Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza và một số đặc tính của enzim

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:67

Thêm vào BST

Báo xấu

101
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung nghiên cứu: Thuỷ phân lông vũ nhờ các vi sinh vật có hoạt tính keratinaza là một phương pháp đem lại hiệu quả cao, khắc phục được những hạn chế của các phương pháp lý hoá.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza và một số đặc tính của enzim

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Thị Thu Huyền PHÂN LẬP VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH KERATINAZA VÀ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ENZIM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS NGUYỄN ĐÌNH QUYẾN
Hà Nội Năm 2012 LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ sự biết ơn chân thành và sâu sắc tới GS. TS. Nguyễn Đình Quyến, người thầy đã tận tình chỉ bảo, quan tâm, giúp đỡ và dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, giúp tôi có được nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Bùi Thị Việt Hà, cô Đỗ Minh Phương và các thầy cô giáo bộ môn Vi sinh vật học, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc Gia Hà Nội đã tạo điều kiện và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại phòng thí nghiệm bộ môn. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới cơ quan đang công tác, người thân, bạn bè đã ủng hộ, động viên, giúp đỡ tôi để có thể hoàn thành bản luận văn này. Hà Nội, tháng 11 năm 2012 Lê Thị Thu Huyền
MỤC LỤC MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………… 4 1.1. Cấu trúc và tính chất của keratin…………………………………………….4 1.1.1. Cấu trúc của keratin………………………………………………………..4 1.1.2. Tính chất của keratin………………………………………………………7 1.1.3. Các nguồn keratin …………………………………………………………8 1.2. Tình hình khai thác và sử dụng keratin hiện nay…………………………….8 1.2.1. Tình hình khai thác và sử dụng keratin trên thế giới………………………9 1.2.2. Tình hình khai thác và sử dụng keratin ở Việt Nam………………………11 1.3. Sự phân huỷ keratin trong tự nhiên………………………………………….11 1.4. Các phương pháp phân huỷ keratin…………………………………………13 1.4.1. Phương pháp lý hoá……………………………………………………….13 1.4.2. Phương pháp sinh học…………………………………………………….14 1.5. Đặc điểm của enzim keratinaza ở vi sinh vật……………………………….14 1.6. Một số ứng dụng của keratinaza…………………………………………….16 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………..21
2.1. Vật liệu, hoá chất và các thiết bị……………………………………………..21 2.1.1. Vật liệu……………………………………………………………………..21 2.1.2. Hoá chất……………………………………………………………………21 2.1.3 Thiết bị, máy móc thí nghiệm……………………………………………… 24 2.2. Phương pháp…………………………………………………………………24 2.2.1. Phân lập các chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza từ đất……….. ……..24 2.2.2. Nghiên cứu một số đặc điểm về hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào và khả năng sinh bào tử của các chủng sinh keratinaza …………………………………25 2.2.3. So sánh hoạt tính keratinaza của các chủng vi khuẩn sinh keratinaza…….26 2.2.4. Xác định một số điều kiện tối ưu hoá môi trường nuôi cấy... ……………..27 2.2.4.1. Xác định ảnh hưởng của lượng lông đưa vào môi trường nuôi cấy……..27 2.2.4.2. Xác định ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ban đầu………. ……..28 2.2.4.3. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy ban đầu…. ……..28 2.2.5. Xác định ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và một số ion kim loại đến hoạt tính keratinaza………………………………………………………………………....28
