Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tính kháng kháng sinh của Neisseria meningitidis tại các ổ dịch lưu hành trong quân đội

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:87

Thêm vào BST

Báo xấu

64
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận văn nhằm xác định đặc điểm sinh học và cơ cấu nhóm huyết thanh của Neisseria meningitidis phân lập tại một số đơn vị tân binh trong quân đội; xác định tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng Neisseria meningitidis phân lập từ người mang mầm bệnh không triệu chứng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tính kháng kháng sinh của Neisseria meningitidis tại các ổ dịch lưu hành trong quân đội

LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Khoa Sinh HọcTrường Đại Học Khoa Học Tự NhiênĐại Học Quốc Gia Hà Nội, đã hết lòng tạo điều kiện để chúng tôi có thể học tập tốt và đạt được những thành quả như ngày hôm nay. Đặc biệt, với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lơi cam ̀ ̉ ơn tơi th ́ ầy hướng dẫn TS. Đoàn Trọng Tuyên và GS.TS. Phạm Văn Ty đa tân tâm ̃ ̣ hương dân, giup đ ́ ̃ ́ ỡ, tao điêu kiên thuân l ̣ ̀ ̣ ̣ ợi đê tôi hoan thanh luân văn tôt ̉ ̀ ̀ ̣ ́ ̣ nghiêp. Tôi cung xin g ̃ ửi lơi cam ̀ ̉ ơn chân thanh nhât đên can bô nhân viên cua ̀ ́ ́ ́ ̣ ̉ khoa Vi sinh Vật viên Y h ̣ ọc Dự phòng Quân đội va Lanh đao ch ̀ ̃ ̣ ỉ huy viện ̃ ́ ỡ va tao điêu kiên đê tôi thu th đa giup đ ̀ ̣ ̀ ̣ ̉ ập số liệu, thực hiện nghiên cứu và hoan thanh lu ̀ ̀ ận văn tôt nghiêp. ́ ̣ Xin gửi tới Ban lãnh đạo Bệnh viện Phổi Hà Nội lời cảm ơn sâu sắc đã tạo điều kiện về thời gian để tôi có thể hoàn thành khóa học này. Một lần nữa, tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, bạn bè và toàn bộ những người thân trong gia đình đã luôn giúp đỡ nhiệt tình và động viên tôi trong suốt quá trình học tập. Học Viên Vũ Thị Xuân Thu
MỤC LỤC MỤC LỤC........................................................................2 DANH MỤC HÌNH................................................................................................................6 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT.........................................................................................1 NMC: Não mô cầu................................................................................................................1 VMN: Viêm màng não...........................................................................................................1 PS: Polysaccharide................................................................................................................1 LOS: Lipo – oligosaccharide..................................................................................................1 LPS: Lipopolysaccharide.......................................................................................................1 MỞ ĐẦU................................................................................................................................1 Chương 1................................................................................................................................3 TỔNG QUAN.........................................................................................................................3 1.1. Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh viêm màng não do Neisseria meningitidis.......3 1.1.1.Dịch tễ học của bệnh viêm màng não ................................................................4 1.1.2.Dịch tễ học người mang mầm bệnh không triệu chứng....................................5 1.2. Đặc điểm sinh học của N. meningitidis....................................................................6 1.2.1.Danh pháp và phân loại Não mô cầu [32]............................................................6 Hình 1.1: Hình ảnh nhuộm Gram N. meningitidis từ dịch não tủy[63]....................................7 1.2.2. Tính chất nuôi cấy...............................................................................................7 Hình 1.2:Khuẩn lạc N. meningitidis trên thạch chocolate. [63]...............................................8 Hình 1.3: Khuẩn lạc N. meningitidis trên thạch máu. [63]......................................................9 1.2.3. Sức đề kháng.......................................................................................................9 Hình 1.4: Hình ảnh màng tế bào N. meningitidis cắt ngang.[18]............................................9 1.3. Các kỹ thuật chẩn đoán phòng thí nghiệm..............................................................11 Hình 1.5: Hình ảnh nuôi cấy N. meningitidis trên môi trường thạch chocolate có kháng sinh ..............................................................................................................................................12 Hình1.6: Hình ảnh định danh N. meningitidis trên thanh định danh API NH.........................12 Hình 1.7 : Hình ảnh bộ sinh phẩm Pastorex phát hiện N. meningitidis.................................14 1.3.5. Kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện vi khuẩn gây viêm màng não ...........14 1.4. Đặc điểm gene đích phát hiện N. meningitidis......................................................15 Hình 1.8: Đặc điểm gene mã hóa kháng nguyên của N. meningitidis....................................16 1.5. Đặc điểm gene đích (gen đặc hiệu) xác định nhóm huyết thanh của N. meningitidis......................................................................................................................17 Hình 1.9 : Bản đồ gene capsule (CPS) của Nmen (14), ctrABCD operon mã hóa ATPprotein (khung kẻ ô). SynABC(màu ghi), D/E/F/G (chấm), sacABCD (sọc ngang), xcbABC (gạch chéo), mã hóa nhóm huyết thanhspecific enzymes cho tổng hợp capsule . oatC (nhóm huyết thanh C) và oatWY (nhóm huyết thanh W135 và Y), kết hợp sao chép cùng với syn operons và mã hóa Oacetyltransferases. lipA và lipB mã hóa protein. ctrE and ctrF được biết như LipA và LipB........................................................................................................................20 1.6. Đáp ứng miễn dịch...................................................................................................20
