Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Ứng dụng kỹ thuật phân tử lai huỳnh quang (FISH) nhằm xác định nhanh một số loài tảo độc hại biển Việt Nam

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:68

Thêm vào BST

Báo xấu

74
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Kết quả mong đợi của đề tài sẽ giúp cho việc nghiên cứu đánh giá, quan trắc biến động các loài vi tảo độc hại, cảnh báo các hiện tượng ô nhiễm môi trường biển (như thủy triều đỏ) trở nên thuận tiện, nhanh chóng và hiệu quả hơn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Ứng dụng kỹ thuật phân tử lai huỳnh quang (FISH) nhằm xác định nhanh một số loài tảo độc hại biển Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Lưu Xuân Hòa ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ LAI HUỲNH QUANG (FISH) NHẰM XÁC ĐỊNH NHANH MỘT SỐ LOÀI TẢO ĐỘC HẠI BIỂN VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2011
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Lưu Xuân Hòa ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ LAI HUỲNH QUANG (FISH) NHẰM XÁC ĐỊNH NHANH MỘT SỐ LOÀI TẢO ĐỘC HẠI BIỂN VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. ĐINH ĐOÀN LONG Hà Nội – Năm 2011
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là các kết quả nghiên cứu của chính tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là hoàn toàn trung thực, chính xác và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Các thông tin trong luận văn đều được trích dẫn tường minh. Tác giả LƯU XUÂN HÒA i
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành bản luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của mọi người. Từ tận đáy lòng, với những lời cảm ơn chân thành nhất tôi xin gửi đến: - PGS. TS. Đinh Đoàn Long, Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (Đại học Quốc gia Hà Nội) đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành bản luận văn này. - Các đồng nghiệp: TS. Nguyễn Văn Nguyên, Ths. Lê Thanh Tùng, CN. Vũ Tuấn Nam cùng các đồng nghiệp khác của Phòng nghiên cứu công nghệ sinh học biển, Viện nghiên cứu hải sản, những người đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn này. - Các thầy cô Khoa sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (Đại học Quốc gia Hà Nội), những người đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu giúp tôi hoàn thiện dần tư duy nghiên cứu khoa học. - Gia đình tôi, những người đã luôn bên tôi, giúp tôi vượt qua những khó khăn trong thời gian qua. Tác giả LƯU XUÂN HÒA ii
MỤC LỤC MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU .................................................................... 2 1.1. Khái quát về kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) ............................................. 2 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu, ứng dụng kỹ thuật FISH ................................................ 2 1.1.2. Trình tự đích và đầu dò trong phép lai huỳnh quang tại chỗ......................... 6 1.1.3. Các loại tín hiệu đánh dấu huỳnh quang ...................................................... 9 1.1.4. Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH trong vi tảo biển độc hại..... 13 1.2. Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH tại Việt Nam................................. 17 1.3. Các bước cơ bản của quy trình lai huỳnh quang tại chỗ - FISH ............................. 18 1.4. Đặc điểm sinh thái của một số loài vi tảo biển độc hại nghiên cứu ........................ 19 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................... 21 2.1. Địa điểm thu mẫu và đối tượng nghiên cứu ................................................ 21 2.2. Phương pháp thu và lưu giữ mẫu ................................................................ 21 2.3. Phương pháp phân loại hình thái ................................................................ 23 2.4. Phương pháp kiểm tra phân loại bằng ADN và thiết kế đầu dò ................... 23 2.4.1. Phương pháp chuẩn bị ADN khuôn ........................................................... 23 2.4.2. Phương pháp Singel cell PCR ................................................................... 23 2.4.3. Phương pháp kiểm tra phân loại bằng ADN ............................................... 24 2.4.4. Phương pháp thiết kế đầu dò đặc hiệu........................................................ 25 2.5. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ ........................................................ 25 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN......................................... 27 3.1. Kết quả phân lập và phân loại các chủng vi tảo độc hại bằng hình thái ....... 27 3.1.1. Loài Alexandrium affine............................................................................. 27 3.1.2. Loài A. pseudogonyaulax ........................................................................... 28 3.2. Ảnh hưởng của độ mặn tới nuôi sinh khối vi tảo tạo nguyên liệu ................ 29 3.3. Kết quả giải trình tự và phân loại bằng ADN các mẫu nghiên cứu .............. 31 3.4. Thiết kế đầu dò lai huỳnh quang tại chỗ ..................................................... 35 3.5. Tối ưu nhiệt độ lai và thử nghiệm đầu dò.................................................... 37 KẾT LUẬN..................................................................................................................... 43 KIẾN NGHỊ .................................................................................................................... 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 45 PHỤ LỤC ....................................................................................................................... 54 iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TT Chữ viết tắt Nội dung tiếng Anh Nội dung tiếng Việt 1. ADN Deoxyribonucleic acid Axít deoxyribonucleic 2. ARN Ribonucleic acid Axít ribonucleic 3. Bp Base pair Cặp bazơ 4. FISH Fluorescent in situ hybridization Phép lai huỳnh quang tại chỗ 5. FITC Fluorescein isothiocyanate Chất phát tín hiệu huỳnh quang 6. ISH In situ hybridization Phép lai tại chỗ 7. ITS Internal transcribed spacer Vùng đệm phiên mã 8. LSU Large subunit Tiểu phần lớn 9. PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp 10. PSP Paralytic shellfish poisoning Chất độc gây liệt cơ rADN Ribosomal deoxyribonucleic Trình tự ADN mã hóa 11. acid ribosome 12. rARN Ribosomal ribonucleic acid ARN ribosome 13. SSU Small subunit Tiểu phần nhỏ iv
DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Một số chất huỳnh quang được dùng phổ biến trong kỹ 10 thuật FISH Bảng 1.2: Trình tự đầu dò cho một số loài Alexandrium 16 Bảng 3.1: Một số điều kiện thích hợp cho nhân nuôi sinh khối tảo A. 31 affine và A. pseudogonyaulax trong phòng thí nghiệm v
DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Các cách gắn nhãn tín hiệu vào đầu dò 12 Hình 1.2. Các bước cơ bản của kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH 19 Hình 2.1. Sơ đồ phản ứng PCR nhân vùng D1-D2 của rADN 23 Hình 3.1. Một số đặc điểm hình thái của A. affine 27 Hình 3.2. Một số đặc điểm hình thái của A. pseudogonyaulax 28 Hình 3.3. Ảnh hưởng của độ mặn tới sự sinh trưởng của tảo A. affine 30 Hình 3.4. Ảnh hưởng của độ mặn tới sự sinh trưởng của tảo A. 30 pseudogonyaulax Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 2 32 Hình 3.6. Cây phát sinh chủng loại của một số loài thuộc chi Alexandrium 34 Hình 3.7. So sánh sự khác biệt trình tự nucleotit của A. affine với các loài 36 Alexandrium Hình 3.8. So sánh sự khác biệt trình tự nucleotit của A. pseudogonyaulax 37 với các loài Alexandrium Hình 3.9. Tế bào A. affine dưới ánh sáng thường (trái) và phát huỳnh 38 quang dưới ánh sáng kích thích (phải) với điều kiện lai 43°C Hình 3.10. Tế bào A. pseudogonyaulax dưới ánh sáng thường (trái) và 38 phát huỳnh quang dưới ánh sáng kích thích (phải) với điều kiện lai 43°C Hình 3.11. Lai đầu dò A. affine với mẫu tự nhiên 40 Hình 3.12. Lai đầu dò A. pseudogonyaulax với mẫu tự nhiên 40 vi
MỞ ĐẦU Trong nghiên cứu phân loại sinh vật phù du biển nói chung và vi tảo biển độc hại nói riêng, nhiều nhóm loài sinh vật rất khó hoặc hoàn toàn không thể phân loại đến loài nếu chỉ bằng phương pháp so sánh hình thái. Sự giống nhau về nhiều đặc điểm hình thái bên ngoài và khó nhận biết những đặc điểm khác nhau của chúng rất dễ dẫn đến nhầm lẫn trong nghiên cứu phân loại. Cùng với số lượng loài rất lớn có nhiều đặc điểm hình thái giống nhau, công tác nghiên cứu phân loại vi tảo biển trong nhiều trường hợp gặp nhiều khó khăn, tốn thời gian. Những điều này đã gây cản trở đối với công tác nghiên cứu hệ sinh thái biển, đánh giá và quản lý nguồn lợi sinh vật biển nói chung và các nghiên cứu chuyên sâu về các nhóm loài nói riêng. Kế thừa các đặc tính ưu việt của các kỹ thuật di lai các axit nucleic và trên nền tảng của kỹ thuật lai tại chỗ (in situ hybridization - ISH), kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (fluorescence in situ hydridization - FISH) đã được phát triển. Kể từ khi ra đời, nó đã trở thành một công cụ mạnh trong nhiều nghiên cứu sinh học, không chỉ các lĩnh vực sinh học phân tử và tế bào, mà cả trong các nghiên cứu về sinh thái học, môi trường, trong chẩn đoán và nghiên cứu phát sinh loài. Kỹ thuật FISH ra đời đã khắc phục được nhiều trở ngại trong nghiên cứu phân loại sinh vật. Các trở ngại, như các vấn đề khó khăn do phân loại bằng hình thái, nhược điểm về thời gian phân tích kéo dài, các yêu cầu đòi hỏi về lượng mẫu lớn hay các yêu cầu về môi trường nuôi cấy đặc chủng để sàng lọc loài… có thể được khắc phục bằng kỹ thuật FISH. Bên cạnh đó, bằng kỹ thuật này, các nhà nghiên cứu không chỉ phân tích định tính mà còn có thể định lượng chính xác số lượng tế bào sinh vật, không gian phân bố hay mối tương quan với môi trường của các vi sinh vật. Kỹ thuật FISH đặc biệt hữu ích trong nghiên cứu phân loại sinh vật phù du trong môi trường biển nói chung và các loài tảo độc hại nói riêng. Nhằm từng bước ứng dụng kỹ thuật FISH để giải quyết những khó khăn trong phân loại các loài vi tảo độc hại biển, chúng tôi tiến hành đề tài “Ứng dụng kỹ thuật phân tử lai huỳnh quang (FISH) nhằm xác định nhanh một số loài tảo độc hại biển Việt Nam”. Kết quả mong đợi của đề tài sẽ giúp cho việc nghiên cứu đánh giá, quan trắc biến động các loài vi tảo độc hại, cảnh báo các hiện tượng ô nhiễm môi trường biển (như thủy triều đỏ) trở nên thuận tiện, nhanh chóng và hiệu quả hơn. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1. Khái quát về kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu, ứng dụng kỹ thuật FISH Kỹ thuật FISH được ra đời vào những năm 1980. Tuy nhiên, trước đó, khi nghiên cứu tế bào, các nhà nghiên cứu thường sử dụng phương pháp nhuộm mô đơn giản. Trong đó, các chất màu nhuộm tự nhiên hoặc tổng hợp đã được sử dụng để nhuộm các cấu trúc hoặc các chất tích lũy trong tế bào. Nhưng, một nhược điểm lớn là các chất này thường không đặc hiệu do chúng có những ái lực với những đặc tính chung của các phần tử protein, axit nucleic, các lipit, cacbonhydrate. Chính điều này đã cản trở cho các nghiên cứu chuyên sâu. Sau đó, các thuốc nhuộm đặc hiệu hơn đối với các thành phần của tế bào hay các phức hợp phân tử lớn như hemosiderin, amyloid, elastin đã được tìm thấy, phát triển và áp dụng trong việc nhuộm đặc hiệu một số thành phần cấu trúc ở cấp độ phân tử và dưới tế bào. Dù đã có nhiều cải thiện về tính đặc hiệu, nhưng các chất nhuộm này cũng không được áp dụng phổ biến cho tất cả các đại phân tử sinh học được quan tâm. Khả năng phát hiện sự giống và khác nhau của các đại phân tử đặc biệt ban đầu được dựa trên các phản ứng kháng nguyên kháng thể. Vào những năm 1940, việc liên kết các kháng thể với fluorochome nhưng không làm mất đi sự đặc hiệu liên kết thụ thể của chúng đã được phát hiện. Trên cơ sở này, kỹ thuật sử dụng tín hiệu huỳnh quang phụ thuộc kháng thể nhằm phát hiện các phân tử axit nucleic lai đã được Rudkin và Stollar phát triển năm 1977 [58]. Tuy vậy, trước đó, kỹ thuật lai tại chỗ ISH (in situ hybridization), tiền thân của kỹ thuật FISH, đã ra đời bởi nhóm các nhà khoa học Pardue, Gall và John [54]. Trong phương pháp này, các thử nghiệm đã được tiến hành với việc nhận biết được các trình tự ADN đích có trong noãn bào của chủng vi khuẩn Xenopus bằng các đoạn đầu dò có bản chất là ADN hoặc ARN-28S đã được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ. Sau đó chúng được ghi nhận bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi. Kỹ thuật ISH này đã giúp các nhà khoa học có thể đưa các đoạn ngắn ADN xâm nhập vào trong tế bào mà không làm chết, làm thay đổi hình thái của tế 2
bào hay tính toàn vẹn của các bộ phận bên trong tế bào. Trên cơ sở đó, một số cải tiến kỹ thuật đã tiếp nối như việc ứng dụng các chất chỉ thị (reporter) dựa trên cơ sở các enzym [33] hay sử dụng hệ thống đầu dò bằng vàng quan sát bằng kính hiển vi điện tử [55]. Sau khi ra đời, ISH không ngừng được cải tiến nhằm nghiên cứu sự tiến hóa của nhiễm sắc thể, phân tích các nhiễm sắc thể của các khối u, tế bào ung thư bạch cầu và nghiên cứu di truyền học tế bào ở các loài. Tuy nhiên, một số nhược điểm dễ nhận thấy của phương pháp ISH cũng đã bộc lộ. Đầu tiên, rất nhiều vật liệu phóng xạ tự nhiên sử dụng cho đầu dò là kém bền. Do các đồng vị phân rã theo thời gian nên hoạt động của đầu dò dễ bị thay đổi. Thứ hai, mặc dù thông thường độ nhạy của phóng xạ tự ghi là cao nhưng mức độ phân giải lại bị hạn chế. Thứ ba, để tạo ra tín hiệu có thể đo được trên film chụp X quang thì mẫu cần phải có thời gian phơi nhiễm dài. Điều này làm chậm tiến trình thí nghiệm, phân tích kết quả, gia tăng nguy cơ phơi nhiễm với người sử dụng. Ngoài ra, vì kỹ thuật này đòi hỏi sử dụng nguyên liệu là các đồng vị phóng xạ nên các đầu dò phóng xạ có giá thành cao; mặt khác đòi hỏi chúng phải được vận chuyển, thao tác, lưu trữ và loại bỏ theo những quy trình rất nghiêm ngặt, phức tạp. Vì những lý do đó, dù có nhiều ưu điểm nổi trội nhưng những hạn chế cơ bản trên đã yêu cầu các nhà nghiên cứu cần phải tìm ra một biện pháp hiệu quả hơn. Có lẽ vì vậy mà kỹ thuật ISH (với các đầu dò mang đồng vị phóng xạ) sau đó đã nhanh chóng được thay thế bởi một kỹ thuật mới có nhiều ưu điểm hơn mang tên kỹ thuật lai tại chỗ sử dụng các đầu dò axit nucleic có gắn tín hiệu huỳnh quang (Fluorescence in situ hybridization - FISH). Với kỹ thuật FISH, các trở ngại về thời gian thí nghiệm, độ phân giải và tính an toàn được giải quyết khá triệt để, mở đường cho sự phát hiện đồng thời nhiều mục tiêu, phân tích định lượng và cho những hình ảnh tế bào sống động. Những nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng tín hiệu huỳnh quang đầu tiên trong phương pháp lai tại chỗ bắt đầu từ những năm 1980. Trong một nghiên cứu, các nhà khoa học đã tiến hành gắn phân tử ARN trực tiếp với tín hiệu huỳnh quang ở đầu 3’ và thử nghiệm dùng nó là một đầu dò cho trình tự ADN đặc hiệu. Kết quả cho thấy 3
rằng so với các đầu dò phóng xạ, đầu dò huỳnh quang sử dụng an toàn hơn, ít gây hại đối với môi trường và sức khỏe con người, đồng thời kết quả thu được cũng chính xác hơn [18]. Ở những nghiên cứu khác, các đầu dò gắn biotin và các tín hiệu streptavidin kết hợp huỳnh quang đã được dùng cho việc phát hiện các trình tự ADN đích đặc trưng trên nhiễm sắc thể [46] và các trình tự trên mARN [60]. Năm 1989, DeLong cũng đã tiến hành thử nghiệm sử dụng các đầu dò oligonucleotit (17 - 34 nucleotit) được đánh dấu huỳnh quang để dò tìm các vi khuẩn E.coli dựa vào trình tự đích là đoạn ARN 16s [24]. Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, việc sử dụng nhiều đầu dò khác nhau cho phép xác định được các loại tế bào khác nhau trong cùng một nhóm và thậm chí với việc phân tích cường độ huỳnh quang cũng cho thấy được giai đoạn và tốc độ phát triển của các tế bào vi sinh vật [19, 24]. Với khả năng ứng dụng rộng rãi của kỹ thuật FISH, ngày càng nhiều nghiên cứu được tiến hành trên các lĩnh vực khoa học. Sự phát triển ngày càng cao của nhiều kỹ thuật phân tích đã cho thấy rằng số lượng loài có trong tự nhiên, nhất là đối với nhóm vi khuẩn, có con số vượt xa so với số lượng các loài đã được phát hiện và mô tả trước đó. Do đó, sự đa dạng thành phần loài vi sinh vật trong thời gian trước đây đã từng bị đánh giá thấp. Các phương pháp cổ điển trước đây hầu như không thể mô tả được chính xác và đầy đủ rất nhiều loài vi sinh vật. Rất nhiều loài sau này được phát hiện mới bằng các phương pháp hiện đại và chính xác hơn, như phương pháp FISH. FISH có khả năng đưa ra những hình ảnh chi tiết của môi trường vi sinh mà không cần phải qua những bước làm sạch hay khuếch đại. Chính vì vậy mà nó đã được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau về môi trường. Phương pháp này hiện nay được ứng dụng nhiều trong các nghiên cứu về sự đa dạng sinh học của các quần thể vi sinh vật ở nhiều điều kiện địa lý khác nhau trong tự nhiên, Llobet (1998) đã sử dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ như một công cụ để các nghiên cứu về hệ vi sinh vật có trong trầm tích biển. Kết quả cho thấy, gần 45% số tế bào vi khuẩn có trong đó thuộc nhóm ngành đã biết với nhóm Cytophaga-Flavobacterium có trong hầu hết các lớp trầm tích [45]. Hay các nghiên cứu sự phân bố của vi khuẩn bằng kỹ thuật FISH trong đại dương [31], trong 4
các tầng nước khác nhau tại vịnh Mariager Fjord, Đan Mạch [53], những nghiên cứu hệ vi khuẩn ở trong sông [42], trong thủy vực trên núi cao có băng bao phủ quanh năm [11], hay các nghiên cứu về Bacillus trong đất [26]… Bên cạnh đó, kỹ thuật FISH cũng được ứng dụng rộng rãi trong y học. Gersdorf (1993) đã tiến hành nghiên cứu hỗn hợp vi khuẩn phổ biến trong khoang miệng người bằng phương pháp FISH qua đó đã tìm thấy có hơn 300 loài vi khuẩn khác nhau, trong đó có nhiều loài rất phức tạp khi tiến hành nuôi cấy hoặc chưa từng được nuôi cấy. Các bệnh về răng miệng như viêm răng hay viêm lợi có liên quan đến các mạng lưới vi khuẩn đặc thù này. Trong khi một số kỹ thuật nuôi cấy chuyên biệt chỉ thu được rất ít thành phần loài trong sự đa dạng nhóm vi sinh vật này. Những lợi ích khi sử dụng kỹ thuật FISH đã được thể hiện rõ trên những vi khuẩn kị khí gram âm, như Porphyromonas gingivalis, Bacterroides forsythus và Prevotella intermedia có trong thành phần mảng bám răng của bệnh nhân viêm răng [28, 29]. Cũng thông qua kỹ thuật FISH, các phân tích sâu hơn đã cho thấy một số lượng lớn và đa dạng về hình thái của các loại xoắn khuẩn trên các vết bẩn của mảng bám răng có trong khoang miệng của các bệnh nhân cùng với sự phát triển nhanh chóng của bệnh viêm răng [21, 52]. Trong một thử nghiệm lâm sàng với các mẫu đờm và mẫu gạc họng, một tập hợp các đầu dò oligonucleotit được thiết kế để dò tìm đặc hiệu đối với các mầm bệnh phân lập từ tế bào xơ gan của bệnh nhân được tiến hành. Kết quả cho thấy, các đầu dò đã phát hiện nhanh chóng và chính xác các vi khuẩn gây cấp tính ở bệnh nhân xơ nang, bao gồm Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus và Candida albicans. So với các kỹ thuật nuôi cấy thông thường, FISH chứng tỏ là công cụ chính xác và hiệu quả [33, 34]. Ở một nghiên cứu y học khác, khả năng ứng dụng của FISH để định danh các vi sinh vật gây bệnh trong các mẫu máu nhiễm bệnh đã được khảo sát. Các đầu dò oligonucleotit sử dụng đặc hiệu cho từng mầm bệnh điển hình đã cho thấy hiệu quả khi chúng dò tìm thấy các nhóm gây bệnh bao gồm Staphylococci, Streptococci, Enterococci, 5
Enterobacteriaceae và nấm trên các bệnh nhân nhiễm bệnh. Các nhà nghiên cứu kết luận rằng phương pháp FISH có độ nhạy và đặc hiệu tuyệt vời và kết quả thu được chỉ trong 25 phút cho tới 2,5 giờ. Trong khi đó, việc định danh các loài bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống thường mất từ 24 đến 72 giờ mới hoàn thành. Sự phát hiện nhanh chóng các nguyên nhân mầm bệnh trong máu bằng phương pháp FISH cho phép các bác sỹ dễ dàng đưa ra được các phương pháp trị liệu thích hợp và do đó có thể hoàn thiện việc chẩn đoán cho các bệnh nhân bị nhiễm trùng máu [37, 41]. Cho đến nay, với các ưu thế về độ nhạy, tiết kiệm thời gian, đơn giản… kỹ thuật FISH đã và đang là một công cụ hữu dụng trong những ứng dụng về nghiên cứu sinh thái, đa dạng sinh học, y học, di truyền học và nhiều lĩnh vực khác. 1.1.2. Trình tự đích và đầu dò trong phép lai huỳnh quang tại chỗ Bản chất của kỹ thuật FISH là sự lai chính xác một đoạn oligonucleotit có gắn tín hiệu huỳnh quang (đầu dò) với một trình tự ADN đích đặc trưng. Với nhiều mục đích khác nhau mà người ta có thể sử dụng kỹ thuật FISH nhằm dò tìm hay phát hiện các trình tự ADN hay ARN đích thuộc các phần khác nhau của hệ gen quan tâm. Các trình tự