Luận văn Thạc sĩ Lâm nghiệp: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và nhân giống sinh dưỡng loài Sâm Cau tại địa bàn huyện Cam Lộ, tỉnh Quảng Trị

Chia sẻ: Xedapbietbay Xedapbietbay | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:108

Thêm vào BST

Báo xấu

26
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của đề tài nghiên cứu là nghiên cứu và tư liệu hóa được hiện trạng phân bố, đặc điểm sinh thái của loài Sâm cau tại khu vực nghiên cứu. Nghiên cứu được kỹ thuật nhân giống vô tính loài Sâm cau phục vụ bảo tồn và phát triển loài.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Lâm nghiệp: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và nhân giống sinh dưỡng loài Sâm Cau tại địa bàn huyện Cam Lộ, tỉnh Quảng Trị

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HOÀNG THỊ THIẾT NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂMPHÂN BỐ VÀ NHÂN GIỐNG SINH DƯỠNG LOÀI SÂM CAU TẠI ĐỊA BÀN HUYỆN CAM LỘ, TỈNH QUẢNG TRỊ LUẬN VĂN THẠC SĨ LÂM NGHIỆP Chuyên ngành: Lâm học HUẾ - 2018 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HOÀNG THỊ THIẾT NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂMPHÂN BỐ VÀ NHÂN GIỐNG SINH DƯỠNG LOÀI SÂM CAU TẠI ĐỊA BÀN HUYỆN CAM LỘ, TỈNH QUẢNG TRỊ LUẬN VĂN THẠC SĨ LÂM NGHIỆP Chuyên ngành: Lâm học Mã số: 8620201 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. TRẦN MINH ĐỨC HUẾ - 2018 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu“Nghiên cứu đặc điểmphân bố và nhân giống sinh dưỡng loài Sâm Cau tại địa bàn huyện Cam Lộ, tỉnh Quảng Trị” là của bản thân tôi. Các kết quả phân tích trong luận văn là trung thực và chưa được công bố. Nếu có kế thừa kết quả nghiên cứu của người khác thì đều được trích dẫn rõ nguồn gốc. Huế, tháng 3 năm 2018 Tác giả Hoàng Thị Thiết PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
ii LỜI CẢM ƠN Được sự cho phép của phòng đào tạo sau đại học và khoa Lâm Nghiệp Trường Đại học Nông Lâm Huế trong thời gian 29/06/2017 đến 20/01/2018 tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:“Nghiên cứu đặc điểm phân bố và nhân giống sinh dưỡng loài Sâm Cau tại địa bàn huyện Cam Lộ, tỉnh Quảng Trị”. Trong thời gian thực hiện và hoàn thành đề tài, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn Ts. Trần Minh Đức đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình để tôi có thể hoàn thành tốt khóa luận này. Tôi chân thành cảm ơn quý thầy, cô trong khoa Lâm nghiệp, Trường Đại học Nông Lâm Huế đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong 2 năm học tập, Bên cạnh đó, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến toàn thể các anh chị thuộc bộ môn nghiên cứu giống và công nghệ sinh học, trung tâm khoa học Lâm nghiệp Bắc Trung Bộ và anh Phạm Thành; các cô, chú, bác tại địa phương đã nhiệt tình giúp đỡ, cung cấp thông tin, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện đề tài. Đồng thời tôi cũng gửi lời cảm ơn đến bạn bè, anh chị, gia đình đã hỗ trợ, giúp đỡ và luôn bên cạnh động viên tôi trong suốt thời gian qua. Do thời gian và kiến thức có hạn nên khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót. Vậy kính mong sự góp ý, xây dựng của quý thầy, cô giáo, các bạn sinh viên để khóa luận hoàn thiện hơn. Huế, tháng 3/2018 Học viên thực hiện Hoàng Thị Thiết PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
iii TÓM TẮT ĐỀ TÀI Cam Lộ là huyện vùng gò đồi của tỉnh Quảng Trị, nơi có loài Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) phân bố tự nhiên trên đất lâm nghiệp.Tuy nhiên những nghiên cứu về loài cây thuốc có giá trị này tại địa phương chưa được thực hiện. Nguy cơ suy giảm quần thể loài do hoạt động khai thác thiếu bền vững và chuyển đổi mục đích sử dụng đất là rất cao. Điều này sẽ ảnh hưởng đến lợi ích của địa phương trong tương lai.Nhằm xây dựng cơ sở cho việc bảo tồn và phát triển nguồn gen có giá trị này thì việc mở rộng nghiên cứu tại địa phương là một việc làm cần thiết. Đề tài tập trung vào các nội dung nghiên cứu: đặc điểm phân bố và sinh thái của loài, khả năng giâm hom và nuôi cấy mô loài Sâm cau. Các phương pháp thực hiện đề tài gồm: Thu thập số liệu thứ cấp; Thu thập số liệu sơ cấp gồm phương pháp chuyên gia, phương pháp phỏng vấn, phương pháp điều tra thực địa, phương pháp khảo sát trong phòng thí nghiệm, phương pháp bố trí thí nghiệm, sau khi có dữ liệu sơ cấp thì dùng phần mềm exel và SPSS để xử lý. Những kết quả thu được sau 5 tháng thực hiện đề tài: Tạihuyện Cam Lộ,Sâm cau chỉ phân bố rải rác trên địa bànxã Cam Tuyền.Mở rộng diện khảo sát trong địa bàn tỉnh Quảng Trị cho thấy loài này còn có phân bố khá tập trungở xã Vĩnh Chấp,huyện Vĩnh Linh. Sâm cau chủ yếu mọc dưới tán các lâm phần Thông nhựa (Pinus merkusii), đất có lẫn nhiều sỏi đá, từ hơi chua đến gần trung tính (độ pH 6,3-6,9), thảm thực bì có chiều cao thấp, độ che phủ không quá lớn. Kết quả giâm hom:về vị trí hom thì sử dụng đoạn hom thứ 2của thân rễ cho kết quả tốt hơn