Bảng 1.3 . Protein màng ngoài của N. meningitidis...............................................................21 1.7. Điều trị và dự phòng.................................................................................................22 Bảng 1.4. Đặc điểm lâm sàng, chẩn đoán, điều trị nhiễm N. meningitidis...........................22 Chương 2..............................................................................................................................25 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................25 2.1. Đối tượng ................................................................................................................25 2.2. Vật liệu nghiên cứu..................................................................................................25 2.2.1.Thiết bị................................................................................................................25 2.2.2. Sinh phẩm..........................................................................................................25 2.3. Phương pháp nghiên cứu .........................................................................................26 2.3.1. Phương pháp dịch tễ học mô tả cắt ngang.......................................................26 2.3.2. Phương pháp thực nghiệm trong phòng thí nghiệm:.......................................26 Hình 2.1 : Thiết kế nghiên cứu đặc điểm sinh học của N. meningitidis.............................27 Bảng 2. 1. Các hóa chất gắn trong các giếng của thẻ định danh NH....................................27 Bảng 2.2: Trình tự mồi khảo sát phát hiện gene đích của N. meningitidis và các nhóm huyết thanh (A; B; C)...........................................................................................................32 Hình 2.2. Thanh E test...........................................................................................................35 Hình 2.3. Kết quả thử nghiệm MIC bằng E test...................................................................35 Bảng 2.3:Tiêu chuẩn đánh giá MIC theo hướng dẫn của Viện lâm sàng và chuẩn thức phòng thí nghiệm (CLSI) năm 2013[]...................................................................................35 Chương 3..............................................................................................................................37 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN........................................................................37 3.1. Đặc điểm sinh học và cơ cấu nhóm huyết thanh của Neisseria meningitidis phân lập tại một số đơn vị tân binh trong quân đội................................................................37 3.1.1. Đặc điểm sinh học của chủng Neisseria meningitidis phân lập tại các đơn vị tân binh trong quân đội ...............................................................................................37 Bảng 3.1. Đặc điểm chuyển hóa axit amin của N.meningitidis............................................37 theo nguồn gốc chủng trên thẻ định danh NH......................................................................37 Bảng 3.2. Đặc điểm chuyển hóa đường của N.meningitidis...............................................38 theo nguồn gốc chủng trên thẻ định danh NH ......................................................................38 theo nhóm huyết thanh B và C trên thẻ định danh NH..........................................................39 Bảng 3.4. Đặc điểm chuyển hóa đường của N.meningitidis...............................................39 theo nhóm huyết thanh B và C trên thẻ định danh NH.........................................................39 3.1.2. Cơ cấu nhiễm Neisseria meningitidis và các nhóm huyết thanh của các chủng Neisseria meningitidis phân lập tại các đơn vị tân binh trong quân đội bằng phương pháp PCR......................................................................................................................40 Bảng 3.5: Tỷ lệ nhiễm N. meningitidis và nhóm huyết thanh..............................................40 lưu hành tại 03 đơn vị giám sát.............................................................................................40 Bảng 3.6: Tần suất nhiễm N. meningitidis và nhóm huyết thanh.........................................41 theo trung đoàn......................................................................................................................41 Bảng 3.7: Tỷ lệ nhiễm N. meningitidis và nhóm huyết thanh theo địa phương nhập ngũ....43 Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra chủng N. meningitidis trên thanh NH và...................................45 cơ cấu nhóm huyết thanh bằng kỹ thuật MultiplexPCR.....................................................45