này có thể là một trình tự đặc trưng nằm trên nhiễm sắc thể mã hóa cho một chức năng gen nào đó cần quan tâm. Với các đầu dò đặc hiệu cho từng locut gen, chúng được tạo ra từ một phần của gen. Do vậy, khi lai, chúng sẽ kết hợp bổ sung với phần đặc hiệu đó của gen trên nhiễm sắc thể. Từ đó người ta có thể xác định được chính xác vị trí trên nhiễm sắc thể mà gen đó tồn tại. Đối với các trình tự đích là những đoạn lặp vùng tâm động hay vùng Alphoid, đầu dò được thiết kế sẽ cho phép chúng ta tìm thấy vùng tương ứng bổ sung tại tâm động của các nhiễm sắc thể. Trong nhiều trường hợp, các nhiễm sắc thể được đánh dấu bởi các màu huỳnh quang khác nhau của đầu dò. Từ đó người ta có thể xác định được cá thể có mang đúng số lượng các nhiễm sắc thể hay không. Đối với phép lai toàn bộ nhiễm sắc thể, tập hợp những đầu dò nhỏ được sử dụng để lai cho từng đoạn ngắn trình tự đích dọc trên nhiễm sắc thể. Nhiễm sắc thể phát quang với các màu sắc 6
khác nhau của đầu dò giúp người ta có thể phân biệt được dễ dàng các nhiễm sắc thể khác nhau thay vì phải căn cứ vào các vạch sáng tối trên nhiễm sắc thể theo các phương pháp truyền thống. Mặt khác, chúng cũng giúp cho việc nhận biết dễ dàng những bất thường trong cấu trúc của nhiễm sắc thể. Trong một nghiên cứu của mình về bệnh bạch cầu (ABL), Michael đã tiến hành thử nghiệm hệ thống tổ hợp các đầu dò oligonucleotit (COMBO) thông qua kỹ thuật FISH nhằm nhận diện vùng ABL (gây bệnh bạch cầu) thuộc nhiễm sắc thể số 9 của người. Kết quả cho thấy hệ thống COMBO hoạt động rất hiệu quả và có thể coi đây như một cách tiếp cận mới trong việc gắn nhãn đặc hiệu tại những vị trí cần quan tâm của hệ gen người [48]. Các kết quả nghiên cứu thử nghiệm khác cũng chỉ ra rằng để quá trình lai bổ sung được hiệu quả thì thông thường các trình tự này phải ở giai đoạn chuẩn bị của nhiễm sắc thể trong nguyên phân hoặc trong giai đoạn gian kỳ của tế bào [18, 19]. Mở rộng nghiên cứu, các nhà khoa học cũng đã sử dụng các tiểu phần ARN ribosome (5s, 16s, 23s hoặc 28s) như các trình tự đích trong các thí nghiệm sử dụng kỹ thuật FISH. Năm 1994, Trebesius cùng các đồng nghiệp của mình đã ứng dụng phát triển kỹ thuật FISH trong việc xác định các tế bào vi khuẩn bằng việc sử dụng các đầu dò polynucleotit cho các trình tự đích 23s ARN ribosome của vi khuẩn. Các đầu dò này tỏ ra rất hiệu quả trong việc phát hiện các đối tượng vi khuẩn cần quan tâm [64]. Trong một nghiên cứu khác, các trình tự thuộc các vùng V2, V4, V8 của 16s ribosome đã được các nhà khoa học sử dụng làm các trình tự đích cho các đầu dò huỳnh quang trong phép lai tại chỗ nhằm định lượng nhóm vi khuẩn Bifidobacterium spp. cộng sinh trong đường tiêu hóa của người [44]. Với mỗi mục tiêu nghiên cứu, các vùng khác nhau của các tiểu phần ribosome ngày càng được khai thác và sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng kỹ thuật FISH khác nhau [18, 27, 36, 68]. Trong nhiều nghiên cứu về phân loại, các trình tự đích được sử dụng phổ biến trong FISH là các rRNA 16S vì chúng ổn định về mặt di truyền, số lượng bản sao nhiều. 7
Nhiều kết quả khác cũng đã cho thấy, việc sử dụng thành phần đích là phân tử mARN đặc hiệu cũng có thể giúp ích trong nhiều nghiên cứu có liên quan vì mARN là một mắt xích quan trọng trong chuỗi hoạt động sinh hóa và di truyền của tế bào và của cơ thể [18, 25, 65]. Cùng với việc khai thác có hiệu quả và đa dạng các trình tự đích, các loại đầu dò phục vụ trong kỹ thuật FISH cũng được nghiên cứu chế tạo và cải tiến tùy theo từng mục tiêu. Một số nghiên cứu đã sử dụng các đầu dò là các đoạn polynucleotit. Đây là những đoạn polynucleotit có kích thước lớn từ 200 – 300 nucleotit. Trong một số nghiên cứu, người ta đã sử dụng chúng cho việc dò tìm các trình tự đích là vùng siêu biến III thuộc 23s ARN ribosome của các vi khuẩn. Những đầu dò polynucleotit này đã thể hiện tính hữu dụng trong việc phát hiện Pseudomonas putida, Acinetobacter spp. [64] và nhóm vi khuẩn và vi khuẩn cổ phù du trong nước biển [25]. Trong một nghiên cứu khác, bảy đầu dò polynucleotit đã xây dựng, thiết kế nhằm nhận biết các loài Acinetobacte baumannii, A. calcoaceticus, A. haemolyticus, A. junii, A. radioresistens, A. lwoffii, A. johnsonii cũng dễ dàng được ứng dụng thông qua kỹ thuật FISH [39]. Bên cạnh đó, các đoạn oligonucleotit với kích thước chỉ khoảng 15 - 30 nucleotit có gắn các nhãn tín hiệu khác nhau cũng được nghiên cứu thiết kế và sử dụng làm đầu dò tìm các thành phần đích là phân tử mARN, rARN đặc hiệu trong nhiều nghiên cứu [25, 65]. Xét về tính hiệu quả, trong kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ nguyên vẹn tế bào, các đầu dò oligonucleotit với trình tự ngắn lại có hiệu quả tốt hơn trong khả năng xâm nhập vào tế bào và lai đặc hiệu với trình tự đích. Đối với các trình tự đích thuộc các tiểu phần ribosome 5s, 16s, 23s hoặc 28s của vi khuẩn, các loài thông thường được nhận diện bằng các đầu dò oligonucleotit. Chính vì vậy mà các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH với đầu dò oligonucleotit cho các mục đích xác định vi khuẩn, phân tích cấu trúc nhóm vi khuẩn, xem xét các mối quan hệ tương tác về không gian và thời gian của các quần thể vi sinh vật trong môi trường sống của chúng đã được nhiều nhà khoa học quan tâm trong thời gian qua. Trên thế giới, kỹ thuật FISH cũng đã được các nhà khoa học áp dụng trên các đối 8
tượng là những sinh vật phù du nước ngọt cũng như các loài phù du sống ven biển, ngoài khơi và cả những loài thu được từ trầm tích đáy biển. Kỹ thuật FISH đã cho thấy được ưu thế trong khả năng xác định nhanh chóng và chính xác số lượng rất nhỏ các tế bào vi khuẩn cũng như có khả năng phát hiện được sự đa dạng phong phú của các quần thể sinh vật này [11, 18, 31, 46]. 1.1.3. Các loại tín hiệu đánh dấu huỳnh quang Trong lịch sử phát triển kỹ thuật FISH, nhiều biến thể của tín hiệu (thuốc nhuộm) gắn trực tiếp hoặc gián tiếp đã được đưa ra. Điều này cho phép các nhà nghiên cứu có thể lựa chọn, tùy theo độ đặc hiệu, độ nhạy, độ phân giải, màu sắc phát quang của đầu dò để thiết kế các đầu dò phù hợp với các điều kiện thí nghiệm khác nhau. Đồng thời, việc đa dạng hóa các loại tín hiệu đánh dấu (đa dạng màu sắc) sẽ làm cho hình ảnh của một kết quả lai huỳnh quang trở nên sinh động. Hình ảnh thu được có thể minh họa rõ ràng cho việc phân tích sự tổ hợp của hệ gen về mặt không gian hay dễ dàng trong việc phát hiện nhiễm sắc thể và sự sai lệch của chúng trong chu trình tế bào. Các loại thuốc nhuộm huỳnh quang thường được gắn với đầu dò bằng các liên kết cộng hóa trị. Chúng thường có các mức năng lượng kích thích và phát xạ tối đa khác nhau, vì vậy cho phép phát hiện đồng thời hai hoặc nhiều vi sinh vật bằng một lần tiến hành lai phân tử duy nhất đồng thời cho ra những hình ảnh màu sắc sinh động. Các chất nhuộm thường sử dụng cho FISH trong phân loại vi sinh vật là các dẫn xuất của fluorescein (như Fluorescein- Isothiocyanate (FITC), 5(6)carboxyfluorescein-N-hydroxysuccimide-ester (FluoX)) hoặc dẫn xuất của rhodamine (như Tetramethyl-Rhodamine-Isothiocyanate (TRITC), Texas Red), ngoài ra còn có các loại thuốc nhuộm cyanine khác như là Cy3 và Cy5… [12, 39]. 9
Bảng 1.1. Một số chất huỳnh quang được dùng phổ biến trong kỹ thuật FISH [18] Bước sóng Chất Màu Kích thích cực đại Phát xạ Huỳnh quang (nm) (nm) Alexa488 Xanh lá cây 493 517 AMCA Xanh da trời 399 446 CY3 Đỏ 552 565 CY5 Đỏ 649 670 CY7 Tím 743 767 DAPI Xanh da trời 350 456 Fluoresscein Xanh lá cây 494 523 Rodamine Đỏ 555 580 TAMRA Đỏ 543 575 Texas Red Đỏ 590 615 TRITC Đỏ-cam 550 580 Trong kỹ thuật FISH người ta có nhiều cách để đánh dấu đầu dò. Tuy vậy, việc đánh dấu trực tiếp chất nhuộm huỳnh quang lên đầu dò là cách thông dụng, nhanh và rẻ nhất. Đồng thời, đầu dò được chuẩn bị theo cách này dễ dàng được phát hiện vì không cần phải tiến hành các bước dò tìm sau quá trình lai. Trong đánh dấu đầu dò, một hoặc nhiều phân tử thuốc nhuộm huỳnh quang được liên kết trực tiếp với chuỗi polynucleotit/oligonucleotit trong suốt quá trình tổng hợp thông qua liên kết amino ở đầu 5’ của đầu dò. Một cách khác, người ta cũng có thể sử dụng enzym Terminal transferase để gắn các nucleotit đã được đánh dấu huỳnh quang vào đầu 3’ của đầu dò [52]. Ngoài ra, một số thuốc nhuộm như Flourescein-Isothiocyanate (FITC) nếu được gắn vào đầu dò theo một dải thì có thể làm tăng cường độ tín hiệu so với các đầu dò được đánh dấu trực tiếp [23]. Sự tăng lên về tín hiệu huỳnh quang cũng được biểu hiện trên những đầu dò được gắn chất huỳnh quang trên cả hai đầu 3’ và 5’ [62]. Trong nghiên cứu của mình, Trebesius cùng các đồng nghiệp (1994) đã sử dụng các đầu dò polynucleotit cho các trình tự đích 23s ARN ribosome 10
của vi khuẩn. Các đầu dò này không gắn tín hiệu phóng xạ mà được thay bằng dẫn xuất phát huỳnh quang của UTP (fluorescein-12-UTP, digoxigenin-11-UTP, 7- amino-4-methyl-coumarin- 3-acetyl-6-UTP, hoặc tetramethylrhodamine-6-UTP). Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, với đầu dò dạng này thì hiệu quả mang tín hiệu huỳnh quang tăng gấp khoảng 26 lần so với đầu dò ngắn oligonucleotit [64]. Tuy vậy, ở một một số trường hợp, việc dò tìm theo cách gián tiếp tỏ ra có hiệu quả hơn. Sự tăng độ nhạy của thí nghiệm FISH bằng cách kết hợp các đầu dò với những chất chỉ thị như Digoxygenin (DIG) đã được thực hiện và sau đó phức hợp này sẽ được dò tìm thông qua một chất phản huỳnh quang [69]. Ngoài ra, người ta có thể tăng độ nhạy của FISH bằng việc sử dụng enzym nhằm khuếch đại tín hiệu của đầu dò trong nhiều nghiên cứu định danh vi khuẩn. Ban đầu, mỗi oligonucleotit vẫn sẽ được đánh dấu bằng digoxygenin như trên, sau đó được dò tìm bằng một thể kháng digoxygenin, kháng thể này tiếp tục được liên kết với enzym phosphatase kiềm. Enzym này chuyển hóa HNPP (2-hydroxy-3-naphtoic acid-2’-phenylanilide phosphate) thành dạng Dephosphoryl, chất này tạo ra màu huỳnh quang đỏ sáng khi kết hợp với Fast Red TR. Tín hiệu huỳnh quang thu được theo cách này có cường độ mạnh hơn 8 lần so với tín hiệu của các oligonucleotit chỉ gắn nhãn huỳnh quang duy nhất [40, 67]. Sau này, phương pháp khuếch đại tín hiệu bằng enzym ngày càng được cải tiến tốt hơn nhờ vào một kỹ thuật được gọi là “hệ thống khuếch đại tín hiệu Tyramide” (TSA). Hệ thống này làm tăng cường độ tín hiệu lên khoảng 10 – 20 lần so với ban đầu. Tuy nhiên các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, do quá trình xâm nhập của các chất cao phân tử vào trong tế bào vi khuẩn bị hạn chế hơn những chất nhuộm thông thường nên số lượng các tế bào được lai thành công đã giảm đi một cách rõ ràng so với việc sử dụng đầu dò thông thường được đánh dấu duy nhất một chất huỳnh quang. Mặc dù enzym lysozyme đã giúp cải thiện tính thấm của các đầu dò vào trong tế bào, dẫn tới cường độ tín hiệu được nâng cao, nhưng phương pháp này dường như không áp dụng được với một số loài vi khuẩn Gram dương. Trong một số trường hợp, việc kết hợp sử dụng các đầu dò polyribonucleotit, được đánh 11
dấu với digoxygenin, song song với việc sử dụng hệ thống TSA là một giải pháp tốt. Sự kết hợp này đã được ứng dụng thành công khi dò tìm và phát hiện trực quan các loài Listeria gây độc [65]. Về khía cạnh khác, các đầu dò oligonucleotit với trình tự ngắn lại có hiệu quả tốt hơn trong khả năng xâm nhập vào tế bào và lai đặc hiệu với trình tự đích so với các đầu dò polynucleotit. Để tăng độ nhạy của đầu dò trong kỹ thuật FISH, việc tính toán đến số lượng bản sao của trình tự đích cũng là một giải pháp được tính đến nhằm khuếch đại tín hiệu để có được hình ảnh rõ nét hơn. Trong nhiều trường hợp, các trình tự đích là các rARN hay các mARN (thường có nhiều trong tế bào) được lựa chọn để sử dụng với các đầu dò oligonucleotit mang được ít tín hiệu đánh dấu [18]. Gắn nhãn vào đầu 5’ (a) Gắn nhãn vào đầu 3’ (b) Sử dụng chất chỉ thị (c) Sử dụng enzym (d) Đầu dò dạng polynucleotit (e) Hình 1.1. Các cách gắn nhãn tín hiệu vào đầu dò [18]. Gắn nhãn trực tiếp (a, b) và gián tiếp (c–e) của đầu dò sử dụng 1 phân tử chỉ thị như digoxygenin (DIG) mà nó sau đó được phát hiện bởi kháng thể huỳnh quang, horseradish peroxidase (HRP) sử dụng phức hợp fluorescein–tyramide như một cơ chất cho sự khuếch đại tín hiệu bằng enzym theo hệ thống TSA, hoặc sự kết hợp sử dụng các đầu dò polyribonucleotit với hệ thống TSA. Như vậy, bằng kỹ thuật FISH, các nhà nghiên cứu không chỉ có thể phân biệt được các vi sinh vật quen thuộc mà còn xác định được các vi sinh vật mới, chưa biết 12