các đoạn khác;về giá thể thì hỗn hợp phối trộn gồm: phân vi sinh, cát vàng và đấtphù sa theo tỷ lệ về thể tích bằng nhau(1:1:1)cho kết quả tốt nhất. Kết quả nuôi cấy mô: Giai đoạn khử mẫu dùng HgCl2 trong thời gian 7 phút cho tỷ lệ nhiễm nấm thấp và tỷ lệ đạt cao nhất. Đối với tạo chồi thì môi trường MS bổ sung TDZ 0,05-0,07 mg/l trên lá và đỉnh sinh trưởng cho kết quả tốt nhất. Đối với nhân nhanh thì môi trường MS bổ sung NAA 0,1 mg/l + TDZ 0,05 mg/l cho hệ số nhân cao. Đối với kỹ thuật tạo rễ thì môi trường MS bổ sung IBA 0,15mg/l cho số rễ ra nhiều nhất. Một số kiến nghị: Cần nghiên cứu hiện trạng phân bố loài rộng hơn cho tỉnh Quảng Trị. Cần nghiên cứu, đánh giá mức độ ảnh hưởng của kích thước hom giâm và một số chất điều hòa sinh trưởng đến chất lượng hom, cần nghiên cứu thêm giai đoạn nhân nhanh để có môi trường cho hệ số nhân tối đa. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................ii TÓM TẮT ĐỀ TÀI .................................................................................................... iii MỤC LỤC .................................................................................................................. iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... vi DANH MỤC BẢNG .................................................................................................vii DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... ix MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 1. ĐẶT VẤN ĐỀ ......................................................................................................... 1 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU..................................................................................... 2 2.1. Mục tiêu chung ..................................................................................................... 2 2.2. Mục tiêu cụ thể ..................................................................................................... 2 3.Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN ................................................................ 2 3.1.Ý nghĩa khoa học ................................................................................................... 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn................................................................................................... 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU............................................................... 3 1.1. CƠ SỞ LÝ LUẬN CỦA CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU...................................... 3 1.1.1. Tổng quan các khái niệm ................................................................................... 3 1.1.2. Các cơ sở nghiên cứu ........................................................................................ 4 1.2. CƠ SỞ THỰC TIỄN NHỮNG VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ..................................... 7 1.2.1. Tổng quan về cây thuốc ..................................................................................... 7 1.2.2. Tổng quan về cây thuốc ở Việt Nam .................................................................. 8 1.2.3. Một số nghiên cứu về Sâm cau ......................................................................... 10 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................................................................... 13 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................................. 13 2.2. PHẠM VI NGHIÊN CỨU .................................................................................. 13 2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................... 13 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................... 14 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
v 2.4.1. Phương pháp thu thập số liệu ........................................................................... 14 2.4.2. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................ 20 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.................................................................... 21 3.1. ĐIỀU KIỆN TỰ NHIÊN, KINH TẾ - XÃ HỘI HUYỆN CAM LỘ .................... 21 3.1.1. Điều kiện tự nhiên ............................................................................................ 21 3.1.2. Điều kiện kinh tế - xã hội ................................................................................. 24 3.1.3. Hiện trạng tài nguyên rừng và sử dụng đất ở huyện Cam Lộ ............................ 26 3.2. HIỆN TRẠNG PHÂN BỐ CỦA SÂM CAU ...................................................... 32 3.2.1. Tình hình phân bố tự nhiên của Sâm Cau tại khu vực nghiên cứu.................... 32 3.2.2. Các điều kiện sinh thái ảnh hưởng đến phân bố Sâm Cau ................................. 