3.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh học phân tử của các chủng N.meningitidis phân lập được bằng các cặp mồi đặc hiệu loài và nhóm N.meningitidis thông qua phản ứng PCR..............................................................................................................................47 Lựa chọn 32 trong tổng số 61 chủng đã phân lập được ở trên tiến hành khảo sát đặc điểm sinh học phân tử bằng các cặp mồi đặc hiệu cho loài và nhóm N.meningitidis .............................................................................................................47 Hình 3.1: Khảo sát gene CtrA trên 32 chủng N. Meningitidis................................................48 Hình 3.2: Khảo sát gene ctrA trên 32 chủng N. Meningitidis................................................49 Hình 3.3: Tiếp tục khảo sát sự xuất hiện của gen ctrA trên 32 chủng ................................50 N. meningitidis......................................................................................................................50 Hình 3.4: Kết quả khảo sát sự có mặt của gene Por A trên 32 chủng ................................51 N. meningitidis phân lập được..............................................................................................51 Hình 3.5: Khảo sát gene CrgA mã hóa LysR của N. meningitidis trên 32..............................52 Hình 3.6: Khảo sát gene SodC trên 32 chủng N. meningitidis ..................................53 Khảo sát bằng các cặp mồi phát hiện nhóm N. Meningitidis...............................................54 Khảo sát cự có mặt của gene siaDc phát hiện nhóm A của N. meningitidis [31]..................54 Hình 3.7 : Khảo sát gene siaDc phát hiện N. meningitidis nhóm huyết thanh A, ..................55 Hình 3.8: Khảo sát gene siaDb phát hiện N. meningitidis nhóm B........................................56 Khảo sát cự có mặt của gene siaDc phát hiện nhóm huyết thanh C của N. meningitidis [31]. ..............................................................................................................................................56 Hình 3.9: Khảo sát gene siaDc phát hiện N. meningitidis nhóm C........................................57 3.2. Đánh giá sự nhậy cảm với kháng sinh của các chủng N. meningitidis nhóm huyết thanh B và C.....................................................................................................................57 Bảng 3.9: Xác định MIC của chủng Neisseria meningitidis, ................................................57 nhóm huyết thanh B (n=23)..................................................................................................57 Bảng 3.10: Kết quả thử nghiệm in vivo trên người nhiễm..................................................59 N. meningitidis, nhóm huyết thanh B...................................................................................59 Bảng 3.11 : Xác định MIC (in vitro) của chủng Neisseria meningitidis, ...............................59 nhóm huyết thanh C (n=4)...................................................................................................59 Bảng 3.12: Kết quả thử nghiệm in vivo trên người nhiễm..................................................60 N. meningitidis, nhóm huyết thanh C...................................................................................60 KẾT LUẬN...........................................................................................................................62 PHỤ LỤC.............................................................................................................................76
DANH MỤC BẢNG MỤC LỤC........................................................................2 DANH MỤC HÌNH................................................................................................................6 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT.........................................................................................1 NMC: Não mô cầu................................................................................................................1 VMN: Viêm màng não...........................................................................................................1 PS: Polysaccharide................................................................................................................1 LOS: Lipo – oligosaccharide..................................................................................................1 LPS: Lipopolysaccharide.......................................................................................................1 MỞ ĐẦU................................................................................................................................1 Chương 1................................................................................................................................3 TỔNG QUAN.........................................................................................................................3 Hình 1.1: Hình ảnh nhuộm Gram N. meningitidis từ dịch não tủy[63]....................................7 Hình 1.2:Khuẩn lạc N. meningitidis trên thạch chocolate. [63]...............................................8 Hình 1.3: Khuẩn lạc N. meningitidis trên thạch máu. [63]......................................................9 Hình 1.4: Hình ảnh màng tế bào N. meningitidis cắt ngang.[18]............................................9 Hình 1.5: Hình ảnh nuôi cấy N. meningitidis trên môi trường thạch chocolate có kháng sinh ..............................................................................................................................................12 Hình1.6: Hình ảnh định danh N. meningitidis trên thanh định danh API NH.........................12 Hình 1.7 : Hình ảnh bộ sinh phẩm Pastorex phát hiện N. meningitidis.................................14 Hình 1.8: Đặc điểm gene mã hóa kháng nguyên của N. meningitidis....................................16 Hình 1.9 : Bản đồ gene capsule (CPS) của Nmen (14), ctrABCD operon mã hóa ATPprotein (khung kẻ ô). SynABC(màu ghi), D/E/F/G (chấm), sacABCD (sọc ngang), xcbABC (gạch chéo), mã hóa nhóm huyết thanhspecific enzymes cho tổng hợp capsule . oatC (nhóm huyết thanh C) và oatWY (nhóm huyết thanh W135 và Y), kết hợp sao chép cùng với syn operons và mã hóa Oacetyltransferases. lipA và lipB mã hóa protein. ctrE and ctrF được biết như LipA và LipB........................................................................................................................20 Bảng 1.3 . Protein màng ngoài của N. meningitidis...............................................................21 Bảng 1.4. Đặc điểm lâm sàng, chẩn đoán, điều trị nhiễm N. meningitidis...........................22 Chương 2..............................................................................................................................25 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................25 Hình 2.1 : Thiết kế nghiên cứu đặc điểm sinh học của N. meningitidis.............................27 Bảng 2. 