đậu tương này [85] tìm ra rằng quá trình dị hóa ure không phụ thuộc vào Mn tồn tại ở 6 trong số 8 dòng nghiên cứu. Giống đậu tương Jackson, giống kháng hạn và có khả năng cố định nitơ cao, đã được dùng làm thể bố mẹ trong các cặp lai để tạo ra giống đậu tương có năng suất cao ở các điều kiện hạn. Hai dòng con lai từ các cặp lai này là nguồn gen tốt được dùng để cải thiện khả năng cố định nitơ và năng suất trong các điều kiện ngập úng. Cho đến nay, các nhà khoa học vẫn chưa thể giải thích được liệu khả năng cố định nitơ trong điều kiện hạn có được điều hòa ở mức độ cơ thể của cây đậu tương hay không hay quá trình này chỉ tồn tại khu trú trong nốt sần. Chúng ta đã biết rằng, tín hiệu điều hòa quá trình cố định nitơ là do cơ chế phản hồi bởi nitơ (nitrogen feedback mechanism) bao gồm cả trạng thái nitơ ở thân và lá.[84].
10 1.2.3. Tác động của hạn đến hình thái lá Lông tơ lá thường là một đặc điểm phổ biến của thực vật chịu hạn, cũng như một vài loại cây trồng, trong đó có đậu tương. Thông thường, độ dày lông tơ lá gia tăng hệ số phản xạ từ lá, dẫn đến giảm nhiệt độ của lá trong điều kiện chiếu sáng cao. Độ dày lông tơ lá là đặc điểm thích ứng quan trọng cho cây đậu tương dưới điều kiện khô hạn. Lông tơ dày đặc được tăng cường sức sinh trưởng, rễ dày đặc hơn và mở rộng xuống sâu hơn. Sự gia tăng độ dày lông tơ lá có thể làm tăng lớp ranh giới chống lại stress lên tới 50%, giảm nhiệt độ của lá, hạn chế thoát hơi nước và tăng cường quang hợp. Hơn nữa, sự gia tăng độ dày lông tơ có thể làm giảm đi đáng kể phạm vi ảnh hưởng bệnh khảm virus của đậu tương [86]. 1.3. GLYCINE BETAINE (GB) VÀ CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP GB 1.3.1. Cơ chế chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường ở thực vật Điều kiện bất lợi từ môi trường sống - stress (điều kiện bất lợi phi sinh học như mặn, hạn, lạnh, nhiệt độ cao, băng giá, v.v.) dẫn đến hàng loạt các thay đổi về hình thái, tính chất vật lý, hóa sinh, phân tử, điều đó ảnh hưởng xấu đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Để đảm bảo tính toàn vẹn và sống còn, nhiều loài thực vật có các chiến lược đối phó với những bất lợi phi sinh học khác nhau. Sự phản ứng của cơ thể sống với các yếu tố cực đoan phụ thuộc vào từng loài, kiểu gen, thời gian tác động và tính khốc liệt của yếu tố cực đoan, độ tuổi và giai đoạn phát triển, dạng đặc thù của các cơ quan hoặc tế bào và phần ngoại vi của chúng. Khi bị tác động bởi các yếu tố bất lợi của môi trường, thực vật sẽ tạo ra một số chất kích thích, protein giải độc hoặc hormone giúp chúng có khả năng thích ứng. Hiện nay, các nghiên cứu về cơ chế chống chịu các điều kiện bất lợi từ môi trường ở thực vật đang được tập trung vào hướng nghiên cứu làm tăng cường các chất giúp bảo vệ áp suất thẩm thấu của tế bào khỏi sự mất cân bằng về nước. Sự tăng cường các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu được phát hiện trong nhiều trường hợp môi trường bất lợi như hạn hán, muối mặn và lạnh giá [42], [67]. Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một đặc tính rất quan trọng của tế bào khi bị mất nước do lạnh, muối hoặc hạn. Những thực vật sống trong môi trường thiếu nước bị mất cân bằng về áp suất thẩm thấu trong tế bào đòi hỏi phải có khả năng chống chịu lại điều kiện khắc nghiệt đó.
11 Một trong những phương thức của thực vật chống lại sự mất cân bằng về áp suất thẩm thấu đó là dựa trên sự thay đổi trong chuyển hóa tế bào chất dẫn đến sự xuất hiện và tích lũy các chất hòa tan tương thích, protein hoặc các axit amin đặc hiệu [16]. Hiện tượng này xảy ra rất nhanh khi tế bào bị mất nước. Sự tích lũy các chất này không làm ảnh hưởng đến hoạt động bình thường của các enzyme nội bào. Ngược lại, sự tích lũy lượng lớn các chất hòa tan trong tế bào sẽ điều chỉnh áp suất thẩm thấu bằng tác động tổng thể mà chúng có khả năng giữ và lấy nước vào tế bào. Ngoài ra, chúng có thể thay thế vị trí nước nơi xảy ra các phản ứng hóa sinh, tương tác với lipit hoặc protein trong màng, ngăn chặn sự phá hủy màng tế bào và các phức hệ protein. Về mặt hóa học, chúng thường là những phân tử trung hòa về điện, có kích thước rất nhỏ, đóng vai trò quan trọng giúp các phân tử protein và màng tế bào chống lại sự biến tính dưới tác động của các điều kiện bất lợi phi sinh học [10]. Chất bảo vệ áp suất thẩm thấu hay các chất hòa tan tương thích được chia làm 4 nhóm chất sau đây: (1) GB là dẫn xuất methyl hóa nhóm nitơ của axit amin, (2) proline và ectoine (axit amin), (3) polyols và trehalose (là một hợp chất polyme không phải đường) và (4) các loại đường tan: glucose, sucrose, fructan, manitol và pinitol. GB, proline và các nhóm đường thực hiện chức năng như các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu và bảo vệ tế bào khỏi bị mất nước. Quá trình này liên quan đến một số enzyme chức năng đã được phân lập và phân tích về mặt sinh hóa như các enzyme chủ chốt tham gia sinh tổng hợp và chuyển hóa các chất điều hòa áp suất thẩm thấu, các enzyme giải độc và các loại protease khác. Protein vận chuyển nước qua màng, chất vận chuyển các đường đơn, proline và GB được xem như có chức năng chuyển nước, proline, GB, các chất đường đơn qua màng nguyên sinh chất và màng không bào để điều chỉnh áp suất thẩm thấu khi gặp điều kiện môi trường cực đoan. GB một hợp chất amoni bậc bốn, là một trong những chất hòa tan tương thích hiệu quả nhất và được tìm thấy trong một phạm vi rộng của các loài động vật, vi khuẩn và một số loài thực vật hạt kín chịu hạn hán và chịu mặn [36]. Trước đây GB đã được đề xuất, tăng tích lũy các betaine trong các loài thực vật đóng một vai trò sinh lý quan trọng làm giảm bớt căng thẳng thẩm thấu [70]. Trong tự nhiên, rau bina, ngô, củ cải đường và lúa mạch, nhanh chóng tích lũy GB xảy ra trong quá trình cây bị stress với muối, hạn hán và nhiệt độ thấp [19]. GB bảo vệ cây bằng cách hoạt động như một chất