35 3.2.3. Đặc điểm quần thể loài Sâm cau trong tự nhiên ................................................ 38 3.2.4. Đặc điểm tổ thành thảm thực bì trong khu vực có phân bố tự nhiên loài Sâm cau .................................................................................................................... 43 3.3. THỰC TRẠNG KHAI THÁC, SỬ DỤNG VÀ CÁC MỐI ĐE DỌA LOÀI SÂM CAU .......................................................................................................................... 44 3.3.1. Tình hình khai thác, sử dụng về loài ................................................................. 44 3.3.2. Các hoạt động ảnh hưởng và đe dọa đến loài ................................................... 44 3.3.3. Các giá trị của loài ........................................................................................... 44 3.4. THỬ NGHIỆM NHÂN GIỐNG SINH DƯỠNG ................................................ 45 3.4.1. Thử nghiệm nhân giống bằng phương pháp giâm hom ..................................... 45 3.4.2. Thử nghiệm nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào invitro ............ 52 3.4.3. Đánh giá tình hình sinh trưởng và năng suất của cây giâm hom và nuôi cấy mô ...................................................................................................................... 63 3.4.4. Đánh giá hiệu quả của các phương pháp nhân giống ........................................ 64 CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................... 68 4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................................ 68 4.2. TỒN TẠI ............................................................................................................ 69 4.3. KIẾN NGHỊ........................................................................................................ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 70 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 72 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT OTC : Ô tiêu chuẩn CTTN: Công thức thí nghiệm MS: Môi trường cơ bản ĐPS: Đất phù sa PVS: Phân vi sinh PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Đặc trưng các tuyến điều tra chính tại khu vực nghiên cứu ........................ 15 Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm đối với các vị trí lấy hom khác nhau ............................... 17 Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm đối với các nồng độ khác nhau của IBA.......................... 17 Bảng 2.4. Thí nghiệm đối với các nồng độ khác nhau của NAA ................................ 17 Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm đối với các giá thể khác nhau.......................................... 17 Bảng 3.1. Diện tích đất lâm nghiệp chia theo 3 loại rừng ........................................... 27 Bảng 3.2. Diện tích rừng thông theo đơn vị quản lý (ĐVT: ha) .................................. 30 Bảng 3.3: Kết quả điều tra các tuyến ở huyện Cam Lộ ............................................... 33 Bảng 3.4. Tần suất xuất hiện loài Sâm cau theo sinh cảnh.......................................... 35 Bảng 3.5: Kết quả điều tra độ dày thảm mục và tính chất đất tại khu vực nghiên cứu 36 Bảng 3.6: Kết quả điều tra thực bì tại khu vực nghiên cứu ......................................... 37 Bảng 3.7: Kích thước hạt giống Sâm cau ................................................................... 39 Bảng 3.8: Mật độ của Sâm cau tại các OTC ở huyện Vĩnh Linh ................................. 41 Bảng 3.9: Đặc điểm cây tái sinh của loài.................................................................... 41 Bảng 3.10: Chất lượng cây tái sinh tại khu vực nghiên cứu ........................................ 42 Bảng 3.11: Danh mục các loài cây trong khu vực có sự phân bố Sâm cau .................. 43 Bảng 3.12: Ảnh hưởng của vị trí hom đến khả năng sinh trưởng của hom.................. 46 Bảng 3.13: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng sinh trưởng của hom .......................... 47 Bảng 3.14: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng sinh trưởng của hom......................... 48 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của hỗn hợp giá thể đến tỷ lệ ra rễ (%) cây Sâm cau .............. 49 Bảng 3.16. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của hom (%).................................. 50 Bảng 3.17: Ảnh hưởng của giá thể đến sinh trưởng cây ............................................. 51 Bảng 3.18: Ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu trong HgCl2 đến khả khử trùng mẫu53 Bảng 3.19: Ảnh hưởng của TDZ đến tỷ lệ phát sinh chồi ........................................... 54 Bảng 3.20: Ảnh hưởng của TDZ đến chất lượng chồi ................................................ 56 Bảng 3.21: Ảnh hưởng của BAP đến tỷ lệ phát sinh chồi ........................................... 58 Bảng 3.22: Ảnh hưởng của BAP đến chất lượng chồi ................................................ 59 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