1. Các hóa chất gắn trong các giếng của thẻ định danh NH....................................27 Bảng 2.2: Trình tự mồi khảo sát phát hiện gene đích của N. meningitidis và các nhóm huyết thanh (A; B; C)...........................................................................................................32 Hình 2.2. Thanh E test...........................................................................................................35 Hình 2.3. Kết quả thử nghiệm MIC bằng E test...................................................................35 Bảng 2.3:Tiêu chuẩn đánh giá MIC theo hướng dẫn của Viện lâm sàng và chuẩn thức phòng thí nghiệm (CLSI) năm 2013[]...................................................................................35 Chương 3..............................................................................................................................37 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN........................................................................37 Bảng 3.1. Đặc điểm chuyển hóa axit amin của N.meningitidis............................................37 theo nguồn gốc chủng trên thẻ định danh NH......................................................................37 Bảng 3.2. Đặc điểm chuyển hóa đường của N.meningitidis...............................................38
theo nguồn gốc chủng trên thẻ định danh NH ......................................................................38 theo nhóm huyết thanh B và C trên thẻ định danh NH..........................................................39 Bảng 3.4. Đặc điểm chuyển hóa đường của N.meningitidis...............................................39 theo nhóm huyết thanh B và C trên thẻ định danh NH.........................................................39 Bảng 3.5: Tỷ lệ nhiễm N. meningitidis và nhóm huyết thanh..............................................40 lưu hành tại 03 đơn vị giám sát.............................................................................................40 Bảng 3.6: Tần suất nhiễm N. meningitidis và nhóm huyết thanh.........................................41 theo trung đoàn......................................................................................................................41 Bảng 3.7: Tỷ lệ nhiễm N. meningitidis và nhóm huyết thanh theo địa phương nhập ngũ....43 Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra chủng N. meningitidis trên thanh NH và...................................45 cơ cấu nhóm huyết thanh bằng kỹ thuật MultiplexPCR.....................................................45 Hình 3.1: Khảo sát gene CtrA trên 32 chủng N. Meningitidis................................................48 Hình 3.2: Khảo sát gene ctrA trên 32 chủng N. Meningitidis................................................49 Hình 3.3: Tiếp tục khảo sát sự xuất hiện của gen ctrA trên 32 chủng ................................50 N. meningitidis......................................................................................................................50 Hình 3.4: Kết quả khảo sát sự có mặt của gene Por A trên 32 chủng ................................51 N. meningitidis phân lập được..............................................................................................51 Hình 3.5: Khảo sát gene CrgA mã hóa LysR của N. meningitidis trên 32..............................52 Hình 3.6: Khảo sát gene SodC trên 32 chủng N. meningitidis ..................................53 Khảo sát bằng các cặp mồi phát hiện nhóm N. Meningitidis...............................................54 Khảo sát cự có mặt của gene siaDc phát hiện nhóm A của N. meningitidis [31]..................54 Hình 3.7 : Khảo sát gene siaDc phát hiện N. meningitidis nhóm huyết thanh A, ..................55 Hình 3.8: Khảo sát gene siaDb phát hiện N. meningitidis nhóm B........................................56 Khảo sát cự có mặt của gene siaDc phát hiện nhóm huyết thanh C của N. meningitidis [31]. ..............................................................................................................................................56 Hình 3.9: Khảo sát gene siaDc phát hiện N. meningitidis nhóm C........................................57 Bảng 3.9: Xác định MIC của chủng Neisseria meningitidis, ................................................57 nhóm huyết thanh B (n=23)..................................................................................................57 Bảng 3.10: Kết quả thử nghiệm in vivo trên người nhiễm..................................................59 N. meningitidis, nhóm huyết thanh B...................................................................................59 Bảng 3.11 : Xác định MIC (in vitro) của chủng Neisseria meningitidis, ...............................59 nhóm huyết thanh C (n=4)...................................................................................................59 Bảng 3.12: Kết quả thử nghiệm in vivo trên người nhiễm..................................................60 N. meningitidis, nhóm huyết thanh C...................................................................................60 KẾT LUẬN...........................................................................................................................62 PHỤ LỤC.............................................................................................................................76 DANH MỤC HÌNH MỤC LỤC........................................................................2 DANH MỤC HÌNH................................................................................................................6 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT.........................................................................................1 NMC: Não mô cầu................................................................................................................1 VMN: Viêm màng não...........................................................................................................1 PS: Polysaccharide................................................................................................................1
LOS: Lipo – oligosaccharide..................................................................................................1 LPS: Lipopolysaccharide.......................................................................................................1 MỞ ĐẦU................................................................................................................................1 Chương 1................................................................................................................................3 TỔNG QUAN.........................................................................................................................3 Hình 1.1: Hình ảnh nhuộm Gram N. meningitidis từ dịch não tủy[63]....................................7 Hình 1.2:Khuẩn lạc N. meningitidis trên thạch chocolate. [63]...............................................8 Hình 1.3: Khuẩn lạc N. meningitidis trên thạch máu. [63]......................................................9 Hình 1.4: Hình ảnh màng tế bào N. meningitidis cắt ngang.[18]............................................9 Hình 1.5: Hình ảnh nuôi cấy N. meningitidis trên môi trường thạch chocolate có kháng sinh ..............................................................................................................................................12 Hình1.6: Hình ảnh định danh N. meningitidis trên thanh định danh API NH.........................12 Hình 1.7 : Hình ảnh bộ sinh phẩm Pastorex phát hiện N. meningitidis.................................14 Hình 1.8: Đặc điểm gene mã hóa kháng nguyên của N. meningitidis....................................16 Hình 1.9 : Bản đồ gene capsule (CPS) của Nmen (14), ctrABCD operon mã hóa ATPprotein (khung kẻ ô). SynABC(màu ghi), D/E/F/G (chấm), sacABCD (sọc ngang), xcbABC (gạch chéo), mã hóa nhóm huyết thanhspecific enzymes cho tổng hợp capsule . oatC (nhóm huyết thanh C) và oatWY (nhóm huyết thanh W135 và Y), kết hợp sao chép cùng với syn operons và mã hóa Oacetyltransferases. lipA và lipB mã hóa protein. ctrE and ctrF được biết như LipA và LipB........................................................................................................................20 Bảng 1.3 . Protein màng ngoài của N. meningitidis...............................................................21 Bảng 1.4. Đặc điểm lâm sàng, chẩn đoán, điều trị nhiễm N. meningitidis...........................22 Chương 2..............................................................................................................................25 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................25 Hình 2.1 : Thiết kế nghiên cứu đặc điểm sinh học của N. meningitidis.............................27 Bảng 2. 1. Các hóa chất gắn trong các giếng của thẻ định danh NH....................................27 Bảng 2.2: Trình tự mồi khảo sát phát hiện gene đích của N. meningitidis và các nhóm huyết thanh (A; B; C)...........................................................................................................32 Hình 2.2. Thanh E test...........................................................................................................35 Hình 2.3. Kết quả thử nghiệm MIC bằng E test...................................................................35 Bảng 2.3:Tiêu chuẩn đánh giá MIC theo hướng dẫn của Viện lâm sàng và chuẩn thức phòng thí nghiệm (CLSI) năm 2013[]...................................................................................35 Chương 3..............................................................................................................................37 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN........................................................................37 Bảng 3.1. Đặc điểm chuyển hóa axit amin của N.meningitidis............................................37 theo nguồn gốc chủng trên thẻ định danh NH......................................................................37 Bảng 3.2. Đặc điểm chuyển hóa đường của N.meningitidis...............................................38 theo nguồn gốc chủng trên thẻ định danh NH ......................................................................38 theo nhóm huyết thanh B và C trên thẻ định danh NH..........................................................39 Bảng 3.4. Đặc điểm chuyển hóa đường của N.meningitidis...............................................39 theo nhóm huyết thanh B và C trên thẻ định danh NH.........................................................39 Bảng 3.5: Tỷ lệ nhiễm N. meningitidis và nhóm huyết thanh..............................................40 lưu hành tại 03 đơn vị giám sát.............................................................................................40 Bảng 3.6: Tần suất nhiễm N. meningitidis và nhóm huyết thanh.........................................41 theo trung đoàn......................................................................................................................41
Bảng 3.7: Tỷ lệ nhiễm N. meningitidis và nhóm huyết thanh theo địa phương nhập ngũ....43 Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra chủng N. meningitidis trên thanh NH và...................................45 cơ cấu nhóm huyết thanh bằng kỹ thuật MultiplexPCR.....................................................45 Hình 3.1: Khảo sát gene CtrA trên 32 chủng N. Meningitidis................................................48 Hình 3.2: Khảo sát gene ctrA trên 32 chủng N. Meningitidis................................................49 Hình 3.3: Tiếp tục khảo sát sự xuất hiện của gen ctrA trên 32 chủng ................................50 N. meningitidis......................................................................................................................50 Hình 3.4: Kết quả khảo sát sự có mặt của gene Por A trên 32 chủng ................................51 N. meningitidis phân lập được..............................................................................................51 Hình 3.5: Khảo sát gene CrgA mã hóa LysR của N. meningitidis trên 32..............................52 Hình 3.6: Khảo sát gene SodC trên 32 chủng N. meningitidis ..................................53 Khảo sát bằng các cặp mồi phát hiện nhóm N. Meningitidis...............................................54 Khảo sát cự có mặt của gene siaDc phát hiện nhóm A của N. meningitidis [31]..................54 Hình 3.7 : Khảo sát gene siaDc phát hiện N. meningitidis nhóm huyết thanh A, ..................55 Hình 3.8: Khảo sát gene siaDb phát hiện N. meningitidis nhóm B........................................56 Khảo sát cự có mặt của gene siaDc phát hiện nhóm huyết thanh C của N. meningitidis [31]. ..............................................................................................................................................56 Hình 3.9: Khảo sát gene siaDc phát hiện N. meningitidis nhóm C........................................57 Bảng 3.9: Xác định MIC của chủng Neisseria meningitidis, ................................................57 nhóm huyết thanh B (n=23)..................................................................................................57 Bảng 3.10: Kết quả thử nghiệm in vivo trên người nhiễm..................................................59 N. meningitidis, nhóm huyết thanh B...................................................................................59 Bảng 3.11 : Xác định MIC (in vitro) của chủng Neisseria meningitidis, ...............................59 nhóm huyết thanh C (n=4)...................................................................................................59 Bảng 3.12: Kết quả thử nghiệm in vivo trên người nhiễm..................................................60 N. meningitidis, nhóm huyết thanh C...................................................................................60 KẾT LUẬN...........................................................................................................................62 PHỤ LỤC.............................................................................................................................76
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT NMC: Não mô cầu VMN: Viêm màng não PS: Polysaccharide LOS: Lipo – oligosaccharide LPS: Lipopolysaccharide OMP: OuRer membrase protein PCR: Polymerase chain reaction MIC Minimum inhibition concentration VSV: Vi sinh vật
MỞ ĐẦU Viêm màng não là một bệnh lý nhiễm trùng nghiêm trọng, tỷ lệ tử vong cao nếu không được nghĩ đến, không chẩn đoán và điều trị kịp thời. Sự hiểu biết về các tác nhân gây bệnh thường gặp, sẽ hỗ trợ cho công tác điều trị và xây dựng các chương trình phòng chống bệnh tật tại từng Quốc gia. Hầu hết những dữ liệu về dịch tễ của viêm màng não mủ ở người lớn đều xuất phát từ những quốc gia đã phát triển, trong đó 4 tác nhân gây bệnh thường gặp nhất là: Streptococcus pneumoniae (30%60%), Neisseria meningitidis (1337%), Listeria monocytogenes và Haemophilus influenzae. Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae type b (Hib) và Streptococcus pneumoniae là loại vi khuẩn có vỏ (polysaccharide encapsuleated) là nguyên nhân quan trọng gây bệnh và tử vong trên thế giới [23] Hàng năm có từ 400.000 – 500.000 người chết do viêm màng não (WHO, 2006). Trong thời gian cuối thế kỷ 20 và đầu thế kỷ 21, đã có sự chuyển đổi trong việc chẩn đoán các tác nhân sinh học, kết hợp kiểu hình và huyết thanh học với việc xác định kiểu gene bằng các kỹ thuật sinh học phân tử [39]. Phân tích tính đa dạng về tổ hợp trình tự nhiều vùng gene (MLST) là tiêu chuẩn vàng cho việc xác định các đặc điểm của vi khuẩn N. meningitidis phục vụ công tác giám sát dịch tễ học. Sự phát triển của các kỹ thuật phân tử cho phép phân tích vi khuẩn gây viêm màng não từ mẫu nuôi cấy phân lập và không phân lập để chẩn đoán xác định được ca bệnh và nó trở thành công cụ hữu ích cho nâng cao chất lượng giám sát, phát hiện và tiên lượng dịch, đây là chiến lược phòng ngừa chính ở các nước Châu âu . 1
Nhằm nâng cao chất lược, hiệu quả của việc phát hiện tác nhân trên cơ sở xác định đặc điểm về cả kiểu hình và kiểu gene của Neisseria meningitidis là hết sức quan trọng giúp tiên lượng, dự báo dịch và đề xuất phác đồ dự phòng, điều trị nhằm hạn chế được tỷ lệ nhiễm N. meningitidis, mắc bệnh trong cộng đồng. Với đề tài nghiên cứu: “ Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tính kháng kháng sinh của Neisseria meningitidis tại các ổ dịch lưu hành trong quân đội. Với mục tiêu: 1. Xác định đặc điểm sinh học và cơ cấu nhóm huyết thanh của Neisseria meningitidis phân lập tại một số đơn vị tân binh trong quân đội. 2. Xác định tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng Neisseria meningitidis phân lập từ người mang mầm bệnh không triệu chứng 2
Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh viêm màng não do Neisseria meningitidis Năm 1884 Ettore Marchiafava và Angelo Celli lần đầu tiên quan sát được vi khuẩn trong tế bào ở dịch não tủy. Năm 1887 Anton Weichselbaum phân lập được vi khuẩn từ dịch não tủy của bệnh nhân viêm màng não do vi khuẩn và đặt tên là: Diplococcus intracellularis meningitidis. Sau đó, năm 1901 Albrecht và Ghon đã đổi thành Neisseria meningitidis để ghi công Albert neisser nhà khoa học người Đức. N. meningitidis cư trú ở đường hô hấp của người, tỷ lệ gây bệnh chiếm 1/100.000 người và tỷ lệ người mang mầm bệnh là 1/10 người. Não mô cầu tồn tại trong đường hầu họng nhờ pili gắn vào các thụ thể của người [11]. Bệnh xảy ra chỉ khi não mô cầu vượt qua biểu mô đường hô hấp để vào máu. Chúng là nguyên nhân gây nhiễm khuẩn huyết (nhiễm trùng máu) và nếu vi khuẩn vượt qua hàng rào máu não gây viêm màng não, viêm não. Khi điều trị bệnh tỷ lệ tử vong do viêm màng não chung là: 11% [28], trong đó viêm màng não đơn thuần là 5%. Hầu hết các trường hợp chết do viêm màng não có nguyên nhân từ nhiễm khuẩn huyết. Bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết nhưng không có hội chứng màng não có tỷ lệ tử vong là 20%, nhưng nếu kèm theo sốc thì tỷ lệ tử vong chiếm đến 50%. Trong nhiễm khuẩn não mô cầu 15% thể viêm màng não tiến triển nhanh từ khi xuất hiện triệu chứng đầu tiên đến khi tử vong. Khởi phát của viêm màng não kết hợp với đau họng, đau đầu, ngủ lơ mơ, sốt, kích thích, cứng gáy. Độc tố của vi khuẩn trong dịch não tủy gây viêm và gây hôn mê. 3
Thể nhiễm khuẩn huyết biểu hiện lâm sàng như: ban xuất huyết ngoài da và không mờ đi khi làm dấu hiệu dây thắt. Theo thống kê có 35% bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết có biều hiện nặng như đông cục máu ở tĩnh mạnh ngoại vi, ngập hệ tuần hoàn cùng với nội độc tố, sốc và bí niệu. Trong hầu hết các trường hợp có thể xảy ra xuất huyết não và tuyến thượng thận [13]. N. meningitidis là vi khuẩn Gram (), cần phải điều trị tích cực ngay bằng kháng sinh penicillin, ampicillin hoặc chloramphenicol. Nếu không điều trị tỷ lệ tử vong do bệnh viêm màng não 100%. Sau giai đoạn cấp của viêm màng não bệnh nhân được điều trị bằng rifampin để làm sạch vi khuẩn ở hầu họng và người tiếp xúc gần với bệnh nhân cũng được điều trị dự phòng bằng rifampin [13]. 1.1.1.Dịch tễ học của bệnh viêm màng não Sự lưu hành của bệnh viêm màng não có sự khác nhau trên toàn cầu, theo mùa khí hậu, và tuổi mắc bệnh, qui mô dịch tễ học của bệnh là ranh giới của các quốc gia gần nhau thì không có sự khác biệt dịch tễ học của bệnh, cho đến nay xét về lịch sử của bệnh viêm màng não đã có 7 vụ dịch lớn mang tính chất toàn cầu và ảnh hưởng tới một số nước trong một khoảng thời gian. Viêm màng não thường xuyên bùng phát ở Cận Saharan – Châu Phi, lứa tuổi thường mắc là 812, tỷ lệ 500 ca bệnh/100.000 dân [67]. Dịch bùng phát ở các nước phát triển ở đại chiến thế giới lần thứ II, gồm các nước Châu Âu, Bắc Mỹ. Trong những năm 1970 dịch bùng phát ở Na Uy với cường độ tấn công là 10 ca bệnh/100.000 dân, sau đó lan truyền dọc Châu Âu bao gồm: Nước Anh và vươn ra các nước xa hơn như: Cuba, Chile và Brazil. Năm 1987 vụ dịch giết chết nhiều người trong các lễ hành hương từ thánh địa HaJ đến Mecca và lan rộng trên toàn cầu, khi họ quay về đất 4
nước họ [67]. Bệnh viêm màng não ở các nước phát triển nhìn chung có đặc điểm: xảy ra lác đác, không thường xuyên cùng với cường độ tấn công 1/100.000 dân . Bệnh dịch bùng phát do ảnh hưởng của việc thay đổi khí hậu: Ở Châu Phi dịch bùng phát vào mùa khô, trong thời gian khí hậu đặc trưng này biểu hiện: độ ẩm, bụi, mưa rào và gió thay đổi, dẫn đến thay đổi về hành vi hoạt động của con người, sau các đợt gió khô, bụi ở vùng cận Saharan là đến mùa mưa. Ngược với khí hậu này ở Châu Âu và Bắc Mỹ thì tỷ lệ mắc bệnh cao trong các tháng mùa đông và thấp ở các tháng mùa thu . Rất nhiều các tác nhân vi khuẩn và nhiễm virus xẩy ra trong cùng mùa, nhưng lứa tuổi là yếu tố quan trong tỷ lệ mắc bệnh viêm màng não. Bệnh viêm màng não tác động chủ yếu đến trẻ dưới 5 tuổi: đỉnh cao ở trẻ 6 tháng tuổi và suy giảm ở nhóm lứa tuổi cao hơn . Ví dụ: Bệnh viêm màng não ở Mỹ, ở nhóm 1 tuổi chỉ chiếm ½ so với nhóm 4 tuổi (Centers for Disease Control and Prevention 2000), và tỷ lệ tử vong lại xảy ra đáng kể ở trẻ vị thành niên ở Mỹ và Anh là tương đương. 1.1.2.Dịch tễ học người mang mầm bệnh không triệu chứng Người mang mầm bệnh không triệu chứng cao hơn tỷ lệ mắc bệnh. Tỷ lệ người mang ở Mỹ và Châu Âu khoảng 10% 7],[10], cao gấp 10.000 lần tỷ lệ mắc bệnh. Tuy nhiên trong nhà khép kín hoặc một cộng đồng sinh hoạt khép kín thì tỷ lệ mang mầm bệnh còn cao hơn: các đơn vị quân đội, trường học, nhà tù thì tỷ lệ người mang mầm bệnh có thể đạt 50% . Mô hình người mang mầm bệnh liên quan tới cường độ bệnh, phân vùng địa lý, ảnh hưởng của khí hậu và lứa tuổi cảm nhiễm. Mùa viêm màng não ở Châu Á và Châu Phi thường xuất hiện liên quan tới sự thay đổi mùa khí hậu đã được báo cáo ở Nigeria và India . Tương tự như vậy, tỷ lệ người 5
mang mầm bệnh trong vùng khí hậu ôn đới thường không xuất hiện theo sự thay đổi mùa đã được nghiên cứu ở Bỉ và Mỹ ; Hà Lan, tỷ lệ người mang mầm bệnh cao phản ánh nguy cơ dịch lớn, có thể lên tới 70% trong một số bệnh gây dịch. Tuổi mắc mang mầm bệnh ở Anh, năm 1986 có sự khác biệt giữa các nhóm tuổi : thấp ở lứa tuổi nhỏ và trẻ vị thành niên và cao đến 25% ở lứa tuổi từ 1319 tuổi và từ 2029 tuổi. Sự tương phản đầu tiên quan sát thấy là tỷ lệ tử vong cao ở trẻ dưới 5 tuổi và thấp hơn là tỷ lệ mang N. lactamica cao ở tuổi ẵm ngửa [14]. 1.2. Đặc điểm sinh học của N. meningitidis 1.2.1.Danh pháp và phân loại Não mô cầu [32] Danh pháp khoa học Giới (Kingdom): Bacteria Họ (Family): Neisseriaceae Ngành (Phylum): Proteobacteria Chi (Genus): Nesseria Lớp (Class): Beta Proteobacteria Loài (Species): N. meningitidis Bộ (Ordo): Neisseriales Nhóm huyết thanh: A, B, C, D, 29E, H, I,L,W135,X,Y,Z Tên gọi não mô cầu theo danh pháp quốc tế: Neisseria meningitidis. Bảng 1.1. Đặc điểm sinh học của Neisseria meningitidis Chi Loài đặc trưng Nhuộm Hình thể Tạo Sắp Di Hô Môi Trong/ ngoài Gram vỏ xếp động hấp trường tế bào phát triển 6
Neiss N. gonorrhoeae Gram () Hình hạt Tạo vỏ Phế Không Hiếu Thayer Gonococcus: eria N. meningitidis cà phê, hai hoặc cầu di khí Martin trong tế bào mặt dẹt không khuẩn động N.meningitidis: đối xứng ngoại bào nhau Não mô cầu là cầu khuẩn Gram âm, kích thước thay đổi, có thể thấy ở dạng đơn độc hoặc song cầu hình hạt cà phê với hai mặt dẹt đối diện nhau và có thể nằm trong hoặc ngoài bạch cầu đa nhân, không lông, không sinh bào tử, đa số các chủng đều có vỏ. Hình 1.1: Hình ảnh nhuộm Gram N. meningitidis từ dịch não tủy[63]. 1.2.2. Tính chất nuôi cấy Tính chất nuôi cấy Não mô cầu là vi khuẩn hiếu khí, phát triển ở môi trường có 5% thạch máu, thạch ThayerMartin cải tiến hoặc môi trường chocolate, ở nhiệt độ 35370C, khí trường 57% CO2. Trên thạch máu, khuẩn lạc nhỏ, 7
tròn, mờ đục, lồi, màu hơi trắng xám, không tan máu, đường kính 1 3 mm. Khi dùng que cấy đẩy, khuẩn lạc trượt dễ dàng trên mặt thạch. Phân biệt vi khuẩn não mô cầu thông thường được căn cứ trên hình dạng, kết quả nhuộm Gram, các thử nghiệm sinh hoá: phản ứng oxidase và catalase dương tính, lên men đường glucose, maltose nhưng không lên men đường sucrose hay lactose. Hình 1.2:Khuẩn lạc N. meningitidis trên thạch chocolate. [63]. 8
Hình 1.3: Khuẩn lạc N. meningitidis trên thạch máu. [63] 1.2.3. Sức đề kháng Não mô cầu có sức đề kháng yếu: chỉ sống được trong bệnh phẩm dịch não tủy khoảng 3 – 4 giờ sau khi ra khỏi cơ thể. Bị tiêu diệt ngay bởi tia cực tím, dung dịch Cloramin B 0,5 – 1% hoặc cồn 70 0. Ở nhiệt độ 550C/30 phút hoặc ở 600C/10 phút Não mô cầu cũng bị tiêu diệt. Não mô cầu có sức đề kháng yếu với điều kiện khô và ánh sáng, dễ bị tiêu diệt bởi các thuốc sát trùng thông thường. 1.2.4. Nh ững kháng nguyên quan trọng của Não mô cầu [2], [5], [9], [62]. Màng tế bào chất Protein màng tế bào chất Khoảng gian màng Màng ngoài tế bào Por A Lipooligosaccharide Por B Pili Vỏ Protein màng ngoài Phospholipid Hình 1.4: Hình ảnh màng tế bào N. meningitidis cắt ngang.[18] Lớp polysaccharide (PS) nang: là kháng nguyên vỏ, có tác dụng tạo kháng thể bảo vệ (ngoại trừ nhóm B). Căn cứ vào tính không đồng nhất về 9
cấu trúc và tính kháng nguyên của PS người ta đã tìm được 13 nhóm huyết thanh của cầu khuẩn màng não bao gồm: A, B, C, D, 29E, H, I, K, L, W135, X, Y, Z. Nhóm huyết thanh A chứa mannosamine phosphate, trong khi đó nhóm huyết thanh B, C, Y, W135 chứa acid sialic chất đóng vai trò quan trọng trong sự tồn tại và độc tính. Polysaccharide vỏ của nhóm huyết thanh B và C bao gồm homopolymer của acid N acetyl neuraminic liên kết với α 2,8 và α 2,9. Sự khác nhau nhỏ trong cấu trúc dẫn đến các đặc tính miễn dịch khác nhau một cách rõ ràng: trong khi cấu trúc α 2,9 là kháng nguyên mạnh đối với cơ thể và sinh ra kháng thể bảo vệ thì α 2,8 lại có tính kháng nguyên rất yếu. Lớp lipo oligosaccharide (LOS) Endotoxin Cấu tạo của LOS gồm 1 glycolipid màng ngoài nhưng khác với lipopolysaccharide (LPS) của Enterobacteriaceae vì thiếu các chuỗi O đặc trưng và hình thái “xù xì” (ráp) tương tự như của LPS. Nó bao gồm 3 thành phần chính: oligosaccharide nhân; lipid A kỵ nước (thành phần gây độc); một chuỗi oligosaccharide nhánh có thể thay đổi (thành phần tạo miễn dịch). gene glycosytranspherase (lgt) trên nhiễm sắc thể đảm nhiệm việc sinh tổng hợp của các chuỗi oligosaccharide khác nhau. 4 glycosyltranspherase (lgtA, lgtC, lgtD và lgtG), sử dụng để phân loại các chủng thành 12 type miễn dịch khác nhau. Type miến dịch L1 L8 liên quan chi phối đầu tiên tới não mô cầu nhóm huyết thanh B, C, trong khi đó type miễn dịch L9 L12 liên quan đến các chủng não mô cầu nhóm A. Gene truyền ngang của các Neisseria hoại sinh chi phối tính đa dạng về gene của vị trí lgt.[] Màng ngoài chứa hơn 50% LOS, nó tương tự như polysaccharide của vi khuẩn Gram âm và chứa lipid A Lớp protein của màng ngoài (PorA và PorB): đặc hiệu type huyết 10
thanh và phân type huyết thanh Màng ngoài não mô cầu chứa một số protein màng ngoài chính (OMPs): chức năng của PorB (tên trước đây là protein lớp 2/3) và PorA (protein lớp 1) như porin, cho phép các chất dinh dưỡng đi vào. Giống như hầu hết các kháng nguyên bộc lộ trên bề mặt não mô cầu, độ lớn của kháng nguyên giữa các chủng là khác nhau, do đó có thể sử dụng chúng để phân loại não mô cầu thành các nhóm huyết thanh và phân nhóm huyết thanh. Các chủng N. meningitidis được phân chia thành trên 20 nhóm huyết thanh và phân nhóm huyết thanh khác nhau chủ yếu ở nhóm huyết thanh B, C. Nhiều chủng phân lập không thể phân loại được là nhóm huyết thanh hay phân nhóm huyết thanh bằng kháng thể đơn dòng hiện tại. Cấu trúc kháng nguyên của nhóm huyết thanh và phân nhóm huyết thanh thay đổi in vivo một cách nhanh chóng trên một cá thế người và trong cộng đồng. Các vòng ( mạch) có thể thay đổi trên bề mặt lộ diện của cả hai porins, có thể thay đổi về mặt kháng nguyên bằng cách thêm vào hoặc bớt đi aminoacid hoặc bằng cách truyền ngang các mảnh phụ của các gene đại diện. Sự thay đổi này làm cho việc phát triển vắc xin mới là hết sức khó khăn. Kháng nguyên X: kháng nguyên này chung với cầu khuẩn lậu, cầu khuẩn phổi. Kháng nguyên này được dùng trong một số kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh. 1.3. Các kỹ thuật chẩn đoán phòng thí nghiệm 1.3.1. Kỹ thuật nhuộm soi Các thử nghiệm nhanh phất hiện NMC có thể dương tính, là cơ sở cho liệu pháp sử dụng kháng sinh trước đó. Một số lượng nhỏ mẫu dịch não tủy gửi đến phòng thí nghiệm càng sớm các tốt để phân tích. Kết quả chẩn đoán nghi ngờ khi: Nhuộm gram mẫu dịch não tủy ly tâm cho thấy, hình 11