2.2.5.1. Xác định hoạt tính keratinaza……………………………………………28 2.2.5.2. Xác định ảnh hưởng của pH .………….. ………………………………..29 2.2.5.3. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ .………….…………………………… 29 2.2.5.4. Xác định ảnh hưởng của một số ion kim loại. …………………………..30 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………….31 3.1. Sự phân rã của lông gà khi được sử dụng làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất để nuôi cấy vi khuẩn có hoạt tính keratinaza…………………………………….31 3.2. Một số đặc điểm của các chủng có hoạt tính keratinaza..….. ……………….32 3.3. Xác định chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza mạnh nhất... ……………..34 3.4. Một số điều kiện tối ưu hoá môi trường nuôi cấy…………………………...36 3.4.1. Ảnh hưởng của lượng lông đưa vào môi trường nuôi cấy………………...36 3.4.2. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ban đầu………. ………………..37 3.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy ban đầu…. ………………..38 3.5. Một số đặc tính của keratinaza……………………………………………...38 3.5.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính keratinaza……………………………… 38
3.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính keratinaza………………………… 40 3.5.3. Ảnh hưởng của một số ion kim loại……………………………………….42 KẾT LUẬN………………………………………………………………………44 KIẾN NGHỊ……………………………………………………………………...45 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………..46 MỞ ĐẦU Trong những năm qua, proteaza là nhóm enzim thuỷ phân được nghiên cứu nhiều nhất trong ngành công nghiệp enzim. Hiện nay, proteaza chiếm khoảng 60 65% thị trường enzim công nghiệp trên thế giới; trong đó bao gồm 28% proteaza kiềm, 10% renin và 21% là các loại proteaza khác (1). Proteaza kiềm đang được ứng dụng trong nhiều ngành: công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, thực phẩm, chăn nuôi, may mặc, thuộc da, xử lý môi trường, thu hồi bạc từ các bản phim,... Keratinaza thuộc nhóm proteaza kiềm, hoạt động trên cơ chất là keratin, trong những năm gần đây cũng đang được quan tâm nghiên cứu bởi tiềm năng ứng dụng của chúng. Keratin là nhóm các protein tự nhiên, là thành phần chính cấu tạo nên các loại lông, tóc, móng, sừng,… Lông gà trưởng thành chiếm 5 7% trọng lượng sống. Trên thế giới, mỗi năm có tới 24 tỉ con gà và khoảng 8,4 triệu tấn lông vũ được thải ra từ ngành công nghiệp gia cầm (31), mức tăng hàng năm cũng lên tới khoảng 4.5% (18). Hàm lượng protein trong lông vũ rất cao, chiếm tới trên 90%,
nên có thể coi đây là một nguồn protein tiềm năng lớn có thể khai thác làm thức ăn cho chăn nuôi và nhiều ứng dụng khác. Tuy nhiên, keratin lại là loại protein rất bền nhờ có các liên kết disulfua trong phân tử. Vì vậy, chúng có tính ổn định cơ học cao, có khả năng chống chịu tốt với tác động vật lý, hoá học và sinh học, không bị phân huỷ bởi nước và các proteaza thông thường như: trypsin, papain và pepsin . Các nhà máy thuộc da, lông thú và các lò giết mổ gia súc, gia cầm vứt bỏ một lượng đáng kể các vật liệu chứa keratin: lông, len, sừng, móng,…. Ở Việt Nam, chỉ một phần rất nhỏ trong số chúng được sử dụng chủ yếu trong sản xuất một số sản phẩm thủ công, may mặc; phần lớn còn lại chỉ được loại bỏ và xử lý đơn giản như đốt, chôn hoặc chỉ là chất thành các đống rác lớn chưa có phương pháp xử lý gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Trên thế giới, trước đây người ta áp dụng phương pháp xử lý lông vũ bằng cách thuỷ phân trong môi trường kiềm ở nhiệt độ và áp suất cao. Tuy nhiên, phương pháp này không chỉ phá huỷ một số axit amin ( như: metionin, lysin, histidin) mà còn tiêu thụ một lượng lớn năng lượng . Thuỷ phân lông vũ nhờ các vi sinh vật có hoạt tính keratinaza là một phương pháp thay thế được lựa chọn đem lại hiệu quả cao, khắc phục được những hạn chế của các phương pháp cũ. Ngoài ra, bên cạnh việc tạo ra nguồn protein bổ sung vào thức ăn trong chăn nuôi, xử lý được nguồn rác khó phân giải góp phần chống ô nhiễm môi trường thì keratinaza được phân lập từ vi sinh vật cũng có thể đóng vai trò quan trọng trong các ứng dụng công nghệ sinh học khác như: loại bỏ lông trong ngành công nghiệp thuộc da , làm sạch các vật cản lông vũ trong các hệ thống nước thải, phòng chống bệnh bò điên (21),… Tuy nhiên, một trong những hạn chế lớn ảnh hưởng đến sự ổn định độ pH kiềm tính của các enzym này là có sự ổn định trong một phạm vi pH rộng nhưng