viii Bảng 3.23: Ảnh hưởng của môi trường nhân đến hệ số nhân nhanh ........................... 61 Bảng 3.24: Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo rễ của cây con .................... 62 Bảng 3.25: Sinh trưởng của cây giâm hom và nuôi cấy mô ........................................ 64 Bảng 3.26: Thời gian và hệ số nhân chồi.................................................................... 64 Bảng 3.27: Khả năng tái sinh cây con ........................................................................ 65 Bảng 3.28: Hệ số nhân giống từ 1 kg củ Sâm cau ...................................................... 66 Bảng 3.29: Chi phí hóa chất và vật liệu trong quá trình nhân giống............................ 66 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
ix DANH MỤC HÌNH Hình 3.1. Bản đồ hành chính huyện Cam Lộ .............................................................. 21 Hình 3.2. Hiện trạng sử dụng đất huyện Cam Lộ ....................................................... 26 Hình 3.3. Sâm Cau tại khu vực Vĩnh Linh ................................................................. 34 Hình3.4: Sâm Cau ở tuyến điều tra 02 ....................................................................... 36 Hình 3.5: Sâm Cau ở khu vực nghiên cứu .................................................................. 37 Hình 3.6. Hình thái lá, thân cây sâm cau .................................................................... 38 Hình 3.7. Hình thái hoa cây Sâm cau ......................................................................... 39 Hình 3.8. Hình thái quả và hạt cây Sâm cau ............................................................... 40 Hình 3.9. Hình thái thân rễ cây Sâm cau .................................................................... 40 Hình 3.10. Hình thái cây Sâm caucon tái sinh từ hạt .................................................. 42 Hình 3.11: Giâm hom Sâm Cau sau 2 tháng............................................................... 46 Hình 3.12: Giâm hom Sâm Cau có bổ sung IBA ........................................................ 47 Hình 3.13: Giâm hom Sâm Cau có bổ sung NAA ...................................................... 48 Hình 3.14: Các mẫu thí nghiệm bắt đầu nảy chồi bổ sung TDZ ................................. 55 Hình 3.15: Mẫu sau 2 tháng thí nghiệm bổ sung TDZ ............................................... 57 Hình 3.16: Các mẫu thí nghiệm bắt đầu nảy chồi có bổ sung BAP ............................. 59 Hình 3.17: Mẫu sau 3 tháng thí nghiệm bổ sung BAP ............................................... 60 Hình 3.18: Mẫu sau 1 tháng thí nghiệm bổ sung kết hợp NAA và TDZ ..................... 62 Hình 3.19: Mẫu sau 1 tháng thí nghiệm bổ sung IBA ................................................ 63 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
1 MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm trong vành đai nhiệt đới gió mùa nóng ẩm của Châu Á, với ba phần tư diện tích phần lục địa là đồi núi, trải dài từ Bắc xuống Nam. Do sự khác biệt lớn về khí hậu, từ vùng gần xích đạo tới giáp vùng cận nhiệt đới, cùng với sự đa dạng về địa hình, đã tạo nên tính đa dạng sinh học cao ở Việt Nam. Theo thống kê sơ bộ, nước ta có tới gần 12.000 loài thực vật bậc cao có mặt thuộc hơn 2.256 chi, 305 họ (chiếm 4% tổng số loài, 15% tổng số chi, 75% tổng số họ thực vật trên toàn thế giới). Không chỉ có vai trò là lá phổi xanh điều hòa khí hậu, hệ thực vật rừng còn mang đến một tiềm năng to lớn về tài nguyên cây thuốc nói riêng cùng với tài nguyên dược liệu nói chung. Gần đây nhất là thống kê của Võ Văn Chi trong cuốn “Từ điển cây thuốc Việt Nam” (2012) với số lượng loài thực vật được dùng làm thuốc là 4.700. Như vậy, số lượng cây thuốc được nghiên cứu khám phá tăng lên liên tục theo thời gian. Điều đó chứng tỏ, nếu tiếp tục điều tra đầy đủ, nguồn tài nguyên thực vật dùng làm thuốc ở Việt Nam có thể lớn hơn rất nhiều, ước tính có thể lên tới 6.000 loài. Các cây thuốc phân bố rộng khắp cả nước với 8 vùng trọng điểm là Tây Bắc, Đông Bắc, đồng bằng sông Hồng, Bắc Trung Bộ, Đông Trường Sơn, duyên hải Nam Trung Bộ, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ và Đồng bằng sông Cửu Long; tập trung chủ yếu ở 5 trung tâm đa dạng sinh vật là Bạch Mã, Lâm Viên, Hoàng Liên Sơn, Cúc Phương, Yok Đôn và Cát Tiên. Tuy nhiên, với nhu cầu sử dụng các loài dược liệu làm thuốc ngày càng tăng, việc khai thác liên tục trong nhiều năm không chú ý tới bảo vệ tái sinh, cộng với nhiều nguyên nhân khác đã làm cho nguồn tài nguyên dược liệu Việt Nam bị giảm sút nghiêm trọng, nhiều loài đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng. Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) được biết đến như một loài thảo dược quý hiếm có nhiều tác dụng đối với y học. Theo Đông y, thân rễ của Sâm cau có thể trị sốt xuất huyết,chữa tê thấp, đau mình mẩy, chữa liệt dương do rối loạn thần kinh chức năng, chữa cao huyết áp (tiền mãn kinh), bồi bổ tráng dương, trị nam tinh lạnh, nữ lạnh tử cung, chữa phong thấp, lưng lạnh đau, thần kinh suy nhược... Ngày nay, y học hiện đại đã phát hiện trong thân rễ của loài Sâm cau có rất nhiều các hoạt chất hữu ích có thể sử dụng để chữa các bệnh nan y như các hoạt chất oxytocic, preparations, glycosides flavnone, glycosides, curculigoside, steroid, flavonoid, saponin và các hợp chất polyphenolic khác nhau được ứng dụng để chữa vô sinh, ung thư, rối loạn thần kinh… Vì vậy đây là loài được nhiều quốc gia thế giới và nhiều người quan tâm gây trồng và nghiên cứu chữa bệnh. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
2 Cam Lộ là huyện vùng gò đồi của tỉnh Quảng Trị, nơi được ghi nhận là có loài Sâm cau phân bố tự nhiên trên đất lâm nghiệp.Tuy nhiên những nghiên cứu về loài cây LSNG có giá trị này tại địa phương chưa được thực hiện. Nguy cơ suy giảm quần thể loài do hoạt động khai thác thiếu bền vững và chuyển đổi mục đích sử dụng đất là rất cao. Điều này sẽ ảnh hưởng đến lợi ích của người dân và địa phương trong tương lai. Nhằm xây dựng cơ sở cho việc phát triển và bảo tồn nguồn gen này thì việc mở rộng nghiên cứu tại địa phương là một việc làm cần thiết. Đó là lý do chúng tôi chọn để tài “Nghiên cứu đặc điểm phân bố và nhân giống sinh dưỡng loài Sâm Cau tại địa bàn huyện Cam Lộ, tỉnh Quảng Trị”. 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu chung Cung cấp các dữ liệu cần thiết và tìm ra các phương pháp nhân giống hiệu quả để từ đó phục vụ cho công tác bảo tồn và phát triển loài cây Sâm cau. 2.2. Mục tiêu cụ thể - Nghiên cứu và tư liệu hóa được hiện trạng phân bố, đặc điểm sinh thái của loài Sâm cau tại khu vực nghiên cứu. - Nghiên cứu được kỹ thuật nhân giống vô tính loài Sâm cau phục vụ bảo tồn và phát triển loài. 3.Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 3.1.Ý nghĩa khoa học Đề tài góp phần làm rõ quy luật phân bố sinh thái và khả năng nhân giống của loài. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Xác định được vùng phân bố tự nhiên loài Sâm cau phục vụ hoạt động quản lý tài nguyên cây dược liệu. - Tìm được phương pháp nhân giống hiệu quả, từ đó áp dụng để nhân rộng loài, đáp ứng nhu cầu phát triển tại địa phương và khu vực Bắc Trung bộ. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1. CƠ SỞ LÝ LUẬN CỦA CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1.1. Tổng quan các khái niệm 1.1.1.1. Khái niệm về nhân giống sinh dưỡng Nhân giống sinh dưỡng là nhân giống bằng các vật liệu vô tính, tức là không có sự kết hợp giữa các tính đực và cái của cây bố mẹ để tạo phôi như trong nhân giống từ hạt. Các đặc tính di truyền của cây được nhân ra hoàn toàn giống với cây mẹ ban đầu (cây đầu dòng). Tập hợp các cây được hình thành qua nhân giống sinh dưỡng từ một cây mẹ ban đầu, đồng nhất về mặt di truyền được gọi là dòng [10]. Có 4 phương pháp chính nhân giống sinh dưỡng cây lâm nghiệp: - Giâm hom cành: thúc đẩy rễ hình thành trên một đoạn thân cắt từ cây mẹ sao cho trở thành một cây độc lập. - Ghép: gắn một phần nhỏ lấy từ cây được tuyển chọn (chồi hay đoạn cành nhỏ) lên một cây khác đã có rễ, thường là cùng một loài. - Chiết: thúc đẩy rễ hình thành trên cành khi cành còn gắn trên cây mẹ tuyển chọn. - Nuôi cấy mô: thúc đẩy các tế bào từ cây mẹ tuyển chọn sinh trưởng trên những môi trường đặc biệt và bằng cách thay đổi thành phần môi trường thúc đẩy các tế bào này hình thành rễ, lá và cành [10]. Trong đề tài này chúng tôi tiến hành nghiên cứu thử nghiệm phương pháp giâm hom rễ củ và nuôi cấy mô đối với loài Sâm Cau 1.1.1.2. Khái niệm về chất điều hòa sinh trưởng Chất điều hòa sinh trưởng thực vật (còn gọi là các hormone sinh trưởng) là những chất được sinh ra trong cây để điều khiển các quá trình sinh trưởng phát triển của cây.Trong suốt đời sống, cây phải trải qua nhiều giai đoạn phát triển như nảy mầm, lớn lên, ra hoa, kết quả. Các chất điều hòa sinh trưởng giúp cây tiến hành các giai đoạn này một cách cân đối hài hòa theo đặc tính và quy luật phát triển của cây với liều lượng rất thấp [4]. Bên cạnh các chất điều hòa sinh trưởng tự nhiên (được tổng hợp ở trong cơ thể thực vật) còn có các chất do con người tổng hợp nên (gọi là các chất điều hòa sinh trưởng nhân tạo). Ngày nay bằng con đường hóa học con người đã tổng hợp nên hàng loạt các chất khác nhau nhưng có hoạt tính sinh lý tương tự với các chất điều hòa sinh trưởng, phát triển của cây trồng, nhằm tăng năng suất và phẩm chất của cây trồng. Các PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
