intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Phân tích đa dạng di truyền nguồn tài nguyên một số loài cây dược liệu ở Việt Nam bằng chỉ thị ADN

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:95

Thêm vào BST
Báo xấu
104
lượt xem 17
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn nhằm nghiên cứu phân tích tính đa dạng di truyền của một số loài cây thuốc quý ở nước ta hoặc đang bị đe dọa cần được ưu tiên bảo tồn, hoặc có đặc điểm hình thái giống nhau cần có sự hỗ trợ của các kỹ thuật sinh học phân tử trong công tác phân loại.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Phân tích đa dạng di truyền nguồn tài nguyên một số loài cây dược liệu ở Việt Nam bằng chỉ thị ADN

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Cẩm Dương PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN TÀI NGUYÊN MỘT SỐ LOÀI CÂY DƯỢC LIỆU Ở VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ ADN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2010
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Cẩm Dương PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN TÀI NGUYÊN MỘT SỐ LOÀI CÂY DƯỢC LIỆU Ở VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ ADN Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Đinh Đoàn Long Hà Nội - 2010
  3. LỜI CẢM ƠN Để có thể hoàn thành luận văn này, trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Đinh Đoàn Long, Chủ nhiệm bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong công tác nghiên cứu khoa học. Đồng thời, tôi cũng muốn trân trọng cảm ơn các cán bộ thuộc Khoa tài nguyên dược liệu, Viện Dược liệu (Bộ Y tế), đã cung cấp và giúp tôi phân loại mẫu thực vật sử dụng trong nghiên cứu này. Qua đây tôi muốn được bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất tới các thầy, cô giáo của bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học trong đó đặc biệt là Th.S Trần Thị Thùy Anh đã tạo điều kiện thuận lợi và động viên tôi trong suốt quá trình học tập tại bộ môn. Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới Ban giám độc PTNTĐ Công nghệ Enzyme và Protein thuộc Khoa Sinh học đã luôn tạo điều kiện thuận lợi cho tôi về trang thiết bị và cơ sở vật chất trong quá trình học tập và nghiên cứu. Đề tài nghiên cứu của tôi được hỗ trợ một phần tài chính từ đề tài Klept.09.05 thuộc PTNTĐ Công nghệ Enzym và Protein. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô cùng sâu sắc tới bố mẹ, các bác và đặc biệt là anh chị tôi, những người đã luôn hỗ trợ tôi về mọi mặt trong suốt quá trình học tập tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQG Hà Nội). Nhân dịp này, tôi trân trọng gửi lời cảm ơn tới các anh chị khóa trên, bạn bè thân thiết luôn cổ vũ, động viên và sát cánh bên tôi trong suốt quá trình học tập vừa qua. Hà Nội, tháng 12 năm 2010 Học viên Nguyễn Cẩm Dương
  4. DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt Nghĩa tiếng Anh ADN Axit deoxyribonucleic Deoxyribonucleic acid ADNts ADN tổng số Total DNA ARN Axit ribonucleic Ribonucleic acid ASSOCHAM Hiệp hội thương mại và công nghiệp The Associated Chambers of Ấn Độ Commerce and Industry of India cs cộng sự Co-workers CTAB Cetyltrimethylammonium bromide Cetyltrimethylammonium bromide bp Cặp bazơ nitơ base pair ddH2O Nước cất khử trùng hai lần Double distilled water DDT Thuốc trừ sâu dichloro-diphenyl- Dichloro-Diphenyl-Trichloroethane trichloroethane dNTP Deoxyribonucleotit triphosphat Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylene diamine tetraacetat Ethylene diamine tetraacetate HPLC Sắc ký lỏng cao áp High pressure liquid chromatography IUCN Liên minh bảo tồn thiên nhiên thế International Union for Conservation giới of Nature kb Kilo bazơ Kilo base NTSYS Phần mềm hệ thống phân loại số Numerical Taxonomy System M Thang ADN chuẩn Marker OD Mật độ quang phổ hấp thụ Optical Density OPA,OPC Các mồi oligonucleotit PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp ADN Polymerase Chain Reaction RAPD Đa hình phân đoạn ADN nhân bản Random Amplified Polymorphic ngẫu nhiên DNA RAPD-PCR Tương tự như RAPD Rb1 Nhóm ginsenoside Rb1 (có mặt của The ginsenoside Rb1 group protopanaxadiol) RFLP Đa hình độ dài các đoạn giới hạn Restriction fragment length polymorphism i
  5. Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt Nghĩa tiếng Anh Rg1 Ginsenoside nhóm Rg1 (có chứa The ginsenoside Rg1 group protopanaxatriol) STR/SSR Trình tự vi vệ tinh Microsatellite/simple tandem repeats TBE Đệm gồm Tris, Borate và EDTA Tris/Borate/EDTA buffer TE Đệm gồm có Tris và EDTA UPGMA Thuật toán phân cặp dựa trên giá trị Unweighted pair group with arthmetic trung bình means V Vol Volte v/v Tỉ lệ pha theo thể tích/thể tích Volume/volume WHO Tổ chức Y tế thế giới World Health Organization ii
  6. MỤC LỤC MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................... 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY DƯỢC LIỆU .................................................................... 3 1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................... 7 1.3. LÝ DO THỰC HIỆN ĐỀ TÀI................................................................................ 12 1.3.1. Thực trạng nghiên cứu về cây dược liệu ở Việt Nam hiện nay ..................... 12 1.3.1.1. Nghiên cứu về chi Acanthopanax .......................................................... 12 1.3.1.2. Nghiên cứu về chi Illicium ................................................................... 14 1.3.1.3. Nghiên cứu về chi Morinda .................................................................. 15 1.3.1.4. Nghiên cứu về chi Panax L. .................................................................. 16 1.3.2. Chỉ thị ADN – Chỉ thị RAPD-PCR .............................................................. 19 1.3.3. Mục tiêu của đề tài ...................................................................................... 22 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 24 2.1. VẬT LIỆU THỰC VẬT ........................................................................................ 24 2.1.1. Chi Acanthopanax ....................................................................................... 24 2.1.2. Chi Illicium.................................................................................................. 26 2.1.3. Chi Morinda ................................................................................................ 27 2.1.4. Chi Panax L. ............................................................................................... 28 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................... 31 2.2.1. Tách chiết ADN tổng số bằng phương pháp Mini-CTAB cải tiến ................ 31 2.2.2. Phân tích di truyền bằng kỹ thuật RAPD-PCR ............................................. 33 2.2.3. Điện di ADN trên gel agarose ...................................................................... 34 2.2.4. Dựng cây quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYSpc 2.02h ..................... 35 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 38 3.1. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ ............................................................. 38 iii
  7. 3.1.1. Kết quả tách chiết ADNts từ các mẫu thực vật thuộc chi Acanthopanax ...... 38 3.1.2. Kết quả tách chiết ADNts từ các mẫu thực vật thuộc chi Illicium................. 38 3.1.3. Kết quả tách chiết ADNts từ cây Ba kích (Morinda officinalis How) ........... 39 3.1.4. Kết quả tách chiết ADNts các mẫu thực vật thuộc chi Panax L. .................. 39 3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁC LOÀI CÂY THUỐC TRONG NGHIÊN CỨU ................................................................................ 41 3.2.1. Sự đa dạng di truyền giữa các loài cây thuốc thuộc chi Acanthopanax .... 42 3.2.1.1. Phân tích đa hình loài ngũ gia bì gai (A. trifoliatus) ............................. 43 3.2.1.2. Phân tích đa hình loài ngũ gia bì hương (A. gracilistylus) .................... 46 3.2.2. Sự đa dạng di truyền giữa loài cây thuốc thuộc chi Illicium. .................... 48 3.2.2.1. Phân tích đa dạng di truyền loài hồi hương ....................................... 48 3.2.2.2. Phân tích đa dạng di truyền của các loài hồi núi .................................. 51 3.2.3. Sự đa dạng di truyền của loài cây thuốc Ba kích ....................................... 53 3.2.4. Sự đa dạng di truyền của loài cây thuốc thuộc chi Panax L ...................... 56 3.2.5. Bước đầu xác định tập hợp một số chỉ thị RAPD-PCR giúp phân biệt nhanh nguồn nguyên liệu từ các loài thực vật trong nghiên cứu ......................... 61 3.2.5.1. Chỉ thị ADN giúp phân biệt nguồn dược liệu từ các loài dược liệu Ngũ gia bì gai và Ngũ gia bì hương ................................................................ 61 3.2.5.2. Chỉ thị ADN (RAPD-PCR) giúp phân biệt nguồn dược liệu từ loài hồi hương với các loài hồi núi ......................................................................... 63 3.2.5.3. Chỉ thị ADN (RAPD-PCR) giúp phân biệt các dạng hình thái khác nhau của loài Ba kích ...................................................................................... 64 3.2.5.4. Chỉ thị ADN (RAPD-PCR) giúp phân biệt các loài Sâm Việt Nam, Sam Vũ Diệp và Tam thất hoang ..................................................................... 66 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................. 68 KẾT LUẬN........................................................................................................... 68 KIẾN NGHỊ .......................................................................................................... 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 70 iv
  8. DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1. Thế hệ chỉ thị ADN đầu tiên 7 Bảng 2. Thế hệ chỉ thị ADN thứ hai 7 Bảng 3. Thế hệ chỉ thị ADN mới 10 Bảng 4. Danh sách mẫu cây dược liệu được thu thập và phân tích trong nghiên cứu 25 Bảng 5. Thành phần (bảng bên trái) và quy trình nhiệt (bảng bên phải) của phản ứng RAPD-PCR 34 Bảng 6. Số băng RAPD đa hình thu được từ các mẫu quần thể loài Acanthopanax trifoliatus và A. gracilistylus phân tích với 16 mồi ngẫu nhiên. 42 Bảng 7. Số băng ADN đa hình thu được từ các mẫu quần thể loài Ngũ gia bì gai (A. trifoliatus) (ký hiệu G) thu tại Lào Cai, Cao Bằng và Lạng Sơn được phân tích theo từng mồi RAPD. 45 Bảng 8. Số băng RAPD đa hình thu được từ các mẫu quần thể loài Illicium verum và các loài hồi núi phân tích với 15 mồi ngẫu nhiên. 48 Bảng 9. Số băng RAPD đa hình thu được từ các mẫu quần thể loài Ba kích (Morinda officinalis) với các dạng hình thái khác nhau: dạng thân có lông (L); dạng thân không có lông (K); dạng quả tụ (T) và dạng quả rời (R) với 12 mồi ngẫu nhiên. 53 Bảng 10. Số băng RAPD đa hình thu được từ các mẫu thuộc ba loài Sâm Việt Nam (SVN), Sâm Vũ Diệp (SVD) và Tam thất hoang (TTH) phân tích với 13 mồi ngẫu nhiên. 57 Bảng 11. Tập hợp các chỉ thị ADN (chỉ thị RAPD-PCR) đặc trưng có thể giúp phân biệt các loài dược liệu trong nghiên cứu. 67 v
  9. DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1. Ảnh các loài thực vật thuộc chi Acanthopanax trong nghiên cứu: a-b) Bụi cây, lá và hoa cây Ngũ gia bì gai; c-d) Bụi cây, lá và hoa cây Ngũ gia bì hương. 26 Hình 2. a-b) Hình thái lá và quả cây Hồi hương (Illicium verum Hook.f); c-d) hình thái lái và quả của cây hồi núi (I. anasitum). 27 Hình 3. Hình thái các loại kiểu hình của cây Ba kích sử dụng trong nghiên cứu: a) quả tụ; b) quả rời; c) thân có lông; d) thân không có lông. 28 Hình 4. Các loài thực vật thuộc chi Panax L. trong nghiên cứu: a) Sâm Việt Nam (P. vietnamensis); b) Sâm Vũ Diệp (P. bipinnatididus); c) dạng trung gian giữa Sâm Vũ Diệp- Tam thất hoang; d) Tam thất hoang (P. stipulenatus). 29 Hình 5. Bản đồ các địa phương thu mẫu dược liệu trong nghiên cứu 30 Hình 6. ADNts tách chiết từ các phần mô khác nhau: hình bên trái - ADNts từ các mẫu cây Hồi hương (I); hình bên phải - ADNts từ các phần mô khác nhau ở cây sâm (V). M: thang ADN chuẩn. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu nêu ở Bảng 4. 40 Hình 7. Ảnh điện di ADN tổng số các mẫu dược liệu được thu thập trong nghiên cứu: a) mẫu các loài Ngũ gia bì gai (G) và Ngũ gia bì hương (H); b) mẫu các loài Hồi hương (I) và Hồi núi (N); c) mẫu các loài Ba kích (K); d) mẫu các loài Sâm Việt Nam (S), Sâm Vũ Diệp (V), Tam thất hoang (T) và dạng trung gian Sâm Vũ Diệp-Tam thất hoang (VT). M: thang ADN chuẩn. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu nêu ở Bảng 4. 40 Hình 8. Hình ảnh điện di một số sản phẩm RAPD-PCR ở các mẫu Ngũ gia bì gai (G) và Ngũ gia bì hương (H) trong nghiên cứu: a) Sản phẩm điện di với mồi OPC9; b) Sản phẩm điện di với mồi OPA5. M: thang ADN chuẩn. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu nêu ở Bảng 4. 43 Hình 9. Sơ đồ hình cây về quan hệ di truyền giữa các mẫu thuộc hai loài cây thuốc Ngũ gia bì gai (Acanthopanax trifoliatus – ký hiệu G) và Ngũ gia bì hương (A. gracilistylus – ký hiệu H) thu thập được ở Việt Nam trên cơ sở phân tích chỉ thị RAPD-PCR. Nguồn gốc và đặc điểm của các mẫu nêu ở Bảng 4. 44 Hình 10. Sơ đồ cây quan hệ di truyền của 39 mẫu Hồi hương với 11 mẫu Hồi núi trong nghiên cứu. Nguồn gốc và đặc điểm của các mẫu được nêu tại Bảng 4. 52 Hình 11. Sơ đồ hình cây phản ánh mối quan hệ di truyền giữa 25 dòng Ba kích trong nghiên cứu. Nguồn gốc và đặc điểm của các mẫu được trình bày tại Bảng 4. 54 vi
  10. Hình 12. Băng đồng hình (chỉ ra bởi hình đầu mũi tên) của các mẫu Sâm Việt Nam (S), Sâm Vũ Diệp (V), Tam thất hoang (T) và dạng trung gian giữa Sâm Vũ Diệp-Tam thất hoang (VT) tương ứng với mồi OPA14, OPC1 và OPA7. 57 Hình 13. Cây quan hệ di truyền giữa các mẫu Sâm Việt Nam (ký hiệu S), Sâm Vũ Diệp (ký hiệu V), dạng trung gian của Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang (ký hiệu VT) và Tam thất hoang (ký hiệu T) trong nghiên cứu lập bởi số liệu thu được từ phân tích RAPD-PCR. Nguồn gốc và đặc điểm của các mẫu được nêu ở Bảng 4. 59 Hình 14. Băng đồng hình (chỉ ra bởi hình mũi tên) của các mẫu ngũ gia bì gai (G) và ngũ gia bì hương (H) trong nghiên cứu với mồi OPA10. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu được nêu ở bảng 4. 62 Hình 15. Băng đặc trưng phân biệt (chỉ ra bởi hình mũi tên) của các mẫu Ngũ gia bì gai (G) và Ngũ gia bì hương (H) trong nghiên cứu với mồi OPA12 (hình bên trái) và mồi OPA1 (hình bên phải). M: thang ADN chuẩn. Trong đó, chỉ thị OPA12750 và OPA1500 đặc trưng cho các mẫu thuộc loài Ngũ gia bì gai; chỉ thị OPA12950 và OPA1300 đặc trưng cho các mẫu thuộc loài Ngũ gia bì hương. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu được nêu ở Bảng 4. 62 Hình 16. Băng đồng hình (chỉ ra bởi hình mũi tên) của các mẫu thuộc nhóm loài Hồi hương (I) (hình bên phải) và các loài Hồi núi (N) trong nghiên cứu với mồi OPA7 (hình bên trái). M: thang ADN chuẩn. Băng đặc trưng phân biệt của hồi núi là băng có kích thước 1800 bp. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu được nêu ở Bảng 4. 63 Hình 17. Băng đồng hình (chỉ ra bởi hình mũi tên) ở tất cả 25 mẫu Ba kích trong nghiên cứu với chỉ thị OPA17. Dạng hình thái thân có lông (L), không có lông (K), dạng hình thái quả tụ (T) và hình thái quả rời (R). Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu được nêu ở Bảng 4. M: thang ADN chuẩn. 64 Hình 18. Hình ảnh điện di các mẫu Ba kích với mồi OPA1. Băng đồng hình giữa hai dạng hình thái thân có lông (L) và không có lông (K) có kích thước 600 bp và 300 bp (chỉ ra bởi hình mũi tên). Băng đặc trưng phân biệt của kiểu hình thái thân không có lông có kích thước 1100 bp. Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu được nêu ở Bảng 4. M: thang ADN chuẩn. 65 Hình 19. Ảnh điện di các mẫu Sâm Việt Nam (S), Sâm vũ diệp (V), dạng trung gian (VT) và Tam thất hoang (T) với mồi OPA14 và OPC16, hình mũi tên chỉ ra các băng đặc hiệu phân biệt còn hình đầu mũi tên chỉ ra các băng chung. M: thang ADN chuẩn (1kb marker). Nguồn gốc và đặc điểm của các mẫu được nêu ở Bảng 4. 66 vii
  11. LUẬN VĂN THẠC SĨ MỞ ĐẦU Theo ước tính hơn 80% dân số trên toàn thế giới hiện nay vẫn phụ thuộc vào các loại thuốc có nguồn gốc thảo dược trong việc chăm sóc sức khỏe. Các liệu pháp chữa bệnh dựa vào thảo dược được đánh giá thông qua tính khả dụng và dựa vào kinh nghiệm lưu truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Phần lớn các loài cây thuốc hiện nay chủ yếu được thu hái từ tự nhiên. Việc thu hái như vậy nếu không có sự kiểm soát chặt chẽ dễ gây nên sự suy kiệt tài nguyên di truyền của các loài cây thuốc nói riêng cũng như của nguồn tài nguyên thực vật nói chung. Đây cũng là nguyên nhân có thể dẫn tới chất lượng sản phẩm kém ổn định. Bên cạnh đó, nhiều loài dược liệu quý hiếm có thể bị làm giả hoặc thay thế bằng các dạng dược liệu có hình thái tương tự, dẫn tới những tác dụng không mong muốn khi sử dụng. Việt Nam có gần 4.000 loài cây thuốc. Với thế mạnh về tài nguyên dược liệu dồi dào như vậy, chúng ta có thể hy vọng phát hiện và phát triển được thuốc mới từ nguồn tài nguyên tự nhiên phong phú này. Tuy vậy, hiện nay công tác bảo tồn, gìn giữ, chọn tạo giống và phát triển nguồn gen cây thuốc vẫn chưa phát huy hết tiềm năng. Nhiều loài cây thuốc quý hiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng do bị khai thác ồ ạt và thiếu kế hoạch. Những vấn đề trên đặt ra một yêu cầu cấp thiết là cần có các biện pháp bảo tồn và phát triển nguồn tài nguyên dược liệu của nước ta, cũng như cần phát triển công tác kiểm định dược liệu nhằm đánh giá hiệu quả nguồn nguyên liệu ban đầu bảo đảm chất lượng sản phẩm phục vụ ngành công nghiệp dược trong nước về lâu dài. Trên thế giới, việc sử dụng các chỉ thị ADN (RAPD-PCR, RFLP-PCR, AFLP, SSR, ...) ngày càng được dùng rộng rãi trong các nghiên cứu phân loại, phân tích đa dạng sinh học, xác định khoảng cách di truyền và đặc trưng cá thể và quần thể thực vật nhằm mục đích bảo tồn và chọn giống. So với các chỉ thị truyền thống (chỉ thị hình thái và chỉ thị hóa học), thì chỉ thị ADN mang những ưu điểm nổi bật: dễ thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào các yếu tố môi trường và hiện tượng tương tác gen, có thể xác định được các biến dị ADN trong các giai đoạn khác nhau và ở các cơ quan khác nhau ở thực vật. Việc phân tích các chỉ thị 1
  12. LUẬN VĂN THẠC SĨ ADN cho phép đánh giá một cách chính xác mức độ đa dạng di truyền của một loài cây thuốc nào đó nhằm định hướng bảo tồn, chọn, tạo và nhân giống phù hợp, đáp ứng yêu cầu của quá trình phát triển một nền công nghiệp chế biến dược liệu bền vững. Trên cơ sở đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phân tích tính đa dạng di truyền của một số loài cây thuốc quý ở nước ta hoặc đang bị đe dọa cần được ưu tiên bảo tồn, hoặc có đặc điểm hình thái giống nhau cần có sự hỗ trợ của các kỹ thuật sinh học phân tử trong công tác phân loại. Luận văn này trình bày kết quả phân tích chỉ thị ADN (chủ yếu dựa trên kỹ thuật RAPD-PCR) của 4 nhóm loài cây thuốc được thu thập ở nước ta, đó là: 1) chi Acanthopanax (họ Araliaceae) gồm 2 loài là Ngũ gia bì gai (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.) và Ngũ gia bì hương (A. gracilistylus W.W. Smith); 2) chi Illicium gồm loài Hồi hương (Illicium verum Hook.f) và một số loài Hồi núi (Illicium spp.); 3) một số dạng hình thái khác nhau về đặc điểm thân và quả của loài Ba kích (Morinda officinalis How.); 4) chi Nhân sâm (Panax; họ Ngũ gia bì Araliaceae) gồm 3 loài là Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv), Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T. Tsai et K.M. Feng). 2
  13. Chng 1. Tng quan tài liu NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY DƯỢC LIỆU Việc sử dụng các loài cây dược liệu làm thuốc nhằm phòng chống và điều trị bệnh đã được áp dụng từ lâu trong lịch sử loài người [61]. Việc sử dụng cây dược liệu có lẽ đã được bắt đầu ngay từ thời cổ đại (Bensky và Gamble, 1993). Trong nền văn hóa cổ xưa, con người tổng hợp những thông tin về cây dược liệu dựa trên các bài thuốc được lưu truyền trong dân gian qua đó phát triển lên thành các cuốn dược điển về cây dược liệu. Những minh chứng sớm nhất cho những hiểu biết của con người được ghi chép lại về dược liệu được ghi nhận tại Ấn Độ, Trung Quốc, Ai Cập, Hi Lạp, La Mã và Xy-ri khoảng 5000 năm trước. Ví dụ như những thông tin cổ xưa nhất về cây dược liệu của người Ai Cập được tổng hợp trong 2 cuốn sách là Charak Samhita và Sushruta Samhita [59]. Ước tính có khoảng 25% các loại thuốc được sử dụng hiện nay trên thế giới có nguồn gốc từ thực vật và có khoảng 121 hợp chất có hoạt tính đang được sử dụng. Trong tổng số 252 loại thuốc thiết yếu mà WHO đã liệt kê thì có tới 11% có nguồn gốc từ thực vật [68]. Gần như 80% dân số Châu Phi và Châu Á phụ thuộc vào các loại thuốc cổ truyền để chăm sóc sức khỏe [56, 81, 92]. Khoảng 3 thập kỷ trước đây, theo Lipp (1996) chỉ có một lượng nhỏ các sản phẩm có nguồn gốc từ cây thảo mộc được kiểm nghiệm trên một số bệnh cụ thể [59]. Tính đến nay, trên thế giới hiện vẫn còn nhiều người ưa dùng các sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên để điều trị một số loại bệnh tật (theo Nazma và cộng sự, 2010). Các sản phẩm được chế biến từ cây dược liệu thường được sử dụng ở các bệnh nhân mắc một số bệnh mạn tính, bao gồm ung thư vú (12%; Burstein, 1999), các bệnh về phổi (21%; Strader, 2002), virut gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV) (22%; Kassler, 1991), bệnh hen suyễn (24%; Blanc, 2001) và rối loạn thấp khớp (26%; Rao, 1999). Khoảng 960 loài thực vật đã được sử dụng bởi ngành công nghiệp thảo dược ở Ấn Độ thì có tới 178 loài thực vật vượt qua sản lượng 100 tấn mỗi năm [41]. Thị trường dược liệu tại Ấn Độ đang biểu lộ một sự tăng trưởng đặc biệt có thể đạt 3
  14. Chng 1. Tng quan tài liu NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ doanh thu là 145.000 triệu rubi (tương đương khoảng 3,1 tỉ đôla Mỹ) vào năm 2010. Đồng thời việc xuất khẩu dược liệu của quốc gia này có thể đạt doanh thu là 90.000 triệu rubi (tương đương 2 tỉ đô la Mỹ) (theo thống kê của tổ chức ASSOCHAM, 2008 [59]). Ảnh hưởng của cây dược liệu tới sức khỏe con người Thông thường mọi người thường tin rằng nguy cơ gây hại của các loại thảo dược là rất ít, tuy nhiên trong thực tế nhiều báo cáo đã chỉ ra rằng sản phẩm từ cây dược liệu có thể dẫn tới những hậu quả nghiêm trọng. Việc dùng sai các loại dược liệu hay các sản phẩm dược liệu giả mạo đã đặt ra một vấn đề vô cùng quan trọng về độ an toàn cũng như tính hiệu quả của các sản phẩm dược liệu. Nhiều loại dược phẩm phổ biến thậm chí có giá thành đắt hiện nay thực chất là những sản phẩm thay thế kém chất lượng hoặc là các sản phẩm dược liệu thô đã được làm giả [19]. Việc làm giả các sản phẩm từ dược liệu cũng như việc dùng sai chúng có thể dẫn tới nhiều bệnh như suy thận, tim mạch, … đã được ghi nhận tại nhiều nơi trên thế giới như Anh quốc [19, 59], Mỹ [59, 97], Ấn Độ [59], Việt Nam [2]… Một vấn đề khác trong việc sử dụng các loài dược liệu đó chính là sự có mặt của kim loại nặng (thủy ngân, chì , arsen, …) có khả năng gây độc [19, 26, 54, 72]. Việc nhiễm độc đã được ghi nhận ở tất cả các bước từ bước khởi đầu là thu thập dược liệu thô cho tới công đoạn sản xuất [19, 54]. Ghi nhận đầu tiên về trường hợp nhiễm độc kim loại nặng vào năm 1978 tại Anh. Sau đó đã có hơn 50 trường hợp nhiễm độc kim loại nặng từ nhiều vùng khác nhau trên thế giới bao gồm trong đó có lục địa Ấn Độ, Bắc Mỹ, Trung Đông, Tây Âu và Australia [26, 72]. Sự lắng đọng cặn thuốc diệt cỏ trong các cây dược liệu cũng là một vấn đề gây ảnh hưởng nghiêm trọng trong quá trình phát triển và đẩy mạnh việc quốc tế hóa các sản phẩm dược liệu truyền thống. Sự nhiễm độc từ các cây dược liệu thô cũng như các sản phẩm hay chế phẩm của nó (sự pha chế, sắc thuốc,…) được ghi nhận là ngày càng tăng. Một nghiên cứu gần đây với 280 mẫu có nguồn gốc từ 30 loài dược liệu Trung Quốc về độ lắng đọng cặn thuốc trừ sâu cho thấy có tới 78,5% mẫu có chứa tối thiểu một loại thuốc trừ sâu organochlorine như PCNB, aldrin, BHC hay DDT [94], 4
  15. Chng 1. Tng quan tài liu NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ đều là những chất có nguy cơ ảnh hưởng tới sức khỏe người sử dụng [92]. Các loài cây dược liệu thường có thành phần các chất rất phức tạp chính là nguyên nhân dẫn tới khó khăn trong việc tìm ra phương pháp loại bỏ triệt để các chất lắng đọng bất lợi mà không làm mất di các thành phần có hoạt tính có trong các loài cây này [59]. Bên cạnh đó, đã có những báo cáo tổng hợp lại vấn đề nhiễm nấm trong quá trình thu hái, bảo quản, sản xuất và phân phối các sản phẩm dược liệu trên thế giới [59]. Việc thu hái trên quy mô rộng và không có tính kiểm soát các loài thực vật là nguyên nhân dẫn tới việc làm suy kiệt nguồn tài nguyên di truyền, bao gồm trong đó là các loài cây dược liệu [59]. Ví dụ như, loài anh đào Châu Phi (Pygeum hay Prunus africanum) được sử dụng rộng rãi để điều trị bệnh liên quan tới u tiền liệt tuyến, đang phải đứng trước nguy cơ cạn kiệt nguồn tài nguyên, dẫn tới hệ sinh thái bị ảnh hưởng nghiêm trọng do việc khai thác quá mức loài cây này ở châu Phi. Chính vì lẽ đó, kể từ năm 1995, trong Công ước Thương mại về động vật và thực vật hoang dã - CITES (Convention of International Trade in Endangered Species), loài thực vật này đã được thêm vào phần phụ lục dành cho các loài cần được bảo vệ [59, 79]. Theo sau đó Tổ chức IUCN cũng đưa loài dược liệu này vào trong danh sách các loài có nguy cơ tiệt chủng (Sách Đỏ). Loài đàn hương (Santalum spp.) phân bố ở Nam Á, Indonesia, Australia và Nam Thái Bình Dương dùng để sản xuất các sản phẩm gỗ và dầu thơm, cũng gặp trường hợp tương tự. Từ những nghiên cứu trên, chúng ta nhận thấy việc phát triển một hệ thống đánh giá hiệu quả các loài cây dược liệu và các thành phần của nó là một việc làm thiết yếu. Những phương pháp đảm bảo chất lượng cũng như độ an toàn của các sản phẩm này đã và đang được phát triển trên toàn thế giới, thông qua đó đẩy mạnh việc tiêu chuẩn hóa sản phẩm đầu ra, góp phần toàn cầu hóa các sản phẩm có nguồn gốc từ dược liệu. Bên cạnh đó việc tiêu chuẩn hóa nguồn dược liệu đang được phát triển rộng khắp trên phạm vi toàn thế giới. Đây là một việc làm có tính khả thi, nhưng lại rất khó để thực hiện. Vì rằng, quá trình kiểm định các loại dược liệu không được thực hiện một cách đồng bộ trên toàn bộ các quốc gia. Do đó, hiện nay trên thế giới 5
  16. Chng 1. Tng quan tài liu NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ có rất nhiều phương pháp được áp dụng để kiểm định nguồn dược liệu và các sản phẩm của chúng [59]. Tiêu chuẩn hóa dược liệu Tính phức tạp của quá trình tiêu chuẩn hóa dược liệu Cây dược liệu có rất nhiều đặc tính riêng, chính điều này làm cho các sản phẩm từ cây dược liệu khác với các loại thuốc tổng hợp [59]. Chúng thường chứa đồng thời nhiều hợp. Ví dụ như dược phẩm Huang-qin (Scutellaria baicalensis) có tới hơn 2000 hợp chất [73]. Những đặc điểm về mặt hóa học của các loài cây dược liệu bị ảnh hưởng bởi các điều kiện về thu hái, qui trình sản xuất và phân bố. Những đặc điểm về mặt sinh lý, di truyền cũng như những biến đổi về môi trường (quang chu kỳ, khí hậu, điều kiện đất, dinh dưỡng) đều có thể gây ảnh huởng tới các đặc điểm hóa sinh và khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp ở thực vật. Thành phần các hợp chất thức cấp trong dược liệu còn phụ thuộc vào thời gian thu hái, các phương pháp bảo quản, sấy khô, tách chiết để thu được sản phẩm đóng gói cuối cùng [59]. Tính ổn định ở tất cả các giai đoạn của quy trình sản xuất có ý nghĩa quan trọng để đảm bảo hiệu quả chữa bệnh và độ an toàn cho người sử dụng. Có rất nhiều loại chỉ thị như chỉ thị hình thái, hóa học, chỉ thị liên quan tới hệ gen (ADN), chỉ thị liên quan tới các protein (izozym), đều là những công cụ có thể dùng để xác định các thành phần có trong cây dược liệu [59, 76]. Dược điển Trung Quốc (ấn bản năm 2005) thống kê có tất cả 282 chỉ thị hóa học được sử dụng cho các loài cây thuốc [59]. Đây là một công cụ hữu ích dùng để xác định sự làm giả cũng như sự khác biệt của các sản phẩm dược liệu có nguồn gốc khác nhau, kiểm tra tính ổn định của các sản phẩm có tính chất độc quyền [59]. Các thành phần có độc tính có thể sử dụng như là các chỉ thị hóa học trong các phương pháp sàng lọc [49]. Tính cho tới thời điểm hiện tại, vẫn còn có rất nhiều loài dược liệu không có chỉ thị hóa học phù hợp để kiểm định chất lượng. Theo cuốn Dược điển Trung Quốc, chỉ có 282 trong tổng số 551 loài dược liệu có 1 hoặc 2 chỉ thị hóa học để kiểm định chất lượng. Thiếu những chỉ thị hóa học, mức độ tinh sạch 6
  17. Chng 1. Tng quan tài liu NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ của các chỉ thị đang có chính là nguyên chính cản trở việc kiểm định chất lượng của các sản phẩm dược liệu. Các hợp chất trao đổi thứ cấp là các chỉ thị được sử dụng rộng rãi trong việc kiểm định và tiêu chuẩn hóa các loài cây dược liệu. Do không bị ảnh hưởng bởi độ tuổi, điều kiện sinh lý và các nhân tố môi trường, nên các chỉ thị dựa trên phân tử ADN còn được sử dụng để phân biệt những biến dị giữa và trong loài với nhau. Chỉ thị đa hình phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên (RAPD) là chị thị được áp dụng thành công trong việc đánh giá sự khác biệt giữa các loài Taxus wallichiana Neem, Juniperus communis L., Codonopsis pilosula, Allium schoenoprasum L., A. paniculata được thu thập từ nhiều vùng địa lý khác nhau [39]. Phân tích RAPD và Eastern blotting sử dụng 2 kháng thể đơn dòng ginsenoside Rb1 và Rgl đã được áp dụng thành công trong viêc xác định 3 loài sâm là: Panax notoginseng, P. quinquefolius và P. japonicus. Đầu tiên, người ta sử dụng chỉ thị RAPD để phân biệt các loài Panax spp. với nhau. Sau đó bằng kỹ thuật Eastern Blot xác định sự có hay không có mặt chất ginsenoide Rc trong các sản phẩm tách chiết để định loại tên loài P. notoginseng trong phân tích Eastern blotting [76]. Mức độ an toàn và hiệu quả sử dụng của các loài dược liệu được hình thành thông qua quá trình sử dụng lâu dài của chúng. Mặc dù đã có những phép thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên trên một số loài dược liệu, nhưng để có thể kiểm định một cách triệt để thì cần phải có những nghiên cứu lâm sàng đầy đủ cùng với các nghiên cứu về mặt độc tính học trên các loài dược liệu này [59]. 1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Những tiến bộ gần đây trong lĩnh vực sinh học phân tử đã cung cấp những công cụ mới áp dụng vào việc làm sáng tỏ những nghi vấn còn tồn tại trong các nghiên cứu về tiến hóa, hình thái học và phân loại học. Những chỉ thị ADN có nhiều ưu điểm so với các chỉ thị hình thái vì chúng gắn liền với vật chất di truyền, tương đối dễ phân tích trong phòng thí nghiệm và ít bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường [24]. 7
  18. Chng 1. Tng quan tài liu NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ Trong hai thập kỉ gần đây, một số kỹ thuật chỉ thị phân tử đã được phát triển để phân tích về các hệ gen, phần lớn là để xác định những khác biệt giữa các cá thể trong cùng một loài (đa hình di truyền) hoặc để tìm mối tương quan giữa đa hình di truyền với các tính trạng nhất định. Tuy nhiên, vì giá thành tương đối cao tăng lên cùng với sự phát triển của các chỉ thị phân tử, cho nên những phương pháp này mới chỉ được áp dụng trên một số lượng hữu hạn các loài, và đa số là mới chỉ được tiến hành ở các nước phát triển. Việc ứng dụng các chỉ thị phân tử còn có xu hướng khu trú vào một lượng nhỏ các tính trạng hoặc một số vùng của hệ gen. Việc kết hợp các phương pháp và sự phát triển của việc lập bản đồ đã đưa ra triển vọng áp dụng các chỉ thị phân tử trên quy mô rộng, với số lượng lớn, qua đó làm giảm chi phí đầu tư [24]. Theo Maheswaran (2004) tổng kết, sự phát triển của các chỉ thị ADN có thể chia làm 3 thế hệ: (i) thế hệ chỉ thị ADN đầu tiên bắt đầu từ năm 1975 tới năm 1989; (ii) thế hệ chỉ thị ADN thứ hai bắt đầu từ năm 1990 đến năm 1993; (iii) thế hệ chỉ thị ADN hiện nay bắt đầu từ năm 1994 cho tới nay. Việc ra đời của kỹ thuật đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP; Grodzicker và cs, 1974) đã đánh dấu khởi điểm của thế hệ chỉ thị ADN đầu tiên. Ban đầu, chỉ thị RFLP được thu từ các loài virut [31], sau đó đã được kiểm chứng khi phân tích nhóm gen globin ở người [36]. Tiếp theo chỉ thị RFLP, một loạt các chỉ thị ADN được phát triển như: VNTR- Variable Number Tandem Repeats (Các mảnh lặp lại có thứ tự với một tần số khác nhau; Jeffreys, 1985); ASO-Allele Specific Oligonucleotides (xác định một trong hai dạng sơi đơn của một phân tử ADN sợi kép bằng các oligonucleotide; Saiki và cs, 1985); … Bảng 1 liệt kê một số chỉ thị ADN được phát triển trong thế hệ chỉ thị ADN đầu tiên. Cuộc cách mạng trong lĩnh vực nghiên cứu về di truyền học phân tử trên các vi vệ tinh – dãy trình tự ADN lặp lại của 2-, 3-, 4- và 5 nucleotide xuất hiện rải rác suốt hệ gen của các sinh vật nhân chuẩn đã đánh dấu sự ra đời của thế hệ chỉ thị ADN thứ hai. Các trình tự lặp lại đơn giản (SSR) này gần đây đã được xác định là những chỉ thị phân tử được dùng trong việc lập bản đồ hệ gen của một quần xã và 8
  19. Chng 1. Tng quan tài liu NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ được ưa dùng trong các nghiên cứu trên đối tượng thực vật. Một số chỉ thị khác được phát triển trong giai đoạn này được liệt kê tại Bảng 2. Bảng 1. Thế hệ chỉ thị ADN đầu tiên Năm Ký hiệu Tên đầy đủ (tiếng Anh) Tài liệu tham khảo 1974 RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Grofzicker và cs. (1974) 1985 VNTR Variable Number Tandem Repeats Jeffreys và cs. (1985) 1986 ASO Allele Specific Oligonucleotides Saiki và cs. (1986) 1988 AS-PCR Allele Specific Polymerase Chain Reaction Landegren và cs. (1988) 1988 OP Oligonucleotide Polymorphism Beckmann (1988) 1989 SSCP Single Stranded Conformational Polymorphism Orita và cs. (1989) Bảng 2. Thế hệ chỉ thị ADN thứ hai Năm Ký hiệu Tên đầy đủ (tiếng Anh) Tài liệu tham khảo 1990 RAPD Randomly Amplified Polymorphic DNA Williams và cs. (1990) 1990 AP-PCR Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction Welsh và McClelland (1990) 1990 STMS Sequence Tagged Micro Satellite Sites Beckmann and Soller (1990) 1991 RLGS Restriction Landmark Genome Scanning Hatada và cs. (1991) 1992 CAPS Cleaved Amplified Polymorphic Sequence Akopyanz và cs. (1992) 1992 DOP-PCR Degenerate Oligonucleotide Primer - PCR Telenius (1992) 1992 SSR Simple Sequence Repeats Akkaya và cs. (1992) 1993 MAAP Multiple Arbitrary Amplicon Profiling Caeteno-Anolles và cs. (1993) 1993 SCAR Sequence Characterized Amplified Region Paran và Michelmore (1993) Với sự phát triển gần đây của sinh học phân tử mở ra triển vọng áp dụng nhiều loại kỹ thuật phân tử để xác định cũng như dùng để cải tiến hệ gen của nhiều loài sinh vật khác nhau. Thông tin liên quan tới nền tảng của những kỹ thuật này cũng như ứng dụng của chúng đều có nguồn gốc từ việc áp dụng công nghệ lên những dự án hệ gen. Khoảng 10 năm gần đây khoa học đã chứng kiến sự hình thành của một dãy các chỉ thị phân tử với khả năng thực hiện cao được kết hợp với sự thay đổi từ phương thức thủ công cho tới sự tự động hóa một cách hoàn chỉnh. Theo đó thế hệ chỉ thị này sẽ có khả năng tiềm tàng vô cùng to lớn trong sự tìm hiểu những biến dị ở mức độ ADN. Trong thế hệ chỉ thị ADN mới này có thể kể đến các chỉ thị như 9
  20. Chng 1. Tng quan tài liu NCD LUẬN VĂN THẠC SĨ ISSR, là chỉ thị được phát triển trên nền tảng thế hệ chỉ thị SSR; hay SNP (đa hình các đơn nucleotide)… là các chỉ thị có hiệu quả cao trong việc phân tích đa hình di truyền. Bảng 3. Thế hệ chỉ thị ADN mới Năm Ký hiệu Tên đầy đủ (tiếng Anh) Tài liệu tham khảo 1994 ISSR Inter Simple Sequence Repeats Zietkiewicz và cs. (1994) 1994 SAMPL Selective Amplification Of Micro Satellite Morgante và Vogel (1994) Polymorphic Loci 1994 SNP Single Nuleotide Polymorphism Jordan và Humphries (1994) 1995 AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism Vos và cs. (1995) (SRFA) (Selective Restriction Fragment Amplification) 1996 ISTR Inverse Sequence-tagged Repeats Rohde (1996) 1997 DAMD- Directed Amplification Of Mini Satellite Bebeli và cs. 1997 PCR DNA-PCR 1999 IRAP Inter-retrotransposon Kalendar và cs. (1999) Đặc điểm của các chỉ thị phân tử nói chung và chỉ thị ADN nói riêng Mức độ đa hình Kỹ thuật sử dụng chính xác chỉ thị di truyền có mức độ đa hình cao nên được áp dụng trong việc lập bản đồ hệ gen. Mức độ đa hình trong số các chỉ thị di truyền phụ thuộc vào loại chỉ thị và phương pháp được sử dụng để xác định ra nó. Số lượng các alen Có hai kiểu chỉ thị: chỉ thị liên quan tới 2 alen và chỉ thị liên quan tới nhiều alen (đa alen). Tính đặc hiệu về locus Các chỉ thị được chia ra thành hai nhóm chính: các chỉ thị liên quan tới 1 locus (chỉ có một vị trí trên hệ gen) và chỉ thị liên quan tới đa locus (nhiều vị trí trên hệ gen). Các chỉ thị liên quan đến đơn locus thường được áp dụng trong việc lập bản đồ hệ gen trong khi đó các chỉ thị liên quan tới đa locus được áp dụng cho các nghiên cứu xây dựng tàng thư ADN hoặc phân tích đa dạng di truyền chung. Bản chất của các alen 10
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.26: Bộ 320 Luận Văn Thạc Sĩ Y Học
320 tài liệu
1236 lượt tải
THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2