thường không ổn nhiệt. Vì vậy, người ta mong muốn tìm kiếm các protease mới với những đặc tính mới lạ từ nhiều nguồn khác nhau (34). Trong những năm gần đây, các nhà khoa học trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về các vi sinh vật có hoạt tính keratinaza, đặc điểm và ứng dụng của chúng, bước đầu phục vụ cho phân huỷ lông vũ dùng làm thức ăn cho gia súc đã đem lại hiệu quả tốt (4, 10, 11, 14, 16, 23, 26, 27, 42). Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực này chưa có nhiều và việc ứng dụng chúng còn rất hạn chế, hầu hết lông vũ từ các lò giết mổ chỉ được coi là rác thải; cùng với đó, việc xử lý rác thải chưa được quan tâm nhiều. Đề tài "Phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza và một số đặc tính của enzim" được thực hiện nhằm: Phân lập các chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza từ các mẫu đất khác nhau và xác định được chủng có hoạt tính tốt nhất. Một số điều kiện tối ưu về hàm lượng lông, nhiệt độ và pH môi trường nuôi cấy ban đầu cho nuôi chủng sinh keratinaza. Một số đặc tính của enzim, như hoạt động tốt nhất trong điều kiện nhiệt độ, pH và sự có mặt của những ion nào. Từ đó có thể ứng dụng vào thực tiễn góp phần xử lý rác thải lông vũ một cách hiệu quả, tận dụng một nguồn protein đang bị bỏ phí làm thức ăn bổ sung trong chăn nuôi và có thể mở rộng sang nhiều ứng dụng khác nếu được tiếp tục nghiên cứu.
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT CỦA KERATIN 1.1.1. Cấu trúc của keratin Trong lịch sử, thuật ngữ keratin dùng cho tất cả các protein chiết xuất từ sự biến đổi của da, chẳng hạn như lông, sừng, móng vuốt và móng guốc. Sau đó, người ta đã nhận ra rằng keratin thực sự là một hỗn hợp của keratin, keratin liên quan đến các protein và các protein khác, chẳng hạn như enzim. Keratin sau đó được định nghĩa là một số protein hình thành sợi với các đặc tính hóa lý cụ thể và chiết xuất từ lớp hoá sừng của biểu bì, trong khi những protein hình thành lông, tóc được chiết xuất từ các lớp của biểu bì đã được nhóm lại là ''prekeratin'' hoặc ''cytokeratin'' .
Như vậy, keratin là nhóm các protein có cấu trúc dạng sợi với các đặc tính hoá lý cụ thể, là thành phần chính cấu tạo nên lông, tóc, móng, sừng, trong biểu mô của tế bào động vật có xương sống… Trọng lượng phân tử keratin ở động vật có vú từ 40 đến 70 kDa. Trong số các loại axit amin tạo nên các phân tử keratin thì cystein là phổ biến nhất (có thể chiếm tới 24%), ngoài ra, keratin từ lông gia cầm còn chứa hàm lượng cao các axit amin như: glycin, alanin, serin và valin. Ngoài các liên kết hydro nội phân tử và liên phân tử, keratin có hàm lượng lớn lưu huỳnh có chứa trong cystein, tạo ra các cầu disunfua cho keratin. Keratin được tạo ra bởi các tế bào sừng các tế bào sống tạo nên phần lớn của lông, tóc, móng, da,…Sau đó, các tế bào này chết và bao phủ bên ngoài có tác dụng bảo vệ. Các αkeratin cuộn sợi protein duy nhất (thường có các liên kết hiđro trong chuỗi ), sau đó tiếp tục xoắn vào các dây siêu xoắn để có thể tiếp tục cuộn. β keratin có các tấm β xoắn lại với nhau, sau đó được ổn định và làm cứng bằng các cầu disunfua. Keratin được phân loại cụ thể theo cấu trúc phân tử của chúng, đặc điểm hóa lý , các tế bào biểu mô sản xuất và loại biểu mô có chứa các tế bào sản xuất keratin. Theo cấu tạo, keratin có 2 loại chính: keratin: Trong tóc, lông cừu, sừng, móng tay, móng chân, móng và guốc của động vật có vú. Cấu tạo là các sợi đơn protein liên kết với nhau bằng các liên kết hiđro. Xoắn alpha của keratin không phải là một chuỗi xoắn alpha đúng, vì nó chỉ có 3,5 dư lượng / lượt; trong khi xoắn alpha bình thường có 3,6 dư lượng / lượt. Điều này quan trọng để tạo thành liên kết disunfua chặt chẽ. Ngoài ra, khoảng
cuối mỗi dư lượng thứ bảy là một axit amin lơxin, để chúng có thể sắp xếp và giúp các sợi liên kết lại với nhau thông qua tương tác kỵ nước. keratin: Trong móng tay, móng vuốt của loài bò sát, họ vỏ testudines (ba ba, rùa), trong lông, mỏ, móng vuốt của các loài chim và lông của nhím, được hình thành chủ yếu trong các tấm beta, cứng chắc hơn các tấm anpha do các tấm beta được nối với nhau bằng các cầu disulfua. Hình 1.1. Cấu trúc của keratin Các monome của keratin lắp ráp lại thành bó để tạo thành các sợi trung gian từ đó tạo thành các mô không khoáng hoá bền vững gặp ở các loài bò sát, chim, lưỡng cư và động vật có vú.
Hình 1.2. Các dạng cấu trúc của keratin a. Cấu trúc miền phụ của chuỗi keratin biểu bì hiển thị cơ bản cuối vùng E1 và E2 ngắn, glycin / serin ở vùng giàu V1 và V2, và các khu vực tương đồng H1 và H2 (Steinert 1993). b. Cấu trúc miền phụ của các chuỗi akeratin cứng cơ bản (NB) và axit (NA) khu vực của miền Nthiết bị đầu cuối. Miền thiết bị đầu cuối của các loại chuỗi được đặc trưng bởi một motif prolinecysteineX lặp đi lặp lại.Miền C thiết bị đầu cuối của loại dây chuyền II có chứa một phân bố định kỳ dư lượng kỵ nước (Parry và North,1998). c. Mô hình cấu trúc của keratin cuộn cuộn dây dimer, chiều dài 45 nm.Các axit amin kỵ nước của hai xoắnkhớp với nhau trong một mô hình lồng vào nhau thường xuyên (Cohlberg,1993). d. Tổ chức microfibrils keratin, đầu hình cầu, đuôi (màu đen). Các thiết bị đầu cuối có thể tương tác với các phân đoạn trong sợi và với tên miền C khác trong một phân tử lân cận phản song song (Parry và North,1998). 1.1.2. Tính chất của keratin
Keratin là protein rất bền. Do có axit amin cystein chứa lưu huỳnh có khả năng tạo liên kết với nhau bằng các cầu disunfua, tạo ra một dạng xoắn cực kì chặt chẽ, khiến keratin khá cứng chắc, bền nhiệt và rất khó hoà tan. Keratin cũng khó bị phân giải bởi các proteaza thông thường như: trypsin, papain và pepsin. Keratin không bị hòa tan trong dung dịch muối nhưng những protein này có thể hoà tan trong các dung dịch có chứa các chất biến tính, chẳng hạn như urê. Keratin trong dung dịch có thể lắp ráp lại sợi trung gian. Do có chứa hàm lượng lưu huỳnh cao nên khi đốt keratin trong lông, tóc, móng,… gây ra mùi khét đặc trưng. Tuỳ thuộc vào hàm lượng cystein và các cầu disunfua mà tạo ra các tế bào chứa keratin rất cứng như trong móng, guốc hoặc có thể linh hoạt hơn như trong da. Hầu hết các tế bào chứa nhiều keratin mà ta gặp là các tế bào đã chết và có thể được rụng ra hoặc bị các tế bào mới đẩy lên. Nếu các tế bào đã chết này được lưu giữ trong tình trạng tốt, chúng sẽ có tác dụng như 1 lớp cách điện, cách nhiệt, không thấm nước,… bảo vệ các tế bào phía dưới. 1.1.3. Các nguồn keratin Keratin chỉ được tìm thấy trong các tế bào biểu mô. Keratin tự nhiên được tạo ra từ các tế bào sừng của cơ thể. Trong tự nhiên, keratin là thành phần chính cấu tạo nên các cấu trúc như lông, tóc, móng guốc, sừng, da,… của động vật. Ở gà trưởng thành, lông chiếm 5 7 % khối lượng cơ thể; trong đó, keratin lại là thành phần chủ yếu. Trên thế giới có tới vài triệu tấn lông vũ được tạo ra hàng năm từ ngành chế biến gia cầm và tỉ lệ tăng hàng năm là khoảng 4,5% (18). Ở Việt Nam, cùng với sự phát triển của các ngành chăn nuôi và chế biến gia súc, gia cầm đã tạo ra một lượng lớn keratin thô cần được xử lý.
