Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:85

Thêm vào BST

Báo xấu

84
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện nhằm mục đích tìm hiểu sự biểu hiện của các protein ở mô gan ung thư so với mô gan bình thường của bệnh nhân ung thư gan thông qua các điểm protein trên bản gel điện di hai chiều; nhận dạng được một số protein khác biệt đặc trưng giữa mô gan ung thư so với mô gan bình thường; xác định được protein có phản ứng miễn dịch (kháng nguyên ung thư gan) đặc hiệu với các kháng thể trong huyết tương bệnh nhân ung thư gan.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Xác định kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------  ------- LÊ LAN PHƢƠNG XÁC ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH CỦA BỆNH NHÂN UNG THƢ GAN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2012
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------------------- Lê Lan Phƣơng XÁC ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH CỦA BỆNH NHÂN UNG THƢ GAN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: CH.60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Trịnh Hồng Thái Hà Nội - 2012
LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Trịnh Hồng Thái, ngƣời thầy đã tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong thời gian học tập tại Trƣờng. Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh, chị học viên và các bạn sinh viên làm việc tại Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tại Phòng. Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ của các cán bộ, nhân viên thuộc Khoa Tế bào - Giải phẫu bệnh, Bệnh viện K2, Tam Hiệp, Hà Nội. Tôi xin chân thành cảm ơn. Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Luận văn đƣợc thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài mã số KLEPT-09-02. Hà Nội, tháng 6 năm 2012 Học viên Lê Lan Phƣơng
MỤC LỤC BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................... a DANH MỤC CÁC BẢNG..........................................................................................d DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................... e MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 Chƣơng 1 - TỔNG QUAN ..........................................................................................3 1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƢ GAN ...............................................................3 1.1.1. Phân loại ung thƣ gan nguyên phát ...........................................................3 1.1.2. Nguyên nhân dẫn tới ung thƣ gan .............................................................4 1.1.3. Các giai đoạn của ung thƣ gan ..................................................................6 1.1.4. Các phƣơng pháp chẩn đoán ung thƣ gan .................................................8 1.2. NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƢ ..........................9 1.2.1. Chỉ thị sinh học đối với ung thƣ ................................................................9 1.2.2. Tiếp cận nghiên cứu chỉ thị sinh học đối với ung thƣ .............................10 1.2.3. Các loại chỉ thị sinh học đối với ung thƣ gan .........................................11 1.3. MIỄN DỊCH CHỐNG UNG THƢ ................................................................13 1.3.1. Đáp ứng miễn dịch chống ung thƣ ..........................................................13 1.3.2. Kháng nguyên ung thƣ ............................................................................13 1.3.3. Chỉ thị ung thƣ liên quan đến đáp ứng miễn dịch ...................................14 1.4. NGHIÊN CỨU PROTEOMICS MIỄN DỊCH UNG THƢ GAN .................15 1.4.1. Khái quát về proteomics và ứng dụng của proteomics ...........................15 1.4.2. Hệ protein gan ngƣời...............................................................................16 1.4.3. Nghiên cứu proteomics miễn dịch ung thƣ gan ......................................17 Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................24 2.1. NGUYÊN LIỆU .............................................................................................24 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu .............................................................................24
2.1.2. Hóa chất ..................................................................................................24 2.1.3. Thiết bị ....................................................................................................25 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................................25 2.2.1. Xử lý mẫu mô gan ...................................................................................25 2.2.2. Định lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford ....................................27 2.2.3. Điện di hai chiều .....................................................................................27 2.2.4. Western Blot............................................................................................28 2.2.5. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều, kết quả Western Blot ......29 2.2.6. Cắt và thủy phân spot trên bản gel điện di hai chiều ..............................30 2.2.7. Phân tích khối phổ và nhận dạng protein ................................................31 Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................................................33 3.1. TÁCH CHIẾT PROTEIN TỪ MÔ GAN ......................................................33 3.2. PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU ......................34 3.2.1. Phân tách hệ protein mô gan trên bản gel diện di hai chiều ...................34 3.2.2. Phân tích biểu hiện của protein trên bản gel điện di hai chiều ...............36 3.3. NHẬN DẠNG PROTEIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP MALDI-TOF MS ......41 3.4. THẨM TÁCH MIỄN DỊCH - WESTERN BLOT HAI CHIỀU ...................44 3.4.1. Xác định tỷ lệ pha loãng kháng thể bậc một thích hợp ...........................44 3.4.2. Kết quả Western Blot hai chiều ..............................................................46 3.5. ĐẶC ĐIỂM, VAI TRÒ CỦA CÁC PROTEIN BIỂU HIỆN KHÁC BIỆT ....47 3.5.1. Protein liên quan đến chu trình tế bào và apoptosis .................................50 3.5.2. Protein liên quan đến quá trình miễn dịch và bảo vệ cơ thể ...................52 3.5.3. Protein tham gia cấu trúc tế bào ..............................................................53 3.5.4. Protein tham gia các quá trình trao đổi chất............................................54 3.5.5. Protein liên quan đến quá trình phiên mã, dịch mã và cải biến ..............55 3.5.6. Protein có phản ứng miễn dịch với huyết tƣơng .....................................56 KẾT LUẬN ...............................................................................................................60
KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................61 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................62 PHỤ LỤC .................................................................................................................... i Phụ lục 1. Danh sách bệnh nhân ung thƣ tế bào gan ......................................... i Phụ lục 2. Phân tách protein mô gan của 5 bệnh nhân HCC trên bản gel điện di hai chiều ............................................................................................................. ii Phụ lục 3. Kết quả nhận dạng protein bằng cơ sở dữ liệu NCBI sử dụng phần mềm Mascot ...................................................................................................... vi Phụ lục 4. Kết quả phản ứng Western Blot mẫu mô gan của 3 bệnh nhân HCC ......................................................................................................................... viii
BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT α1AT Alpha-1-antitrypsin ABC Ammonium bicarbonate AcCN Acetonitrile ACTB Beta-actin AFP Alpha fetoprotein AFB1 Aflatoxin B1 CATD Cathepsin D CHAPS 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid CHCA α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid cs Cộng sự Da Dalton DTT Dithiothreitol ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (Xét nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme) GS Glutamine synthetase HBV Hepatitis B virus (Virus viêm gan B) HBsAg Hepatitis B surface Antigen (Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B) HCC Hepatocellular carcinoma (Ung thƣ tế bào biểu mô gan) HCV Hepatitis C virus (Virus viêm gan C) HLPP Human Liver Proteome Project (Dự án Proteome gan ngƣời) HPT Haptoglobin HUPO Human Proteome Organisation (Tổ chức Proteome ngƣời) HRP Horse - radish peroxidase a
HSP Heat shock protein (Protein sốc nhiệt) IAA Iodoacetamide IEF Isoelectric Focusing (Điện di phân vùng đẳng điện) IPG Immobilized pH gradient (Gradient pH cố định) LC-MS/MS Liquid Chromatography coupled with tandem Mass Spectrometry (Sắc ký lỏng kết nối với khối phổ) MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MFAP3 Microfibrillar-associated protein 3 MHC Mayjor Histocampatibility Complex (Phức hệ phù hợp tổ chức mô chủ yếu) MS Mass spectrometry (Khối phổ) Mw Molecular weight (Khối lƣợng phân tử) PBS Phosphate Buffer Saline (Đệm muối phosphate) PCNA Proliferating cell nuclear antigen PDIA1 Protein disulfide-isomerase PDIA3 Protein disulfide-isomerase A3 PMF Peptide Mass Fingerprint (Đặc trƣng khối peptide) PMSF Phenylmethanesulfonyl fluoride PVDF Polyvinylidene fluoride p53 Cellular tumor antigen p53 SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Điện di trên gel polyacrylamide có SDS) SEREX Serological Analysis of Recombinant cDNA Expression Libraries (Phân tích huyết thanh bằng thƣ viện biểu hiện cDNA tái tổ hợp) SODC Superoxide dismutase [Cu-Zn] b
SODM Superoxide dismutase [Mn] Mn-SOD Manganese superoxide dismutase Spot Điểm protein ST7L Suppressor of tumorigenicity 7 protein-like TAA Tumour Associated Antigen (Kháng nguyên liên quan đến ung thƣ) TAP Transporters of Antigen Peptide (Phân tử vận chuyển peptide kháng nguyên) TFA Trifluoroacetic acid TNM Tumor Node Metastasis (Kích thƣớc khối u - Hạch Lympho - Di căn) TSA Tissue Specific Antigen (Kháng nguyên đặc hiệu mô) TSTA Tumour Specific Transplantation Antigen (Kháng nguyên ghép đặc hiệu ung thƣ) c
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Tiêu chuẩn phân kỳ lâm sàng bệnh ung thƣ gan ...........................................7 Bảng 2. Các chỉ thị ung thƣ gan mới đƣợc công bố (20 năm gần đây) ....................12 Bảng 3. Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu.............................................24 Bảng 4. Các bƣớc chạy điện di đẳng điện trên thanh strip dài 7cm và 17cm ...........28 Bảng 5. Tổng số spot trên mỗi bản gel điện di hai chiều ..........................................36 Bảng 6. Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 17cm, pH 3 - 10 ......................39 Bảng 7. Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 7cm, pH 4 - 7 ..........................39 Bảng 8. Danh sách các protein biểu hiện khác biệt trên bản gel của mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng đƣợc xác định dựa trên cơ sở dữ liệu EMBL ................40 Bảng 9. Danh sách các protein đƣợc xác định bằng MALDI-TOF MS từ bản gel mô gan ung thƣ so sánh với mô gan đối chứng của bệnh nhân HCC .............................42 Bảng 10. Tóm tắt chức năng chính của các protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ so với mô gan đối chứng đã đƣơc nhận dạng ..............................................48 d
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Ung thƣ gan xuất phát từ chính tế bào gan ....................................................3 Hình 2. Cơ chế gây ung thƣ của các tác nhân ung thƣ gan .........................................5 Hình 3. Quy trình chiết protein từ mô gan ................................................................26 Hình 4. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều sử dụng phần mềm Phoretix .30 Hình 5. Điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết protein từ mô gan bình thƣờng và mô gan ung thƣ trên gel polyacrylamide 10% có SDS .............................................33 Hình 6. Phân tách protein mô gan của bệnh nhân 8460 trên bản gel điện di hai chiều ...................................................................................................................................35 Hình 7. Hình ảnh 3-D của spot trên bản gel điện di hai chiều ..................................37 Hình 8. Minh họa các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô ung thƣ so với bản gel mô bình thƣờng ...................................................................................................37 Hình 9. Các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel 2-DE mẫu mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng của bệnh nhân HCC mã 8935 ..................................................38 Hình 10. Phân tích khối phổ các peptide thu đƣợc sau khi thủy phân spot protein C-256-B bằng trypsin ................................................................................................41 Hình 11. Phân tách protein chiết từ mô gan bệnh nhân HCC trên gel polyacrylamide và màng PVDF chuẩn bị cho phản ứng Western Blot ..............................................45 Hình 12. Kết quả phản ứng Western Blot khi ủ màng với dung dịch kháng thể bậc 1 có độ pha loãng khác nhau ........................................................................................45 Hình 13. Kết quả phản ứng Western Blot mẫu mô gan của bệnh nhân 8977 ...........47 Hình 14. Tỷ lệ các nhóm protein tham gia vào các quá trình sinh học khác nhau ...50 Hình 15. Sơ đồ nhận diện kháng nguyên nhờ protein MHC lớp I ............................58 e
LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng MỞ ĐẦU Ung thƣ gan hiện là một trong các loại ung thƣ phổ biến nhất trên thế giới và Việt Nam, đây là bệnh ung thƣ có tỷ lệ tử vong cao, hơn nữa, tỷ lệ mắc bệnh đang có xu hƣớng tăng lên. Theo thống kê năm 2008, ƣớc tính trên thế giới có khoảng 748.300 trƣờng hợp mắc ung thƣ gan và 695.900 ca tử vong do ung thƣ gan. Việt Nam thuộc khu vực Đông Nam Á là nơi có tỷ lệ mắc ung thƣ gan cao nhất [18]. Theo thống kê của bệnh viện K, nƣớc ta có tỷ lệ mắc ung thƣ gan nguyên phát cao do nhiễm virus viêm gan B và virus viêm gan C [41]. Do đó, việc nghiên cứu về tác nhân gây bệnh, cơ chế và phƣơng pháp chẩn đoán, phát hiện sớm ung thƣ gan có vai trò quan trọng đối với việc giảm tỷ lệ mắc và giảm tỷ lệ tử vong ở loại ung thƣ này. Hiện nay, các phƣơng pháp xét nghiệm lâm sàng nhƣ: sinh thiết gan, chụp cắt lớp vi tính, siêu âm chẩn đoán hình ảnh và xác định các chỉ thị sinh học nhƣ anpha fetoprotein là các “tiêu chuẩn vàng” để chẩn đoán ung thƣ gan. Tuy nhiên, các xét nghiệm này có nhiều hạn chế do chỉ phát hiện đƣợc bệnh vào giai đoạn muộn làm giảm khả năng sống sót của bệnh nhân ung thƣ gan [38]. Nhu cầu đặt ra là phải tìm kiếm các chỉ thị sinh học mới giúp chẩn đoán, phát hiện ung thƣ gan ở giai đoạn sớm. Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu tìm kiếm các chỉ thị ung thƣ gan sử dụng công cụ proteomics. Phần lớn các protein có trong huyết tƣơng đều đƣợc tổng hợp từ gan. Mô gan của bệnh nhân ung thƣ gan cũng có khả năng tổng hợp nhiều protein liên quan đến khối u. Do đó, các tín hiệu protein trong mô gan có thể dùng làm công cụ để chẩn đoán sự tiến triển của bệnh gan, phát triển chẩn đoán phân tử [29]. Hơn nữa, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng các protein nội bào có liên quan đến quá trình hình thành khối u, kích thích đáp ứng miễn dịch sinh ra các tự kháng thể [26] và nhiều kháng nguyên ung thƣ đã đƣợc xác định trong cơ thể bệnh nhân ung thƣ [27]. Vì thế, các tự kháng thể có thể đƣợc dùng để chẩn đoán lâm sàng ung thƣ và dùng trong phân tích proteomics để nhận dạng các kháng nguyên liên quan đến khối u có khả năng liên quan đến sự chuyển 1
LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng dạng ác tính của tế bào. Đây là hƣớng nghiên cứu mới nhằm tìm kiếm các chỉ thị sinh học ung thƣ liên quan đến đáp ứng miễn dịch. Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu: “Xác định kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan” nhằm mục đích: - Tìm hiểu sự biểu hiện của các protein ở mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng của bệnh nhân ung thƣ gan thông qua các điểm protein trên bản gel điện di hai chiều. - Nhận dạng đƣợc một số protein khác biệt đặc trƣng giữa mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng. - Xác định đƣợc protein có phản ứng miễn dịch (kháng nguyên ung thƣ gan) đặc hiệu với các kháng thể trong huyết tƣơng bệnh nhân ung thƣ gan. Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. 2
LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng Chƣơng 1 - TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƢ GAN Ung thƣ gan là một trong các dạng bệnh lý phổ biến nhất trên thế giới và tỷ lệ tử vong do ung thƣ gan xếp hàng thứ ba trên tổng số các trƣờng hợp tử vong do ung thƣ. Tại Mỹ, từ năm 2004 đến 2008, tỷ lệ mắc mới ung thƣ gan mỗi năm tăng 3,6% ở nam giới và 3% ở nữ giới, xu hƣớng này đã tồn tại từ năm 1992. Các nhà nghiên cứu dự đoán trong năm 2012 sẽ có khoảng 28.720 trƣờng hợp mắc mới ung thƣ gan, hơn 80% trong số đó là ung thƣ tế bào biểu mô gan [8]. Ung thƣ gan gồm hai dạng là ung thƣ gan nguyên phát và ung thƣ gan thứ phát (di căn). Ung thƣ gan nguyên phát là ung thƣ xuất phát từ các loại tế bào gan (hình 1). Ung thƣ gan thứ phát là do các tế bào ung thƣ của các cơ quan, bộ phận khác trong cơ thể di chuyển theo dòng máu hoặc mạch bạch huyết tới gan và định khu tại đây, hình thành khối u. Ung thƣ di căn gan không mang các đặc trƣng của ung thƣ xuất phát từ gan, vì vậy, trong phạm vi luận văn này, chúng tôi chỉ đề cập tới ung thƣ gan nguyên phát với dạng phổ biến nhất là ung thƣ tế bào biểu mô gan (Hepatocellular Carcinoma - HCC) thƣờng gọi là ung thƣ gan [49]. Hình 1. Ung thƣ gan xuất phát từ chính tế bào gan [49] 1.1.1. Phân loại ung thƣ gan nguyên phát Dựa vào phân loại mô bệnh học và loại tế bào phát sinh ung thƣ, ung thƣ gan nguyên phát đƣợc phân thành các loại chính nhƣ sau [42]: 3
LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng - Ung thƣ tế bào biểu mô gan là dạng ung thƣ biểu mô hay gặp nhất trong ung thƣ gan. Ung thƣ bắt nguồn từ các tế bào biểu mô, đây là loại tế bào gan chủ yếu, do đó, HCC chiếm 85 - 95% các trƣờng hợp ung thƣ gan nguyên phát [32]. - Ung thƣ tế bào ống mật, đây là dạng ung thƣ bắt đầu ở các đƣờng mật nhỏ trong gan. Dạng ung thƣ này chỉ chiếm khoảng 5 - 15% [32]. Nguy cơ mắc dạng ung thƣ này sẽ tăng cao khi bệnh nhân bị sỏi mật, loét đƣờng tiêu hóa hay nhiễm các dạng ký sinh trùng trong gan. - Ung thƣ biểu mô hỗn hợp, đây là dạng ung thƣ hiếm gặp, tế bào ung thƣ gồm cả tế bào biểu mô gan và tế bào ống mật. - U nguyên bào gan là loại u gan ác tính ở trẻ em, hiếm gặp ở ngƣời lớn. U nguyên bào gan xuất hiện có thể do các gene hoạt động bất thƣờng. - Ung thƣ tế bào mạch là loại ung thƣ rất hiếm gặp, nó bắt nguồn từ mạch máu trong gan do gan tiếp xúc với các hóa chất công nghiệp nhƣ vinyl chlorid hoặc các hóa chất gây ung thƣ. 1.1.2. Nguyên nhân dẫn tới ung thƣ gan Mặc dù vẫn còn nhiều tranh cãi về cơ chế chính xác dẫn đến ung thƣ gan, song các nghiên cứu đều chỉ ra rằng tác nhân gây ung thƣ là đa nhân tố và quá trình tiến triển thành ung thƣ rất phức tạp, phải trải qua nhiều bƣớc [39]. Các yếu tố nguy cơ chính có thể tiến triển thành HCC bao gồm: các tác nhân gây bệnh nhƣ nhiễm virus viêm gan B (Hepatitis B virus - HBV), virus viêm gan C (Hepatitis C virus - HCV) dẫn tới viêm gan mạn tính; xơ gan; các loại hóa chất nhƣ: rƣợu, aflatoxin B1, vinyl chlorid, asen hoặc các rối loạn trao đổi chất nhƣ nhiễm sắt ở mô, bệnh thiếu hụt α1 - antitrypsin [38]. Tuy rằng, các yếu tố nguy cơ có thể tác động đến tế bào gan theo các con đƣờng khác nhau nhƣng cuối cùng đều làm biến đổi di truyền và dẫn đến hình thành tế bào ung thƣ (hình 2). 4
LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng Hình 2. Cơ chế gây ung thƣ của các tác nhân ung thƣ gan [13] Theo số liệu hồi cứu năm 2006 của Wong và cộng sự (cs) cho thấy, nhiễm HBV mạn tính đƣợc xem nhƣ là yếu tố nguy cơ chính dẫn đến HCC. Các bệnh nhân có phản ứng dƣơng tính với kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg) có nguy cơ phát triển thành HCC cao gấp 70 lần so với ngƣời có phản ứng âm tính HBsAg. Nhiễm HBV là một bệnh phổ biến ở các nƣớc Đông Nam Á, Trung Quốc, Đài Loan, Hàn Quốc, Châu Phi, tại những vùng này có tới 85% - 95% bệnh nhân HCC dƣơng tính với HBsAg. Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng việc HBV chèn DNA của mình vào hệ gene ngƣời bệnh sẽ làm mất tính ổn định của nhiễm sắc thể, hoạt hóa các gene gây ung thƣ hoặc gây bất hoạt các gene ức chế khối u nhƣ TP53. Ngoài ra, các sản phẩm protein của HBV có thể gây rối loạn chu trình tế bào, tạo điều kiện cho sự tiến triển của các tác nhân gây ung thƣ, đồng thời hoạt hóa các yếu tố phiên mã và promoter của các gene cần thiết cho hoạt động sống của virus [38]. Nhiễm virus viêm gan C mạn tính cũng là một yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thƣ gan. Ở các nƣớc phát triển nhƣ Nhật Bản, Ý, Pháp và một số nƣớc thuộc Nam Âu, tỷ lệ bệnh nhân ung thƣ gan có tiền sử viêm gan C chiếm đa số [14]. Các nhà 5
LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng nghiên cứu đã phát hiện ra rằng protein lõi của HCV có thể tác động tới quá trình sinh trƣởng tế bào bằng cách kìm hãm hoạt động phiên mã của promoter p53 [38]. Đồng nhiễm HCV và HBV làm tăng nguy cơ mắc ung thƣ gan từ 2 đến 6 lần so với nhiễm độc lập một loại virus. Aflatoxin là những chất gây ung thƣ có độc tính cao đƣợc hình thành khi thực phẩm và nƣớc bị nhiễm nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Ở các nƣớc đang phát triển thuộc Châu Phi hay một số nơi ở Châu Á, ngƣời dân ăn các thực phẩm nhiễm aflatoxin thì nguy cơ mắc ung thƣ gan cũng tăng. Aflatoxin có thể trực tiếp làm tổn thƣơng gene TP53 gây bất hoạt protein p53. Đồng nhiễm aflatoxin B1 (AFB1) và HBVsẽ gây ra biến đổi p53 ở gốc serine 249. HBV làm hoạt hóa các cytochrome P450 gây bất hoạt quá trình trao đổi AFB1 tạo ra chất gây đột biến là AFB1-8,9-epoxide và các hợp chất chứa oxy có khả năng hoạt động hóa học mạnh làm tế bào mẫn cảm với AFB1 [14]. Ngoài ra, các yếu tố khác nhƣ tuổi, giới tính và chủng tộc cũng góp phần làm tăng nguy cơ bị ung thƣ gan. Nam giới có nguy cơ bị ung thƣ gan cao hơn nữ giới từ hai đến ba lần. Một số nghiên cứu về nội tiết đã chỉ ra rằng, thụ thể hormone giới tính có biểu hiện thay đổi trong khối u HCC [29]. Kết quả điều tra dân số Mỹ cho thấy những ngƣời gốc Châu Á có tỷ lệ ung thƣ cao nhất, ngƣời Mỹ da đen cũng có tỷ lệ mắc ung thƣ cao hơn so với ngƣời da trắng. Tại Việt Nam, theo số liệu thống kê tại bệnh viện Việt Đức trong năm 2008, số bệnh nhân nam mắc u gan cao gấp 3 lần so với bệnh nhân nữ; số bệnh nhân bị u gan có phản ứng dƣơng tính với HBsAg chiếm 65,9% tổng số bệnh nhân u gan; bệnh nhân u gan trong độ tuổi từ 20 đến 60 tuổi chiếm 73,88%, bệnh nhân u gan thuộc nhóm tuổi dƣới 20 và trên 60 tuổi chỉ chiếm 26,12% [tài liệu chƣa công bố]. 1.1.3. Các giai đoạn của ung thƣ gan Căn cứ theo Tiêu chuẩn phân kỳ lâm sàng Quốc tế bệnh ung thư (năm 1993), thông qua các chẩn đoán lâm sàng, sử dụng kỹ thuật hình ảnh để xác định kích cỡ khối u nguyên phát và tình trạng bị xâm lấn các mạch máu, các giai đoạn của ung 6
LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng thƣ gan đƣợc mô tả ở bảng 1 [45, 32]. Ngoài cách phân giai đoạn theo kích thƣớc u, hạch lympho, di căn (Tumor Node Metastasis - TNM), ung thƣ gan còn đƣợc phân loại thành 4 giai đoạn, gồm: giai đoạn I, II, IIIA/B/C và giai đoạn IV [32]. Bảng 1. Tiêu chuẩn phân kỳ lâm sàng bệnh ung thƣ gan [32] Phân loại TNM T N Giai đoạn T1 - Có 1 khối u không xâm lấn đến mạch máu xung quanh. Giai đoạn I N0 - Không có hạch di căn. T1, N0, M0 M0 - Không có sự di căn tới vùng xa. T2 - Một khối u đã xâm lấn mạch máu hoặc nhiều khối u Giai đoạn II trên một lá gan, đƣờng kính u T2, N0, M0 không quá 5cm. T3 - Có nhiều khối u đƣờng kính lớn hơn 5cm hoặc một Giai đoạn IIIA khối u xâm lấn đến tĩnh mạch T3, N0, M0 cửa hoặc phân nhánh chính của tĩnh mạch cửa gan. T4 - Một hoặc nhiều khối u Giai đoạn IIIB xâm lấn trực tiếp tới các cơ T4, N0, M0 quan khác hoặc làm thủng phúc Giai đoạn IIIC mạc tạng. T bất kỳ N1 - Có hạch bạch huyết di căn N1, M0 Giai đoạn IV T bất kỳ M1 - Có di căn tới vùng xa N bất kỳ M1 7
LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng 1.1.4. Các phƣơng pháp chẩn đoán ung thƣ gan Gan đƣợc cấu tạo chủ yếu bởi các tế bào biểu mô gan, loại tế bào này có khả năng tái sinh mạnh nhờ phân bào liên tục, do đó, ung thƣ gan phát triển rất nhanh, kích thƣớc gan có thể tăng gấp đôi sau 4 tháng. Các triệu chứng của HCC thƣờng bộc lộ khi bệnh đã nghiêm trọng và khối u đã lớn, vì vậy, việc phát hiện HCC vào giai đoạn muộn gây khó khăn trong việc điều trị, đây chính là lý do dẫn đến tỷ lệ tử vong do HCC rất cao, chiếm khoảng 70% các trƣờng hợp tử vong do ung thƣ trên toàn thế giới [14]. Hiện nay, phát hiện HCC chủ yếu dựa vào việc xét nghiệm máu để định lƣợng alpha fetoprotein (AFP) trong huyết thanh. AFP là một glycoprotein có khối lƣợng 70kDa, đƣợc tổng hợp ở gan và túi noãn hoàng của thai, sau đó đƣợc tiết vào huyết thanh ở tuần thứ 13 của thai kỳ. Sau khi sinh, nồng độ AFP trong huyết thanh giảm và ở ngƣời bình thƣờng khỏe mạnh chỉ còn 3 - 5ng/ml, rất khó để phát hiện đƣợc ở ngƣời trƣởng thành. AFP có thể đƣợc dùng để sàng lọc ngƣời có nguy cơ bị ung thƣ gan cao [39]. Tuy vậy, AFP trong máu không đặc trƣng cho ung thƣ gan vì nồng độ AFP có thể cũng tăng trong một số trƣờng hợp khác: thai nghén bình thƣờng, viêm gan ở giai đoạn phục hồi, viêm gan mạn tính, ung thƣ tế bào mầm nhƣ ung thƣ tinh hoàn hay mắc một số dạng ung thƣ khác nhƣ ung thƣ dạ dày, ung thƣ đƣờng mật [5]. Xét nghiệm AFP cũng không nhạy bởi có khoảng 15% - 30% bệnh nhân ung thƣ gan mà hàm lƣợng AFP vẫn không tăng [39], nhất là đối với các khối u gan nhỏ hơn 3cm. Hàm lƣợng AFP cao có thể nghĩ đến ung thƣ gan nhƣng không thể là yếu tố quyết định chắc chắn. Vì thế, để chẩn đoán ung thƣ gan cần kết hợp xét nghiệm định lƣợng AFP và chẩn đoán hình ảnh bằng siêu âm, chụp cắt lớp vi tính hay chụp cộng hƣởng từ để có thể thấy đƣợc hình dạng, kích thƣớc và kết cấu của khối u, nhƣng để chẩn đoán chính xác u lành tính hay ác tính thì nhất thiết phải sinh thiết gan. Tuy nhiên, sinh thiết gan gây nguy cơ chảy máu cao, dò dịch mật, vết bầm máu và nhiễm khuẩn có thể xảy ra, đồng thời tăng nguy cơ biến u lành tính chuyển dạng thành ác 8
LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph-¬ng tính và thúc đẩy di căn [50]. Do đó, cần tìm kiếm các chỉ thị sinh học có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn để hỗ trợ cho AFP giúp chẩn đoán sớm ung thƣ gan [26]. 1.2. NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƢ Chỉ thị sinh học là các phân tử đƣợc tìm thấy trong máu, các loại dịch của cơ thể hoặc trong mô đặc trƣng cho một quá trình sinh lý hoặc các giai đoạn bệnh lý. Chỉ thị sinh học có thể đƣợc dùng để xem xét đáp ứng của cơ thể đối với một phác đồ điều trị bệnh hoặc một trạng thái nhất định [46]. 1.2.1. Chỉ thị sinh học đối với ung thƣ Ngày nay, chỉ thị sinh học là một trong những công cụ quan trọng nhất để phát hiện sớm ung thƣ, xác định chính xác sự tiến triển của bệnh, tiên lƣợng và theo dõi điều trị ung thƣ nhằm kéo dài thời gian sống, giảm tỷ lệ tử vong ở bệnh nhân ung thƣ. Các chỉ thị ung thƣ là những đại phân tử xuất hiện ở một bệnh ung thƣ, có nồng độ thay đổi theo chiều hƣớng tăng lên liên quan đến sự phát sinh và tăng trƣởng của những khối u ác tính. Chỉ thị ung thƣ là những chất do các tế bào hoặc mô ung thƣ tổng hợp và tiết ra từ khối u bị phá vỡ hoặc đƣợc tạo ra từ các phản ứng của cơ thể đối với khối u, gồm hai dạng: chỉ thị tế bào và chỉ thị thể dịch. Chỉ thị ung thƣ dạng tế bào bao gồm: các kháng nguyên bề mặt các tế bào, các thụ thể hormone và thụ thể yếu tố tăng trƣởng, những biến đổi di truyền (biến đổi gene) của tế bào. Chỉ thị ung thƣ dạng thể dịch bao gồm: các chất đƣợc phát hiện ở những nồng độ không bình thƣờng có mặt trong huyết thanh, nƣớc tiểu, các loại dịch của cơ thể [3]. Dựa vào khả năng đặc hiệu với bệnh, chỉ thị ung thƣ có thể đƣợc phân loại và đánh giá theo các tiêu chí sau [3]: - Đặc hiệu cao: chỉ thị ung thƣ không tìm thấy ở đối tƣợng khỏe mạnh hoặc u lành tính. - Độ nhạy cao: chỉ thị ung thƣ dễ phát hiện ở giai đoạn sớm khi chỉ có một tế bào ung thƣ xuất hiện. 9