4 chất điều hòa sinh trưởng nhân tạo ngày càng phong phú và được ứng dụng rỗng rãi trong sản xuất nông nghiệp. Axit indol-3-butyric (IBA):Axit indol-3-butyric (axit 1H-indol-3-butanoic, IBA) là một tinh thể màu trắng để ánh sáng vàng vững chắc, với công thức phân tử C12H13NO2. Nó nóng chảy ở 125 0C trong áp suất khí quyển và phân hủy trước khi sôi. IBA là một hormone thực vật thuộc nhóm auxin và là thành phần trong nhiều sản phẩm được sản xuất nhằm kích thích sinh trưởng của rễ. Ngoài ra IBA còn có một số tên khác như axit indol-3-butyric, axit 3-indolebutyric, axit indolebutyric. IBA không hòa tan trong nước, nó thường được hòa tan trong nước với nồng độ 75% hoặc với rượu để sử dụng làm chất kích thích ra rễ[9]. 1-Naphthaleneacetic acid (NAA), α-naphtalene acetic acid là hợp chất hữu cơ với công thức là C10H7CH2CO2H. Đây là hormone tổng hợp trong họ Auxin và cũng là thành phần trong sản phẩm kích thích ra rễ. Do đó hormone này thường được sử dụng trong quá trình nhân giống. Ngoài ra, nó còn được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô thực vật, kết hợp với các loại hormone khác để định hình sự phát triển của mô thực vật [9]. 6-Benzylaminopurine (BAP) là dạng cytokinin tổng hợp đầu tiên giúp cho quá trình phát triển của cây, kích thích ra hoa và sự phát triển của quả bằng cách kích thích sự nhân chia tế bào. Trong nuôi cấy mô thực vật, kết hợp tỷ lệ giữa Auxins và Cytokinins sẽ định hình sự phát triển của mô thực vật [9]. TDZ là một loại cytokinin có tác dụng kích thích phân chia tế bào, làm chậm quá trình già của tế bào. Trong nuôi cấy mô thực vật người ta thường kết hợp tỉ lệ giữa Auxins và Cytokinins để tạo chồi, tạo mô sẹo, tái sinh chồi từ mô sẹo và tạo rễ. Sự kết hợp tùy vào từng nghiên cứu và mục đích định hình cho mô thực vật [9]. 1.1.2. Các cơ sở nghiên cứu 1.1.2.1. Cơ sở nghiên cứu nhân giồng sinh dưỡng  Cơ sở tế bào: Cũng như các loài sinh vật khác, cơ thể cây rừng được tạo ra rừ tế bào. Tế bào là một cơ thể hoàn chỉnh. Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề ra phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn thể của tế bào. Theo ông mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Như vậy mỗi tế bào riêng lẽ của một cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật đó và nếu gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh. [15] PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
5  Cơ sở phát sinh và phát triển Quá trình phát sinh, phát triển cá thể của mỗi sinh vật nói chung và cây rừng nói riêng được điều khiển bởi bộ gen đặc trưng cho cá thể đó. Hoạt động của bộ gen lại bị chi phối bởi môi trường xung quanh thông qua một hệ enzyne đặc hiệu. Có thể phân chia phát triển của cơ thể cây rừng thành 3 giai đoạn: Non trẻ, chuyển tiếp và thành thục. Các bộ phận sinh dưỡng ở các giai đoạn khác nhau có đặc điểm khác nhau thể hiện là: - Khả năng tái sinh của bộ phận sinh dưỡng ( chồi, rễ…) đây là một dấu hiệu quan trọng xác định sự chuyển giai đoạn từ non trẻ sang thành thục và được chú trọng trong nhân giống sinh dưỡng. Những vật liệu lấy từ bộ phận non trẻ sẽ có khả năng ra chồi và rễ bất định lớn hơn vật liệu lấy từ các bộ phận thành thục. Chính vì thế mà việc làm trẻ hóa vật sinh dưỡng là rất quan trọng trong nhân giống sinh dưỡng. Các phương pháp làm trẻ hóa vật liệu thường dùng là: - Đặc điểm hình thái, giải phẫu sinh lý: Tất cả các đặc điểm khác biệt giữa các giai đoạn phát triển của các bộ phận sinh dưỡng đều ảnh hưởng đến quá trình nhân giống sinh dưỡng. [15]  Cơ chế hình thành rễ. Quá trình hình thành rễ được chia thành 3 giai đoạn: - Sau khi cắt hom, các tế bào trên mặt cắt bị tổn thương và chết, hình thành nên một lớp tế bào thối trên bề mặt. Sau đó, vết thương được bao bọc một lớp bần, mặt gỗ được đậy lại bằng một lớp keo, lớp bảo vệ này giúp mặt cắt khỏi bị thoát nước. - Các tế bào sống ngay dưới lớp mặt cắt sẽ phân chia thành một lớp mô mềm gọi là mô sẹo. Hiện tượng này xảy ra vài giây sau khi cắt hom. - Các tế bào ở vùng lân cận của tượng tầng, mạch gỗ, libe bắt đầu hình thành gỗ bất định. Thời gian hình thành rễ của hom giâm ở các loài cây khác nhau có biến động rất lớn, từ vài ngày đối với loài dễ ra rễ cho đến vài tháng đối với loài khó ra rễ [15].  Nghiên cứu nhân giống sinh dưỡng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào invitro: Năm 1665, Robert Hooke quan sát thấy tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra khái niệm "tế bào - Cell". Anton Van Leuwen Hoek (1632-1723) thiết kế kính hiển vi khuyếch đại được 270 lần, lần đầu tiên quan sát thấy vi khuẩn, tế bào tinh trùng trong tinh dịch người và động vật. Năm 1838, Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết cơ bản của sinh học gọi là Học thuyết tế bào: PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