1.2. TÌNH HÌNH KHAI THÁC VÀ SỬ DỤNG KERATIN HIỆN NAY 1.2.1. Tình hình khai thác và sử dụng keratin trên thế giới Mặc dù nguồn keratin tự nhiên khá dồi dào, hàm lượng protein trong lông, tóc, móng,… rất cao; tuy nhiên, do tính bền vững mà keratin hầu như chưa được khai thác và sử dụng nhiều. Chỉ một phần rất nhỏ lông, tóc, móng,… được sử dụng để làm các sản phẩm thủ công mĩ nghệ, làm chăn ga gối, áo,... Ngành công nghệ sinh vi sinh trên thế giới đã và đang tìm kiếm các môi trường nuôi cấy vi sinh vật với chất lượng cao và giá rẻ. Việc sử dụng lông từ công nghiệp gia cầm làm cơ chất lên men là lựa chọn không tốn kém để sản xuất enzyme, protein…bằng công nghệ vi sinh nếu áp dụng hiệu quả. Lông gia cầm giàu protein (chủ yếu là keratin), là phế phẩm được tạo ra rất nhiều từ công nghiệp gia cầm. Trong một vài năm, chúng là chủ thể của các nghiên cứu dinh dưỡng nhằm sử dụng làm nguồn nitơ bổ sung trong thức ăn gia cầm. Điều này tạo ra một số lợi thế cho công nghiệp gia cầm như loại trừ vấn đề môi trường, giảm chi phí nguyên liệu. Tuy nhiên, lông có hai giới hạn dinh dưỡng là làm mất cân bằng axit amin và khó tiêu hoá. Trong công nghiệp, người ta nấu phần lớn lông thải ra dưới nhiệt độ và áp suất cao, sau đó sử dụng làm nguồn protein bổ sung trong thức ăn gia cầm. Rất nhiều đánh giá hiệu quả của sản phẩm này đã cho thấy chúng không dễ tiêu hoá và do quá trình xử lý nhiệt độ và áp suất phá huỷ một số axit amin, làm tăng sự mất cân bằng các axit amin thiết yếu. Do đó, cần có các phương pháp xử lý lông khác, tăng cường chất lượng dinh dưỡng của lông và phát triển các phụ phẩm hữu dụng. Một trong các phương pháp hiệu quả cao sử dụng vi sinh vật. Vi sinh vật làm biến đổi cấu trúc keratin, thay đổi tính kháng các enzyme trong bộ máy tiêu hoá.
Một số nơi trên thế giới đã nghiên cứu và sử dụng sản phẩm phân huỷ lông gà làm thức ăn bổ sung protein cho chăn nuôi gia súc. Sử dụng cách thuỷ phân bột lông bằng vi khuẩn có thể tạo ra sản phẩm thay thế đến 15% protein trong thức ăn gia cầm. Keratinaza và các sản phẩm liên quan có nhiều ứng dụng (18). Ví dụ, lông thủy phân bởi Bacillus licheniformis PWD1 và Vibrio sp Bacillus licheniformis chủng kr2 (16, 42) có thể được sử dụng như phụ gia thức ăn, trong khi keratinaza từ Bacillus subtilis 168M tái tổ hợp có khả năng cạo lông đáng kể (1). Hơn nữa, keratinaza từ B. licheniformis PWD1 có thể làm giảm hình thức lây nhiễm của prion, PrPSC, trong sự có mặt của chất tẩy rửa và xử lý nhiệt (21). Tuy nhiên trong thực tế, những ứng dụng này còn ít. Phần lớn lông gia cầm từ các lò giết mổ bị coi là rác thải và chưa được xử lý triệt để, gây ô nhiễm môi trường và lãng phí một nguồn protein tốt. Ví dụ thành phần axit amin và chất khoáng từ lông gà mái: Thành phần axit amin (%) Lysin 1,80 Methionin 0,48 Cystein 3,65 Methionin + cystein 4,13 Threonin 3,87 Tryptophan 0,43 Arginin 0,43 Glyxin 6,55 Serin 8,35 Histidin 0,64
Leucin 6,80 Isoleucin 4,20 Phenylalanin 3,90 Tirosin 2,34 Valin 7,15 Thành phần khoáng (%) Canxi 0,20 Photpho 0,75 Muối 0,70 Kali 0,30 Chlorine 0,14 Magnesium 0,20 Sau khi thủy phân, lông cũng có thể được chuyển đổi sang các loại keo, phim và là nguồn cung cấp một số protein hiếm , chẳng hạn như serine, cystein và proline (8, 9, 17). 1.2.2. Tình hình khai thác và sử dụng keratin ở Việt Nam Ở nước ta, cũng như trên thế giới, nguồn keratin thô vẫn chưa được khai thác và sử dụng đáng kể; đặc biệt là lông gia cầm; phần lớn thải ra từ các lò giết mổ đều chưa được khai thác và xử lý hiệu quả. Chúng thường bị tập trung lại thành các đống lớn; một số được chôn lấp, một số bị đốt, còn lại chưa được xử lý, gây ô nhiễm nghiêm trọng môi trường xung quanh các lò giết mổ. Hiện nay, ở nước ta cũng chưa có nhiều nghiên cứu nhằm sử dụng sản phẩm phân huỷ sinh học lông gia cầm làm nguồn thức ăn bổ sung cho chăn nuôi; vì vậy hầu như chưa có ứng dụng nào trong thực tiễn nhằm xử lý theo hướng này.
1.3. SỰ PHÂN HUỶ KERATIN TRONG TỰ NHIÊN Thời gian cần thiết để lông gà thực sự bị phân huỷ tự nhiên là 5 7 năm. Trong tự nhiên, những vi sinh vật có enzim keratinaza có khả năng phân huỷ keratin gồm nhiều nhóm: nấm ( Aspergillus, Onygena, Absidia, Rhyzomucor, Alternaria radicina, Trichurus spiralis, Stachybotrys atra,…), xạ khuẩn, vi khuẩn (7, 10, 13, 20, 22, 24, 25, 29, 30, 31, 35, 39, 43, 44, 45). Nhiều chủng vi khuẩn đã được phân lập (6) như thống kê bảng sau: Vi khuẩn phân lập được Nguồn gốc Gram dương Bacillus licheniformis PWD1 Chất thải gia cầm B. subtilis S14 Đất B. pumilus, Chất thải gia cầm B. licheniformis và B. cereus B. pseudofirmus Hồ kiềm xút B. maccoides và Đất bãi cỏ khô Bacillus cereus Streptomyces pactum DSM 40530 Môi trường sưu tầm Streptomyces albidoflavus K102 Đất dưới chuồng gà Streptomyces themoviolaceus Đất Fervidobacterium pennavorans Đất Microbacterium sp. kr10 Lông vũ bị phân huỷ
Microbispora aerate và Đất cực nam Streptomyces flavus Terrabacter terrae Đất Kocuria rosea Đất Gram âm Vibrio sp. kr2 Chất thải lò mổ Lysobacter sp. NCIMB 9497 Môi trường sưu tầm Stenotrophomonas sp Lông hươu Chryseobacterium sp. kr6 Lông phân huỷ Alcaligenes faecalis, Đất bãi cỏ khô Janthinobacterium lividum, Stenotrophomonas maltophilia 1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN HUỶ KERATIN 1.4.1. Phương pháp lý hoá Keratin có thể bị phân huỷ bởi các phương pháp lý hoá như thuỷ phân trong môi trường axit, môi trường kiềm ở nhiệt độ và áp suất cao. Nghiên cứu đầu tiên của việc sử dụng nhiệt để cải thiện giá trị dinh dưỡng từ thức ăn phân huỷ lông vũ là của Draper (1944). Kể từ đó, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện nhằm bổ sung thông tin nhằm nâng cao giá trị dinh dưỡng từ thức ăn lông vũ thuỷ phân (23). Điều kiện chế biến có ảnh hưởng rõ rệt đến giá trị dinh dưỡng của thức ăn từ lông thuỷ phân. Ở áp suất thấp và thời gian thuỷ phân dài có thể nâng giá trị dinh dưỡng và cải thiện khả năng tiêu hoá của động vật sử dụng thức ăn đó; tuy nhiên hiệu quả phân giải thấp.
Thông thường, lông được thuỷ phân bằng cách đun trong một nồi áp lực từ 30 đến 45 pounds/square/inch trong 30 đến 60 phút. Hiệu quả thuỷ phân có thể đạt 80 đến 85%. Tuy nhiên, phương pháp này không chỉ phá huỷ một số axit amin (methionin, lysin, histidin), sản sinh một số chất độc, nên khó sử dụng sản phẩm phân huỷ theo cách này để làm thức ăn cho chăn nuôi hay tận dụng nguồn protein cho các mục đích khác. Bên cạnh đó, phân huỷ lông vũ theo phương pháp này còn tiêu thụ một lượng lớn năng lượng. Nhiều nơi, keratin thô bị xử lý bằng cách đốt. Phương pháp này tạo ra một số khí gây ô nhiễm môi trường đồng thời lãng phí nguồn protein từ keratin. 1.4.2. Phương pháp sinh học Thuỷ phân lông vũ nhờ các vi sinh vật có hoạt tính keratinaza là một phương pháp thay thế được lựa chọn đem lại hiệu quả cao, khắc phục được những hạn chế của các phương pháp lý hoá. Người ta đã tiến hành phân lập được các vi sinh vật bao gồm cả nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn với nhiều chủng có hoạt tính keratinaza cao được sử dụng trong việc phân huỷ lông vũ và sử dụng sản phẩm phân huỷ đó làm nguồn thức ăn bổ sung cho chăn nuôi. Chúng là loài chung của nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn như: Doratomyces microsporus, Aspergillus sp, Alternaria radicina, Trichurus spiralis, Stachybotrys atra, Onygena sp, Absidia sp, Rhizomucor sp , Streptomyces pactum, S. albs, S. thermoviolaceus, S. fradiae , S.thermonitrificans , Flavobacterium pennavorans, Bacillus sp , Stenotrophomonas sp , Bacillus licheniformis và B. pumilus và Vibrio sp.
Phân huỷ lông vũ trong quá trình lên men của các nhóm vi khuẩn ưa nhiệt như Bacillus, Streptomyces, Vibrio, Chryseobacterium đã được ứng dụng rộng rãi hơn cả. Những vi sinh vật này tiết keratinaza ngoại bào khi môi trường có keratin phân huỷ keratin thành các axit amin hoặc các peptit ngắn, những chất này được vi sinh vật sử dụng làm nguồn cacbon và nitơ. 1.5. ĐẶC ĐIỂM CỦA KERATINAZA Keratinaza là enzim thuỷ phân protein ngoại bào trong tự nhiên. Keratinaza có tên IUB là EC 3.4.99, có trọng lượng phân tử từ hàng chục đến vài trăm kDa. Keratinaza chủ yếu được xếp vào nhóm proteaza serin do có đến 97% cấu trúc giống với cấu trúc của proteaza serin và cũng bị ức chế bởi các chất ức chế proteaza serin (7, 40). Hầu hết các keratinaza đã phát hiện được cho đến nay là serin proteaza (5, 7, 12, 22), và một vài Metallo proteaza (6). Theo Brandelli, A. (2008), đặc điểm của keratinaza ở một số chủng vi sinh vật như sau: Vi sinh vật Nhóm Trọng lượng pH tạo ra enzim phân tử (kDa) tối thích B. licheniformis PWD1 Serine 33 7.5 B. subtilis KS1 Serine 25.4 7.5 B. pseudofimus FA 3010 Serine 27.5 910 S. pactum DSM 40530 Serine 30 710