intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột bởi Mucoraceae trong sản xuất rượu truyền thống Việt Nam

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:81

Thêm vào BST
Báo xấu
60
lượt xem 8
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột bởi Mucoraceae trong sản xuất rượu truyền thống Việt Nam được thực hiện với mục tiêu nhằm phân lập vi nấm từ men rượu truyền thống Việt Nam, phân nhóm vi nấm bằng PCR-fingerprinting và định tên chủng đại diện bằng giải trình tự rDNA, đánh giá hoạt tính amylase của nấm mốc thuộc họ Mucoraceae,... Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột bởi Mucoraceae trong sản xuất rượu truyền thống Việt Nam

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ QUYÊN NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TINH BỘT BỞI MUCORACEAE TRONG SẢN XUẤT RƯỢU TRUYỀN THỐNG VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2019
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ QUYÊN NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TINH BỘT BỞI MUCORACEAE TRONG SẢN XUẤT RƯỢU TRUYỀN THỐNG VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Vũ Nguyên Thành PGS.TS Bùi Thị Việt Hà Hà Nội - 2019
  3. LỜI CẢM ƠN Luận văn Thạc sĩ này được em thực hiện tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp – Viện Công nghiệp thực phẩm, để có được những kết quả này em xin chân thành cảm ơn Thầy PGS.TS Vũ Nguyên Thành và Cô PGS.TS Bùi Thị Việt Hà - những người thầy đã luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, tạo mọi điều kiện giúp em thực hiện luận văn. Để có được nền tảng kiến thức khoa học tốt, phục vụ trong nghiên cứu này em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã luôn tận tình truyền đạt kiến thức, chỉ bảo cho em trong suốt thời gian sinh viên và học viên cao học. Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị cán bộ tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp - Viện Công nghiệp Thực phẩm đã luôn giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệp, hỗ trợ kỹ thuật trong suốt thời gian qua. Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân và bạn bè, những người luôn động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để em yên tâm học tập và nghiên cứu khoa học. Hà Nội, ngày 11 tháng 12 năm 2019 Học viên Lê Thị Quyên i
  4. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. iv DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... v DANH SÁCH KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT..................................................... vi MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN..................................................................................... 3 1.1. Giới thiệu về rượu truyền thống ........................................................................... 3 1.1.1. Men rượu ........................................................................................................... 3 1.1.2. Các giai đoạn lên men rượu .............................................................................. 5 1.2 Giới thiệu về họ Mucoraceae ................................................................................ 9 1.3. Tình hình nghiên cứu về rượu truyền thống Việt Nam ...................................... 11 1.4. Giới thiệu về sắc kí khí kết nối khối phổ (GCMS) ............................................ 12 1.5. Ứng dụng phương pháp HS-SPME GCMS trong phân tích các hợp chất tạo hương của đồ uống .................................................................................................... 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 16 2.1. Đối tượng ........................................................................................................... 16 2.2. Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị máy móc ........................................................ 16 2.2.1. Hóa chất .......................................................................................................... 16 2.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc ................................................................ 17 2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 17 2.3.1. Phương pháp phân lập .................................................................................... 17 2.3.2. Làm sạch và giữ giống .................................................................................... 17 2.3.3. Chụp ảnh hình thái khuẩn lạc, tế bào ............................................................. 18 2.3.4. Phương pháp tách chiết DNA tế bào nấm mốc, nấm men, giả men ............... 18 2.3.5. Phương pháp tinh chế DNA ............................................................................ 18 2.3.6. Phương pháp tiến hành phản ứng PCR fingerprinting ................................... 19 2.3.7. Phương pháp điện di ....................................................................................... 20 2.3.8. Nhuộm gel và đọc kết quả ............................................................................... 20 2.3.9. Phương pháp phân loại nấm dựa vào đọc trình tự rDNA .............................. 20 ii
  5. 2.3.10. Phân tích hoạt lực enzyme amylase từ các chủng mốc ................................. 21 2.3.11 Kiểm tra khả năng chịu nhiệt của các chủng mốc đại diện ........................... 23 2.3.12. Kiểm tra sự thủy phân tinh bột của một số nhóm mốc khi có đường............ 23 2.3.13. Lên men rượu từ các chủng mốc và men thuần chọn lọc.............................. 24 2.3.14. Đo độ cồn bằng sôi kế ................................................................................... 25 2.3.15. Phân tích phổ hương của các mẫu rượu gạo chưng cất bằng máy sắc ký khí kết nối khối phổ GCMS. ............................................................................................ 26 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 28 3.1. Kết quả phân lập vi nấm từ 15 bánh men........................................................... 28 3.2. Kết quả hình thái khuẩn lạc, tế bào. ................................................................... 28 3.3. Phân nhóm bằng kỹ thuật PCR-fingerprinting và định danh chủng nấm đại diện dựa vào phân tích trình tự rDNA .............................................................................. 34 3.4. Phân tích hoạt lực enzyme amylase bằng DNS ................................................. 39 3.5. Kiểm tra khả năng chịu nhiệt của các chủng mốc đại diện ................................ 43 3.6. Kết quả sự thủy phân tinh bột của một số nhóm mốc khi có đường.................. 45 3.7. Kết quả lên men rượu từ các chủng nấm mốc và nấm men thuần. .................... 47 3.8.Phân nhóm mẫu rượu dựa trên kết quả các hợp chất bay hơi trong các mẫu rượu thu thập và các mẫu sử dụng chủng thuần. ............................................................... 49 KẾT LUẬN .............................................................................................................. 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 55 PHỤ LỤC ................................................................................................................. 59 iii
  6. DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các loại giống khởi động để lên men đồ uống có cồn ở Châu Á ................. 4 Bảng 2.1. Tỷ lệ bổ sung giống ở mỗi mẫu lên men ............................................................25 Bảng 3.1. Kết quả phân nhóm các chủng bằng fingerprinting và đọc trình tự các chủng đại diện ...................................................................................................................... 36 Bảng 3.2. Hoạt lực enzyme amylase của các chủng mốc thuần ............................... 39 Bảng 3.3. Kích cỡ khuẩn lạc trên môi trường tinh bột 1% ở các nhiệt độ ................ 44 Bảng 3.4. Kết quả đo độ cồn của dịch lên men rượu từ các chủng thuần và 15 mẫu bánh men ................................................................................................................... 47 Bảng 3.5. Các nhóm hợp chất xuất hiện trong các mẫu rượu ................................... 50 iv
  7. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Một quy trình truyền thống làm men rượu ở Việt Nam ..............................5 Hình 1.2. Quá trình thủy phân tinh bột bởi các enzyme amylase ...............................6 Hình 1.3. Sơ đồ tóm tắt quy trình lên men rượu .........................................................9 Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo của GC-MS ..........................................................................13 Hình 1.5. Sơ đồ tách chiết hợp chất bay hơi bằng HS-SPME GCMS ......................14 Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc và tế bào của các nhóm nấm đại diện .......................32 Hình 3.2. Phổ băng DNA fingerprinting ...................................................................35 Hình 3.3. Hoạt lực enzyme amylase của các chủng nấm mốc (IU/ml).....................42 Hình 3.4. Đường kính khuẩn lạc nấm mốc trên môi trường tinh bột 1% ở các nhiệt độ...............................................................................................................................45 Hình 3.5. Kết quả thủy phân tinh bột trong môi trường có đường của các chủng mốc............................................................................................................................46 Hình 3.6. Các nhóm rượu khác nhau từ 32 mẫu rượu………………………..…….51 v
  8. DANH SÁCH KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT °C: độ celsius CNTP: Công nghiệp Thực phẩm dNTP: deoxyribonucleotide triphosphate. h: hour (giờ) ITS: Internal transcribed spacer PCR: Polymerase chain reaction rDNA: ribosomal DNA rpm: round per minute (vòng/phút) TTVSVCN: Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp HS-SPME GCMS: headspace-solid phase microextraction gas chromatography mass spectrometer vi
  9. MỞ ĐẦU Rượu truyền thống là loại đồ uống có cồn, xuất hiện từ rất lâu đời và được sử dùng rộng rãi trong nhân dân. Chúng thường được sản xuất theo quy mô hộ gia đình và có hương vị đa dạng của từng vùng miền như rượu Làng Vân (tỉnh Bắc Giang), rượu Kim Sơn (tỉnh Ninh Bình), rượu Bàu Đá (tỉnh Bình Định). Để tạo nên sự khác biệt đó có nhiều yếu tố như nguyên liệu, cách thức nấu, và đặc biệt là sự biến đổi của hệ vi sinh vật trong bánh men. Việc sử dụng bánh men với phức hệ vi sinh quá đa dạng thường gây khó khăn trong quá trình kiểm soát chất lượng sản phẩm rượu, vì vậy việc nghiên cứu sâu về chủng giống sẽ rất cần thiết. Các loại rượu trên thế giới đều cho thấy loài Saccharomyces cerevisiae đóng vai trò chủ đạo trong lên men rượu, tuy nhiên nấm mốc thì khác biệt hơn, với mỗi loại rượu thì loài nấm mốc là khác nhau như khi nói tới rượu Sake của Nhật Bản thì đều biết đến loài Aspergillus oryzae, khi nhắc tới rượu Hong Qu ở Trung Quốc thì đều biết đến loài Monascus purpureus, thế nhưng ở Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu nào chỉ ra loài nấm mốc nào đóng vai trò chủ đạo trong lên men rượu truyền thống Việt Nam. Trong lên men rượu truyền thống Việt Nam hầu hết các nhóm chủng được tìm thấy thuộc họ Mucoraceae có khả năng thủy phân cơ chất giàu tinh bột thành đường nhưng chưa được nghiên cứu kỹ về đặc tính liên quan tới đường hóa. Các nghiên cứu trước đây liên quan tới men rượu thì chủ yếu về tính đa dạng vi sinh vật của bánh men và lựa chọn các chủng nấm mốc có hoạt lực enzyme cao, chủng nấm men có khả năng lên men rượu tốt để làm bánh men. Vì vậy, luận văn này được thực hiện nhằm đánh giá đặc tính thủy phân tinh bột của các chủng nấm mốc thuộc họ Mucoraceae phân lập từ bánh men rượu từ đó biết được chủng nào đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn đường hóa và bước đầu thử nghiệm sử dụng chủng mốc thuần kết hợp với chủng nấm men thuần làm giống khởi động nhằm mục đích so sánh phổ hương rượu với các dòng rượu truyền thống để từ đó biết được loài nấm mốc nào đóng vai trò quan trọng trong lên men rượu truyền thống Việt Nam. Việc sử dụng chủng thuần cũng như phương pháp phân tích sắc kí khí kết nối khối phổ (GCMS) để nghiên cứu hương rượu cũng là những tính mới của luận văn. Để thực hiện mục tiêu đề tài đã nêu, các nội dung chính sau đã được thực hiện: 1
  10. - Phân lập vi nấm từ men rượu truyền thống Việt Nam - Phân nhóm vi nấm bằng PCR-fingerprinting và định tên chủng đại diện bằng giải trình tự rDNA - Đánh giá hoạt tính amylase của nấm mốc thuộc họ Mucoraceae - Đánh giá khả năng thủy phân tinh bột các chủng mốc thuộc họ Mucoraceae trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau. - Đánh giá khả năng thủy phân tinh bột của Mucoraceae trong môi trường đường. - Thử nghiệm sử dụng chủng thuần khiết làm giống khởi động, phân tích các hợp chất bay hơi của dịch chưng cất sau lên men và so sánh với các sản phẩm rượu truyền thống khác. 2
  11. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về rượu truyền thống Đồ uống có cồn như bia, rượu là những sản phẩm lên men phổ biến và đóng vai trò quan trọng trong đời sống tinh thần và văn hóa của con người. Ở Việt Nam, rượu gạo đã có từ rất lâu đời, cho đến nay nó vẫn là thức uống phổ biến và chiếm 80% trong tổng số các loại đồ uống có cồn. Tùy thuộc vào từng địa phương mà thành phần và quy trình sản xuất rượu có sự khác nhau, do đó rượu được sản xuất có tên địa phương khác nhau. như rượu Làng Vân (tỉnh Bắc Giang), rượu Kim Sơn (tỉnh Ninh Bình), rượu Kiên Lao (tỉnh Nam Định), rượu Bàu Đá (tỉnh Bình Định), rượu Gò Đen (tỉnh Long An). Tuy nhiên, phương thức sản xuất chung đều dựa vào quá trình biến đổi hóa sinh của hệ vi sinh vật trong men rượu [8]. 1.1.1. Men rượu Việc chuẩn bị và sử dụng men rượu như là nguồn cung cấp vi sinh vật trong sản xuất rượu gạo là rất quan trọng. Thông thường, giống khởi động cho lên men rượu gồm 3 thành phần vi sinh cơ bản là: nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Trong đó, nhóm nấm mốc chủ yếu sinh enzyme amylase để đường hóa tinh bột thành các phân tử đường khử như glucose, maltose, hay n-dextrin dài hơn. Sau đó, lượng đường này được nấm men chuyển hóa thành ethanol vì vậy chất lượng của các sản phẩm cuối cùng phụ thuộc chủ yếu vào hoạt động của các vi sinh vật này. Một trong những cách tiếp cận để cải thiện sản xuất rượu là thiết lập các điều kiện tối ưu cho quá trình đường hóa và lên men đồng thời với nuôi cấy hỗn hợp vi sinh vật sinh enzyme thủy phân tinh bột và lên men ethanol [8]. Như được liệt kê trong Bảng 1.1, các loài mốc chính trong các loại giống khởi động truyền thống ở Châu Á là Rhizopus spp. và Mucor spp. Nhóm nấm men phổ biến là Saccharomyces cerevisiae, Hansenula spp., và Candida spp., còn loài giả nấm men phổ biến là Saccharomycopsis fibuligera. 3
  12. Bảng 1. 1. Các loại giống khởi động để lên men đồ uống có cồn ở Châu Á Sản phẩm Đất nước Mốc và men Bakhar Ấn Độ Mucor spp., Rhizopus spp., Saccharomyces cerevisiae Mucor spp., Rhizopus spp.,, Candida spp., Bubud Philippines Saccharomycopsis fibuligera, Saccharomyces cerevisiae, Torulopsis spp. Aspergillus oryzae, Rhizopus spp., Saccharomyces Chu Trung Quốc cerevisiae Look- Mucor spp., Chlamydomucor oryzae, Candida spp., Thái Lan pang Saccharomyces cerevisiae Men Mucor spp., Rhizopus spp., Aspergillus spp., Việt Nam rượu Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycopsis fibuligera Rhizopus spp., Mucor spp., Saccharomyces cerevisiae, Murcha Nepal Saccharomycopsis fibuligera. Aspergillus oryzae, Rhizopus spp., A.niger, Penicillium Nurock Hàn Quốc spp., Mucor spp., Hansenula anomala, Pichia anomala, Saccharom yces cerevisiae Mucor spp., Rhizopus spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Candida spp., Saccharom yces cerevisiae, Ragi Indonesia Saccharomycopsis fibuligera , Hansenula spp., Rhodotorula spp. Tapai Malaysia Rhizopus spp., Saccharomycopsis fibuligera Các thành phần để làm viên men thường là bột gạo, bột sắn hoặc kết hợp cả bột gạo và bột sắn- Các loại bột đó có thể được trộn với một số loại thảo mộc, những thành phần bổ sung này được cho là có vai trò trong việc ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh vật tạp nhiễm. Tỷ lệ giữa bột nghiền với các loại thảo mộc thường là 14:1 theo khối lượng. Sau đó, nước được thêm vào để tạo độ ẩm tương đối cho khối bột là 55-60%, và trộn đều với bột men từ những mẻ trước. Những viên men được nặn hình tròn với đường kính 4 cm, dày 1 cm. Các khay bánh men được ủ trong điều kiện nhiệt 4
  13. độ phòng 28-32 ºC trong 2-5 ngày và được hong khô bởi gió hoặc ánh sáng mặt trời [8]. Bột gạo Bột men Bột thuốc bắc Nước Khối bột với 50-60% hàm ẩm Nặn viên men tròn ủ 2-5 ngày Hong khô Hình 1. 1. Một quy trình truyền thống làm men rượu ở Việt Nam 1.1.2. Các giai đoạn lên men rượu Có 2 giai đoạn chính trong lên men sản xuất rượu đó là: Giai đoạn đường hóa và giai đoạn lên men rượu 1.1.2.1. Giai đoạn 1- Giai đoạn đường hóa Gạo sau khi được nấu chín sẽ được tãi ra khay, vải sạch để nguội đến nhiệt độ 30-35°C thì rắc bột bánh men vào với tỉ lệ bột bánh men so với gạo là 1-5% theo khối lượng. Trộn đều bột bánh men và ủ khoảng 3 ngày để vi sinh vật sinh amylase thủy phân tinh bột thành đường trong điều kiện hiếu khí [8]. 1.1.2.1.1. Đặc điểm của enzyme amylase Amylase có thể được tổng hợp từ một số loại nấm mốc, nấm men, vi khuẩn và xạ khuẩn; Tuy nhiên, nấm mốc được biết đến nhiều nhất vì tính phổ biến và ổn định 5
  14. của enzyme này. Có 3 loại amylase là α-amylases, β-amylases và γ-amylase, (α- glucosidase) mỗi loại cắt các vị trí khác nhau. Hình 1.2. minh họa vị trí thủy phân liên kết của 3 loại enzyme này. Hình 1. 2. Quá trình thủy phân tinh bột bởi các enzyme amylase a. α- amylase α-amylases có khả năng cắt liên kết α,1-4 glycoside ở phía trong của mạch amylose và amylopectin. Enzyme này được tìm thấy ở rất nhiều loài vi sinh vật, nó cắt ở các vị trí ngẫu nhiên dọc chuỗi tinh bột, cuối cùng tạo ra glucose, maltose, n- dextrin. α-amylases có xu hướng hoạt động nhanh hơn β-amylase bởi nó có thể thủy phân nhiều vị trí của cơ chất. Loại enzyme này được tìm thấy nấm Ascomycetes và Basidiomycetes, vi khuẩn Bacillus, nước bọt và tuyến tụy ở người [22]. Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylases là quá trình đa giai đoạn: Giai đoạn 1 (giai đoạn dextrin hóa): Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh) [2]. Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): Các dextrin phân tử thấp ở giai đoạn 1 bị thủy phân tiếp tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose [2]. 6
  15. Giai đoạn 3: Các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose và maltose và glucose. Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α- amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa.[2] b. β-amylase β-amylase hay exoamylase có khả năng cắt liên kết α,1-4 glycoside và α,1-6 glycoside. Chúng thủy phân glucose ở phía ngoài của mạch amylose và amylopectin [23]. β-amylase là một enzyme ngoại bào. Tiến trình phân giải bắt đầu từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng cơ chất. β-amylase phân cắt các liên kết α-1,4glucoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6 glucoside thì nó sẽ ngừng tác dụng. Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α-1,6 glucoside và được gọi là β-dextrin [2]. c. γ-amylase γ-amylase cắt liên kết α(1-6) và α(1-4) glycoside ở đầu không khử của amylose và amylopectin, tạo ra glucose. Đa số Enzyme này có hoạt lực cao nhất ở vùng PH 3,5-5,5 và nhiệt độ 50ºC. Nó bền với acid hơn α-amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, aceton [22]. 1.1.1.2.2. Đặc điểm của vi nấm trong giai đoạn đường hóa Quá trình đường hóa tinh bột sẽ cho ra maltose, glucose để sản xuất ethanol có nguồn gốc từ các quá trình lên men. Thủy phân tinh bột bằng phương pháp enzyme có nhiều ưu điểm so với phương pháp hóa học, như hoạt động trong điều kiện pH và nhiệt độ vừa phải, ngăn ngừa ăn mòn thiết bị và các bước trung hòa tiếp theo. Enzyme có tính đặc hiệu cơ chất, loại bỏ sự hình thành các sản phẩm phụ không mong muốn như thường được xuất hiện trong quá trình thủy phân axit [26]. 1.1.2.2. Giai đoạn 2- Giai đoạn lên men rượu. 7
  16. Nhóm nấm men thường phân lập được từ bánh men là Saccharomyces cerevisiae, Pichia anomala, Candida tropicalis trong đó Saccharomyces cerevisiae được cho là đóng vai trò chính, phát triển trong điều kiện ít oxy, lên men chuyển hóa đường thành ethanol. Ethanol là sản phẩm chính ở giai đoạn này, khi nồng độ cao trong dịch lên men sẽ ức chế màng sinh chất, thay đổi tính bán thấm tế bào nấm men và các vi sinh vật khác. Thực tế sản xuất cho thấy giai đoạn ủ cho lên men phụ thuộc vào thời tiết, vào những ngày nóng, giai đoạn ủ thường ngắn. Ví dụ như ở vùng Đồng bằng Sông Cửu Long ở miền Nam Việt Nam, nhiệt độ trung bình 30-33ºC, thời gian ủ cho giai đoạn 1 là 2-3 ngày, giai đoạn 2 là 3-4 ngày [8]. + Lên men rắn là phương pháp thường được sử dụng ở các vùng núi cao. Nguyên liệu cho sản xuất rượu ở những vùng này thường là ngô và sắn. Ngô và sắn sau quá trình đường hóa trở nên ngọt và mềm, sau đó được thêm nước. Quá trình lên men diễn ra trong 5-7 ngày và sau đó đem đi chưng cất [3]. + Lên men lỏng thường được sử dụng ở các làng nghề dưới đồng bằng. Gạo, sau quá trình đường hóa trở nên mền ngọt và được bổ sung nước theo tỉ lệ 1:1. Lên men tiếp trong 3-5 ngày. Vào mùa hè nhiệt độ cao thì thời gian lên men thường ngắn hơn mùa đông [3]. Sản phẩm sau lên men rượu gạo. Đối với rượu không chưng cất, dịch lên men sau khi kết thúc giai đoạn 2 sẽ được lọc lấy dịch trong chứa glucose, ethanol, và các chất hòa tan khác, với những loại rượu không chưng cất độ cồn chỉ khoảng 7-10% (v/v), và rượu sẽ không bảo quản được lâu. Để giải quyết vấn đề này, người sản xuất sẽ tăng hàm lượng cồn bằng cách hoặc bổ sung đường vào sau giai đoạn 1 hoặc bổ sung cồn vào sau giai đoạn 2, như vậy vừa đáp ứng được nhu cầu khách hang vừa kéo dài tuổi thọ cho sản phẩm [3]. Đối với rượu chưng cất, sử dụng thiết bị chưng cất có nguyên lý hoạt động như hình dưới, gồm 3 phần cơ bản là: khoang đun, hệ thống làm mát, và khoang chứa rượu chưng cất. Thông thường, mẫu rượu đầu có nồng độ cồn cao có thể lên đến 65% (v/v) sau giai đoạn chưng cất đầu tiên, và khoảng 25-30% (v/v) cho mẫu rượu sau [3]. 8
  17. Hình 1. 3. Sơ đồ tóm tắt quy trình lên men rượu 1.2 Giới thiệu về họ Mucoraceae Họ Mucoraceae là họ nấm thuộc bộ Mucorales, đặc trưng bởi hệ sợi không vách ngăn. Một số chi có thể kể đến bao gồm Absidia, Apophysomyces, Mucor, Rhizomucor, và Rhizopus.Theo ước tính năm 2008, họ này bao gồm 25 chi và 129 loài [15]. Sau đây là một số loài thuộc chi Rhizopus và Mucor thường xuất hiện ở bánh men rượu. a. Rhizopus oryzae Rhizopus oryzae là thành viên của chi Rhizopus, thuộc họ Mucoraceae. Hệ thống phân loại Rhizopus oryzae không đơn giản. Những nghiên cứu gần đây về Mucorales dựa trên trình tự ITS đã đưa ra các tên loài đồng nghĩa sau: Amylomyces rouxii, Rhizopus achlamydosporus, R. arrhizus, R. boreas, R. delemar, R. chiuniang, R. javanicus, R. oryzae, R. maydis, R. niveus, R. peka, R. tonkinensis [26]. Mặc dù nhiều chủng nấm mốc trong bánh men đều có khả năng thủy phân tinh bột gạo nhưng Rhizopus oryzae (hay Amylomyces rouxii được biết đến là chủng điển hình nhất, được mô tả đầu tiên bởi Calmette năm 1982). Ông coi chủng này đóng vai trò quan trọng 9
  18. trong quá trình thủy phân tinh bột gạo. Khi sử dụng nấm mốc thuần chủng này và nấm men thương phẩm ông có thể thu 340 g cồn đặc từ 1000 g gạo thay vì 180 g khi sử dụng bánh men. Ngoài ra, nấm này cũng được sử dụng trong nghiên cứu tạo bánh men để sản xuất rượu gạo từ gạo nếp cẩm [1]. Bên cạnh đó, R. oryzae cũng là loài phổ biến và chiếm ưu thế được phát hiện ở Yao Qu, và ở một số Hồng Qu. Nó cũng được tìm thấy ở một số giống khởi động khác với khả năng sinh amylase mạnh, đóng góp lớn cho sản xuất rượu [23]. Nghiên cứu trước còn chỉ ra rằng R. oryzae cũng có thể tạo ra các hợp chất dễ bay hơi trong quá trình lên men, chẳng hạn như ethanol, 2-methyl-1- butanol và 3- methyl-1-butanol [4]. b. Rhizopus microsporus Rhizopus microsporus là nhóm nấm thuộc chi Rhizopus, họ Mucoraceae phổ biến thứ hai khi phân lập từ bánh men [6]. Các enzyme thủy phân từ các loài Rhizopus hoạt động tối ưu trong điều kiện pH 4.0-5.5. Nhóm Rhizopus microsporus có khả năng chịu nhiệt độ cao, chủng Rhizopus microsporus var. rhizopodiformis có thể sinh trưởng ở 50°C và sinh amylase tối ưu ở 45°C [7]. Rhizopus microsporus var. chinensis CICIM-CU F0088 cũng cho thấy khả năng phát triển ở 40°C, và tiết ra các amylase ở nhiệt độ cao hơn Rhizopus oryzae [17]. Các chủng R. microsporus có thể sinh độc tố rhizoxins, nhưng bản thân nó không tạo ra mà được tạo bởi vi khuẩn Burkholderia chúng sống bên trong tế bào nấm. Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn này đã từng được tìm thấy ở chủng Rhizopus microsporus CBS 111563, được phân lập từ sufu. Một lượng đáng kể rhizoxins được phát hiện trong sản phẩm cuối cùng [7]. Tuy nhiên vẫn chưa biết rõ rằng Rhizopus microsporus từ bánh men có độc tố không. c. Mucor indicus Các chủng Mucor indicus thuộc nhóm này thường khuẩn lạc có màu vàng đậm đặc trưng, có nhiệt độ tăng trưởng tối đa 42ºC. Bào tử có màu vàng nhạt, sợi liên tục phân nhánh, với các nhánh dài. Túi bào tử có màu vàng đến nâu, đường kính lên tới 75 µm, với các màng khác nhau. Cuống gần hình cầu, cao tới 40 µm. Bào tử có vách trơn, gần cầu tới elip, và có đường kính 4-5 µm. Có nhiều Chlamydospores, đặc biệt 10
  19. là trong ánh sáng. Bào tử tiếp hợp zygospores có màu đen, hình cầu, có đường kính lên tới 100 µm [14]. M. indicus có khả năng sinh ethanol từ nhiều nguồn đường khác nhau như glucose, mannose, fructose, hay galactose. Chúng cũng có khả năng lên men xylose thành ethanol nhưng chỉ trong điều kiện hiếu khí hoặc vi hiếu khí. Sản lượng ethanol sau lên men từ xylose xấp xỉ lượng ethanol do Pichia stipites lên men (Pichia stipites được biết đến là loài sản xuất ethanol tốt nhất từ xylose). Tuy nhiên, nhiều chủng nấm này không có khả năng lên men đường sucrose, vì vậy M. indicus không thể thay thế S. cerevisiae để lên men ethanol từ cơ chất chứa sucrose [14]. M. indicus là loài nấm mốc lên men ethanol khá hiệu quả và có thể sinh ra ethanol 5% khi sinh trưởng trong môi trường chứa glucose. Bên cạnh đó, một nghiên cứu khác chỉ ra rằng hoạt lực amylase của M. indicus dường như rất thấp hoặc không có khi sinh trưởng trong môi trường gạo [14]. d. Mucor circinelloides Trong số nấm thuộc chi Mucor tìm thấy trong bánh men, Mucor circinelloides là loài cũng khá phổ biến. Tuy nhiên khả năng thủy phân tinh bột của chúng kém [12]. Chúng là loài dị hình giới tính và có thể phát triển giống nấm mốc và nấm men. Bên cạnh khả năng thủy phân tinh bột, chúng còn có khả năng thủy phân cellulose [14]. 1.3. Tình hình nghiên cứu về rượu truyền thống Việt Nam Các nghiên cứu về lên men rượu truyền thống của Việt Nam có thể được phân loại thành hai nhóm chính: (i) tính đa dạng vi sinh vật của bánh men và (ii) lựa chọn các chủng nấm mốc có hoạt lực enzyme cao, chủng nấm men có khả năng lên men rượu tốt để làm bánh men, cải tiến quy trình [25]. Hệ vi sinh của bánh men đã được nghiên cứu khá rõ, mỗi gam bánh men chứa 103-106 CFU mốc, 103-107 CFU men, và 103-106 CFU vi khuẩn lactic. Bánh men chứa hệ vi sinh vật tương đối ổn định, bao gồm các loài mốc Rhizopus microsporus, Mucor indicus, Mucor circinelloides, loài giả men Saccharomycopsis fibuligera, loài nấm men Hyphopichia burtonii, Saccharomyces cerevisiae, Issatchenkia orientalis, 11
  20. Pichia anomala, Candida tropicalis, Pichia ranongensis, Clavispora lusitaniae, Pediococcus pentosaceus, và các loài vi khuẩn Lactbacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Weissella confusa, Weissella paramesenteroides. Nó được kết luận rằng hệ vi sinh trong bánh men tương tự như ragi và các dạng men Châu Á khác. Tuy nhiên, để có một cái nhìn rõ hơn về đặc tính thủy phân tinh bột của các nhóm chủng vi nấm xuất hiện phổ biến trong bánh men rượu Việt Nam thì vẫn chưa có nghiên cứu nào được thực hiện trước đó. Bên cạnh đó, khi đã chọn các chủng nấm tốt để tạo men rượu cải tiến từ chủng thuần thì rượu sau khi chưng cất chỉ được đánh giá bằng cảm quan mà ít có phân tích phổ hương rõ bằng sắc kí khí [9] nên nghiên cứu này sẽ phân tích các hợp chất bay hơi trong các mẫu rượu sử dụng chủng thuần và so sánh với các sản phẩm rượu truyền gạo truyền thống. 1.4. Phân tích hợp chất bay hơi 1.4.1. Giới thiệu về sắc kí khí kết nối khối phổ (GCMS) Sắc kí khí kết nối khối phổ (GCMS) gồm 2 phần chính là GC và MS, trong đó GC (Gas Chromatography) là loại sắc kí có pha động là khí mang, thường là các khí trơ như heli, nitơ hay hydro, còn pha tĩnh là một lớp dịch mỏng hoặc polymer bên trong cột. Mẫu được chạy qua cột bởi dòng khí mang. Các thành phần của mẫu được tách nhau ra khi đi qua cột dưới một chu trình nhiệt độ từ thấp tới cao. Còn MS (Mass Spectrometer) là detector khối phổ cho GC, các chất khí sau khi đi qua cột sẽ sang MS và bị bắn phá thành các mảnh có khối lượng khác nhau, mỗi chất khí có một danh sách các mảnh khác nhau, dựa vào thông tin khối lượng trên điện tích m/z, sau đó chất này được so sánh với thư viện phổ để biết tên chất [11]. Sắc kí khí kết nối khối phổ là một phương pháp phân tích kết hợp cả đặc trưng của sắc kí khí và khối phổ để định tính các hợp chất trong mẫu. GC có thể tách hợp chất bay hơi và bán bay hơi nhưng không thể định danh chúng. MS có thể cung cấp thông tin cấu trúc chi tiết cho hầu hết các hợp chất và định danh chúng nhưng MS lại không tách được chúng khỏi mẫu [16]. Sơ đồ cấu tạo được trình bày ở hình 1.4. 12
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.15: Bộ Đồ Án Tốt Nghiệp Chuyên Ngành Cơ Khí
65 tài liệu
2418 lượt tải
THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2