6 + Mọi cơ thể sống được cấu tạo bởi một hoặc nhiều tế bào. + Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của cơ thể sống, là hình thức nhỏ nhất của sự sống. + Tế bào chỉ được tạo ra từ tế bào tồn tại trước đó. Năm 1875, Oscar Hertwig chứng minh bằng quan sát trên kính hiển vi rằng sự thụ thai là do sự hợp nhất của nhân tinh trùng và nhân trứng. Sau đó, Hermann P., Schneider F.A và Butschli O. đã mô tả chính xác quá trình phân chia tế bào. Năm 1883, Wilhelm Roux lần đầu tiên lý giải về phân bào giảm nhiễm ở cơ quan sinh dục. Từ một tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có thể tái sinh thành một cơ thể sống hoàn chỉnh. Khả năng này của 5 Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật tế bào thực vật được gọi là tính toàn năng. Cơ thể thực vật được cấu tạo từ những đơn vị hình thái được gọi là tế bào, mỗi tế bào được liên kết với những tế bào khác bởi chất kết dính gian bào bao quanh. Trong khối liên kết đó có những nhóm tế bào khác biệt về hình thái hoặc về chức năng hoặc cả hai với những nhóm khác. Nhũng nhóm như thế được gọi là mô. Một số mô cấu tạo đơn giản, chỉ gồm một loại tế bào, những mô khác phức tạp hơn gồm nhiều hơn một kiểu tế bào. Đây là phương pháp nhân giống vô tính tiên tiến nhất hiện nay. Bộ phận để nhân giống có thể là ngọn cây, ngọn cành, nhánh một phần của lá, hoa, rễ cây. Nhân giống hoa ở các nước tiên tiến đều sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào đối với cây hoa cúc, cẩm chướng, đồng tiền, loa kèn, lay ơn… Cơ thể thực vật được cấu tạo từ những đơn vị hình thái được gọi là tế bào, mỗi tế bào được liên kết với những tế bào khác bởi chất kết dính gian bào bao quanh. Trong khối liên kết đó có những nhóm tế bào khác biệt về hình thái hoặc về chức năng hoặc cả hai với những nhóm khác. Những nhóm như thế được gọi là mô. Một số mô cấu tạo đơn giản, chỉ gồm một loại tế bào, những mô khác phức tạp hơn gồm nhiều hơn một kiểu tế bào [15] Ưu điểm: cây được sản xuất từ nuôi cấy mô tế bào là sạch bệnh, cây sinh trưởng, phát triển khoẻ, độ đồng đều cao, hệ số nhân giống cao so với các phương pháp nhân giống khác.[15] Nhược điểm phải đầu tư các phương tiên kỹ thuật, hoá chất. Giá thành cây con giống cao, khó áp dụng.[15] PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
7 1.2. CƠ SỞ THỰC TIỄN NHỮNG VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.2.1. Tổng quan về cây thuốc 1.2.1.1. Tổng quan về cây thuốc trên thế giới Thế giới ngày nay có hơn 35.000 loài thực vật được dùng làm thuốc. Khoảng 2500 cây thuốc được buôn bán trên thế giới. Có ít nhất 2000 cây thuốc được sử dụng ở châu Âu, nhiều nhất ở Đức 1543.Ở Châu Á có 1700 loài ở Ấn Độ, 5000 loài ở Trung Quốc. Trong đó, có đến 90% thảo dược thu hái hoang dại. Do đòi hỏi phát triển nhanh hơn sự gia tăng sản lượng, các nguồn cây thuốc tự nhiên bị tàn phá đến mức không thể cưỡng lại được, ước tính có đến 50% đã bị thu hái cạn kiệt. Hiện nay, chỉ có vài trăm loài được trồng, 20-50 loài ở Ấn Độ, 100-250 loài ở Trung Quốc, 40 ở Hungari, 130-140 ở Châu Âu. Những phương pháp trồng truyền thống đang dần được thay thế bởi các phương pháp công nghiệp ảnh hưởng tai hại đến chất lượng của nguồn nguyên liệu này [14]. Hiện nay, phong trào dùng cây thuốc để phòng và chữa bệnh trên thế giới đã đặt ra một vấn đề cần lưu tâm: 2/3 trong số 50.000 loài cây thuốc được sử dụng, khai thác từ các cây hoang dại sẵn có nhưng không được trồng lại để bổ xung [13]. Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO) đánh giá cho đến nay 80% dân số trên thế giới dựa vào nền y học cổ truyền để đáp ứng cho nhu cầu chăm sóc sức khoẻ ban đầu, trong đó chủ yếu là thuốc từ cây cỏ. Sự quan tâm về các hệ thống y học cổ truyền và đặc biệt là các loại thuốc dược thảo, thực tế là đã ngày càng gia tăng tại các nước phát triển và đang phát triển trong hơn hai thập kỷ qua. Các thị trường dược thảo quốc gia và toàn cầu đã và đang tăng trưởng nhanh chóng, và hiện đang mang lại rất nhiều lợi nhuận kinh tế. Vì vậy quốc gia nào cũng có chương trình điều tra và tái điều tra nguồn tài nguyên dược liệu trong kế hoạch bảo tồn và phát triển đa dạng sinh học của đất nước mình. Theo một nghiên cứu của nhà thực vật học người Anh Alan Hamilton, thành viên của Quỹ Thế giới Bảo vệ Thiên Nhiên (viết tắt là WWF), có tới 4.000 – 10.000 loài cây cỏ dùng làm thuốc có nguy cơ bị tiệt chủng. Nguyên nhân không phải hoàn toàn do sự phát triển của Y học cổ truyền mà theo tác giả là do thị trường dược thảo ở Châu Âu và Bắc Mỹ tăng trưởng 10% mỗi năm trong vòng 10 năm nay. Trên quy mô toàn cầu, doanh số mua bán cây thuốc hàng năm ước tính lên tới 16 tỷ Euro. 1.2.1.2. Một số công trình nghiên cứu về cây thuốc Tài liệu cổ về cây thuốc hiện còn lại không nhiều, tuy nhiên có thể coi năm 2838 trước công nguyên (TCN) là năm hình thành bộ môn nghiên cứu cây thuốc và dược liệu. Cuốn “Kinh thần nông” vào thế kỉ I sau công nguyên (SCN) đã ghi chép PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
8 364 vị thuốc. Đây là cuốn sách tạo nền tảng cơ bản cho sự phát triển liên tục của nền y học dược thảo Trung Quốc cho đến ngày nay. [5] Năm 1595 trước công nguyên (TCN), Lý Thời Trân (Trung Quốc) đã tổng kết tất cả kinh nghiệm về cây thuốc và dược liệu để soạn thành quyển: “Bản thảo cương mục”. Đây là cuốn sách vĩ đại nhất của Trung Quốc về lĩnh vực này. Tác giả đã mô tả và giới thiệu 1094 cây thuốc và vị thuốc từ cây cỏ[5]. Năm 384 – 322 TCN Aristote người Hy Lạp đã ghi chép và lưu giữ sớm nhất kiến thức về cây cỏ ở nước này. Sau đó, năm 340 TCN Theophraste với tác phẩm “Lịch sử thực vật” đã giới thiệu gần 480 loài cây cỏ và công dụng của chúng. Tuy công trình của ông mới chỉ dừng lại ở mức mô tả, thống kê, song nó mở đầu cho một giai đoạn tìm tòi, nghiên cứu sâu về lĩnh vực này. [7] Thầy thuốc người Hy Lạp Dioscorides năm 60 – 20 (TCN) giới thiệu 600 loài cây cỏ chủ yếu để chữa bệnh. Đồng thời, ông cũng là người đặt nền móng cho nền y dược học [7] Năm 79 -23 TCN, nhà tự nhiên học người La Mã Plinus soạn thảo bộ sách “Vạn vật học” gồm 37 tập giới thiệu 1.000 loài cây có ích [7]. Năm 1533 -1617, nhà thực vật học người Ý Piospiero Alpim phát hiện sự tồn tại của cá thể đực, cái của cây Chà là, miêu tả được hình thái của cây Cà phê[18] Nhà Thực vật học người Thụy Sĩ: Alphonse de Cadoue với tác phẩm: “Địa lý học tự nhiên” (1855) và “Nguồn gốc cây trồng” (1883) đã thống kê các loài cây có ích [18]. Charles Pickering (1879) đã nghiên cứu và đúc kết rút lại cho biết người Ai Cập cổ đại đã biết sử dụng những cây có tinh dầu để điều trị bệnh và ướp xác các vua chúa hoặc làm nước thơm từ hơn 4.000 năm trước Công nguyên. Người Nhật Bản đã biết sử dụng cây Bạc hà làm thuốc trị bênh từ 2.000 năm trước đây…[2] Năm 1952, tác giả người Pháp A.Pétélot có công trình “Les phantes de mesdicinales du Cambodye, du Laos as du Vietnam” gồm 4 tập nghiên cứu về cây thuốc và sản phẩm làm thuốc từ thực vật ở Đông Dương (A.Pétélot, 1952 -1954). 1.2.2. Tổng quan về cây thuốc ở Việt Nam 1.2.2.1. Hiện trạng, các nghiên cứu và sử dụng cây thuốc ở Việt Nam Ở nước ta, công tác điều tra dược liệu trải qua nhiều giai đoạn. Ở miền Bắc, được tiến hành từ năm 1961 do Viện Dược liệu chủ trì. Ở miền Nam, do Phân Viện Dược liệu TP.HCM kết hợp với các trạm dược liệu tỉnh thực hiện từ năm 1980 – 1985 ở hầu hết các tỉnh thành phía nam từ Quảng Nam - Đà Nẵng trở vào. Gần đây, là việc tái điều tra lại nguồn dược liệu trong cả nước do Viện Dược liệu và Trung tâm Sâm và Dược liệu TP.HCM thực hiện phối hợp với địa phương tập trung ở các tỉnh miền PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
9 Trung và Tây Nguyên. Kết quả ghi nhận được cho đến năm 2005 trong cả nước có tất cả 3.948 loài cây thuốc thuộc 1.572 chi và 307 họ thực vật vượt qua con số 3.200 loài được ghi nhận trong từ điển cây thuốc Việt Nam (Võ Văn Chi, 1997). Trong số đó trên 90% là cây hoang dại và có 144 loài đã được đưa vào «Danh lục Đỏ cây thuốc Việt Nam năm 2006» và «Cẩm nang Cây thuốc cần bảo vệ ở Việt Nam» (Nguyễn Tập, 2006). Điều này cho thấy tiềm năng cây thuốc rất phong phú mà chúng ta vẫn chưa phát hiện hết trong tự nhiên và việc sử dụng chúng trong dân gian cũng như từ những nền y học cổ truyền khác của thế giới. Theo thống kê của ngành Lâm nghiệp, diện tích rừng ở nước ta từ 14,3 triệu héc ta vào năm 1943, đến năm 1993 chỉ còn khoảng 9,3 triệu héc ta (Bộ Lâm nghiệp, 1995). Trong đó, diện tích rừng nguyên thủy còn lại không tới 1% tổng diện tích lãnh thổ (Averyanov, L. V. et al., 2004). Rừng bị phá hủy sẽ làm cho toàn bộ tài nguyên rừng ở đó bị mất đi, trong đó có cây làm thuốc và còn kéo theo nhiều hậu quả khác (Nguyễn Tập, 2007). Trong khi đó xu hướng trở về với thiên nhiên, tìm kiếm nguồn thuốc mới từ cây cỏ, sử dụng thuốc từ thảo dược trên thế giới ngày càng tăng. Ngày 22/3/2005, tại Quyết định số 765/2005/QĐ-BYT, Bộ trưởng Bộ Y tế đã phê duyệt kế hoạch thực hiện Chính sách quốc gia về Y Dược học cổ truyền đến năm 2010. Quyết định này có nêu rõ: Bộ Y tế phối hợp với Bộ Nông nghiệp - Phát triển nông thôn quy hoạch vùng chuyên trồng dược liệu, từng bước đến 2010 đạt GACP (Thực hành tốt trồng trọt và thu hái dược liệu). Nền y học cổ truyền của nước ta đã được hình thành qua quá trình lao động và sản xuất. Trong đó nhiều cây thuốc, bài thuốc được áp dụng chữa bệnh trong dân gian có hiệu quả cao.Và những kinh nghiệm dân gian quý báu đó đã dần đúc kết thành những cuốn sách có giá trị và lưu truyền rộng rãi trong dân gian. o Đỗ Tất Lợi “ Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” o Phạm Hoàng Hộ “ Cây có vị thuốc ở Việt Nam” o Võ Văn Chi “ Từ điển cây thuốc Việt Nam” Theo kết quả điều tra trên phạm vi toàn quốc từ 1961-1985, Viện Dược liệu đã ghi nhận được ở nước ta có 1.836 loài thuộc 263 họ được sử dụng làm thuốc. Trước đó, vào năm 1952, các nhà thực vật học và tài nguyên thực vật học Pháp cho biết, trên bán đảo Ðông Dương có 1.350 loài cây thuốc thuộc 160 họ. Hiện nay, theo Võ Văn Chi, con số này đã lên tới gần 3.200 loài thuộc 1.200 chi của trên 300 họ, nghĩa là hầu hết các họ trong hệ thực vật Việt Nam, ít hoặc nhiều đều có một số loài có thể sử dụng làm thuốc. Tuyệt đại đa số các loài là cây thuốc được sử dụng theo kinh nghiệm lâu đời của cộng đồng các dân tộc Việt Nam[6]. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma