Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen matK, ITS của cây Lan một lá (Nervilia fordii)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:49

Thêm vào BST

Báo xấu

30
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm mô tả, xác định các đặc điểm hình thái đặc trưng và phân tích trình tự hai vùng gen có độ biến thiên cao, thích hợp cho định loại phân tử là ITS và matK của loài Lan một lá (Nervilia fordii) ở Việt Nam, góp phần tư liệu hóa nguồn gen của cây Lan một lá và xây dựng mã vạch DNA.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen matK, ITS của cây Lan một lá (Nervilia fordii)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TRẦN THỊ THÙY LINH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ TRÌNH TỰ GEN matK, ITS CỦA CÂY LAN MỘT LÁ (Nervilia fordii) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TRẦN THỊ THÙY LINH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ TRÌNH TỰ GEN matK, ITS CỦA CÂY LAN MỘT LÁ (Nervilia fordii) Ngành: Di truyền học Mã số: 8 42 01 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. NguyễnThị Tâm Thái Nguyên - 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác. Thái Nguyên, tháng 5 năm 2019 Tác giả luận văn Trần Thị Thùy Linh XÁC NHẬN XÁC NHẬN CỦA KHOA CHUYÊN MÔN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn thạc sĩ này. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô và cán bộ Bộ môn Di truyền học hiện đại, Khoa Sinh học, Bộ phận Sau đại học thuộc Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình và bạn bè trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn. Thái Nguyên, tháng 5 năm 2019 Tác giả luận văn Trần Thị Thùy Linh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................... iv DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................. v MỞ ĐẦU ........................................................................................................... v 1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 4 1.1. Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm sinh học của lan Một lá ...................... 4 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại........................................................................... 4 1.1.2. Đặc điểm sinh học ................................................................................... 4 1.1.3. Phân bố .................................................................................................... 5 1.1.4. Thành phần hóa học của cây lan Một lá ................................................. 6 1.1.5. Công dụng của cây lan Một lá ................................................................ 7 1.2. Mã vạch DNA (DNA barcode) .................................................................. 8 1.3. Sử dụng mã vạch DNA trong nhận biết cây dược liệu ............................ 10 1.3.1. Đặc điểm vùng ITS ................................................................................ 10 1.3.2. Đặc điểm gen matK ............................................................................... 11 1.4. Tình hình nghiên cứu về gen matK, ITS của Việt Nam và trên thê giới.. 11 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 14 2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu.................................. 15 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 15 2.1.2 Hóa chất, thiết bị .................................................................................... 15 2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu........................................................ 15 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 15 2.2.1. Phương pháp thu mẫu ........................................................................... 15 2.2.2. Phương pháp đánh giá một số đặc điểm hình thái ................................ 16 2.2.3. Các phương pháp sinh học phân tử ....................................................... 16 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 20 3.1. Đặc điểm hình thái của mẫu lan Một lá thu thập tại Thái Nguyên và Cao Bằng................................................................................................................. 20 3.2. Đặc điểm của gen matK và ITS phân lập từ cây lan Một lá .................... 22 3.2.1. Kết quả tách chiết DNA từ lá cây lan Một lá ........................................ 22 3.2.2. Kết quả nhân gen matK và ITS bằng phản ứng PCR ............................ 23 3.2.3. Kết quả xác định trình tự nucleotit đoạn gen matK và ITS phân lập từ các mẫu lan Một lá .......................................................................................... 24 3.3. Sự đa dạng về trình tự nucleotit của vùng ITS và matK của cây lan Một lá ......................................................................................................................... 32 3.3.1. Sự đa dạng về trình tự nucletotit của vùng ITS của cây lan Một lá ......... 32 3.3.2. Sự đa dạng về trình tự nucletotit của đoạn gen matK của cây lan Một lá . 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 37 1. Kết luận ....................................................................................................... 37 2. Đề nghị ........................................................................................................ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 38 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại khoa học Chi lan Một lá (Nervilia fordii)......................... 4 Bảng 2.1.Trình tự các cặp mồi nhân bản gen ITS và matK ............................ 17 Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR ........................................................ 17 Bảng 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng nhân gen ITS và matK ..................... 18 Bảng 3.1. Số lượng và tỉ lệ từng loại nucleotit của vùng ITS từ mẫu LML-01- TN (ITS-01-TN) và mẫu LML-02-CB (ITS-02-CB) ..................................... 24 Bảng 3.2. Các vị trí nucleotit sai khác giữa trình tự nucleotit của đoạn gen matK của mẫu lan Một lá matK-02-CB với JX865503 và JN004498. .......... 32 Bảng 3.3. Mã số, năm công bố, quốc gia và tác giả của 5 trình tự vùng ITS trên GenBank................................................................................................... 33 Bảng 3.4. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly dựa trên trình tự vùng ITS từ mẫu LML-01-TN và LML-02-CB với trình tự vùng ITS trên GenBank. ....... 33 Bảng 3.5. Mã số, năm công bố, quốc gia và tác giả của 5 trình tự gen matK trên GenBank................................................................................................... 35 Bảng 3.6. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly dựa trên trình tự đoạn gen matK từ mẫu LML-02-CB với các trình tự đoạn gen matK trên GenBank. ............ 35 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây lan Một lá (Nervilia fordii) thu thập ở Hòa An - Cao Bằng và Định Hóa - Thái Nguyên. ................................................................................... 5 Hình 3.1. Hình ảnh thân, rễ, lá của mẫu cây lan Một lá thu tại huyện Hòa An tỉnh Cao Bằng (LML-02-CB).......................................................................... 21 Hình 3.2. Hình ảnh thân, rễ, lá của mẫu cây lan Một lá thu tại huyện Định Hóa tỉnh Thái Nguyên (LML-01-TN). ............................................................ 21 Hình 3.3. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số ........................... 23 Hình 3.4. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen matK và ITS từ hai mẫu lan Một lá........................................................................................... 24 Hình 3.5. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự vùng gen ITS mẫu lan Một lá mẫu LML-02-CB với một số trình tự vùng ITS trên GenBank bằng BLAST trong NCBI ........................................................................................ 26 Hình 3.6. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự vùng gen ITS mẫu lan Một lá LML-01-TN với một số trình tự vùng ITS trên GenBank bằng BLAST trong NCBI ...................................................................................................... 26 Hình 3.7. Trình tự vùng ITS của mẫu LML-01-TN, LML-02-CB và hai trình tự mang mã số JX011630 và JX011631 trên GenBank .................................. 28 Hình 3.8. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự gen matK của mẫu lan Một lá LML-02-CB với một số trình tự gen matK trên GenBank bằng BLAST trong NCBI. ....................................................................................... 29 Hình 3.9. Trình tự đoạn gen matK của mẫu LML02-CB và hai trình tự mang mã số JX865503 và JN004498 trên GenBank ................................................ 31 Hình 3.10. Mối quan hệ di truyền của mẫu lan Một lá dựa trên phân tích trình tự nucleotit của vùng ITS. ............................................................................... 34 Hình 3.11. Mối quan hệ di truyền của mẫu lan Một lá dựa trên phân tích trình tự nucleotit của đoạn gen matK. ...................................................................... 36 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Việt Nam là quốc gia nằm trong vùng nhiệt đới có hệ thực vật vô cùng đa dạng và phong phú. Theo thống kê, ở nước ta hiện có gần 12.000 loài thực vật bậc cao có mạch thuộc hơn 2.256 chi, 305 họ, 69 loài thực vật hạt trần, 12.000 loài thực vật hạt kín, 2.200 loài nấm, 2.176 loài tảo, 481 loài rêu, 368 loài vi khuẩn lam, 691 loài dương xỉ và 100 loài khác [1], [7]. Trong số các loài thực vật ở nước ta có nhiều loài được sử dụng làm thuốc chữa bệnh. Trải qua nhiều năm điều tra nghiên cứu, thống kê cho thấy ở Việt Nam có khoảng hơn 3.800 loài thực vật được dùng làm thuốc. Đó là nguồn tài nguyên vô cùng quý giá [2],[8]. Hiện nay nhiều loài có giá trị đang bị người dân khai thác và thu hái để bán vì lợi ích kinh tế. Trong đó, loài lan Một lá (Nervilia fordii) thuộc họ Lan (Orchidaceae) có nhiều công dụng như: làm thuốc giải độc nhất là ngộ độc nấm, làm mát phổi, chữa ho lao, ho lâu năm, viêm phế quản…[2]. Ở nước ta hiện có 5 loài thuộc chi Nervilia đó là: Nervilia aragoana, Nervilia crispata, Nervilia fordii, Nervilia plicata và Nervilia prainiana mang một số đặc điểm hình thái tương tự nhau [2],[6]. Trước đây, việc phân biệt các giống, loài chủ yếu thông qua đặc điểm hình thái. Tuy nhiên, một số loài có đặc điểm hình thái rất giống nhau, do vậy khó có thể nhận biết và phân biệt một cách chính xác nếu chỉ dựa trên các đặc điểm hình thái giải phẫu. Để khắc phục được khó khăn trong phân loại hình thái thì phương pháp phân loại học phân tử là phương pháp mang lại hiệu quả. Phân loại học phân tử (Molecular taxonomy) là phương pháp phân loại chủ yếu dựa trên các kỹ thuật phân tích DNA cho những kết quả chính xác, giúp cho việc phát hiện loài mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại. So với chỉ thị hình thái, chỉ thị DNA cho độ chính xác cao mà không lệ thuộc vào các yếu tố môi trường. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Trong các phương pháp phân loại phân tử, mã vạch DNA (DNA barcode) là phương pháp phổ biến nhất dựa trên những đoạn trình tự DNA ngắn có tốc độ tiến hóa đủ nhanh để hỗ trợ giải quyết những khó khăn trong phân loại hình thái. Trên đối tượng thực vật, các vùng mã vạch DNA thường được sử dụng trong phân loại phân tử thường là các trình tự thuộc hệ gen nhân như ITS (Internal transcribed spacer) và hệ gen lục lạp như psbAtrnH, matK, rbcL, rpoC1... Đối với các loài thuộc chi Nervilia, các nhà nghiên cứu đã chỉ ra xu thế phân loại của vùng gen matK so với 3 vùng gen ITS2, rbcL và LSU D1- D3. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu về mã vạch DNA đã chỉ ra rằng việc sử dụng kết hợp hai mã vạch DNA cho kết quả phân loại tốt hơn so với từng mã vạch đơn lẻ. Cho đến nay, ở Việt Nam vẫn chưa có công trình nào nghiên cứu đặc điểm hình thái chi tiết và mã vạch DNA của loài lan Một lá Nervilia fordii. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen matK, ITS của cây Lan một lá (Nervilia fordii)” nhằm mô tả, xác định các đặc điểm hình thái đặc trưng và phân tích trình tự hai vùng gen có độ biến thiên cao, thích hợp cho định loại phân tử là ITS và matK của loài Lan một lá (Nervilia fordii) ở Việt Nam, góp phần tư liệu hóa nguồn gen của cây Lan một lá và xây dựng mã vạch DNA. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Phân tích được đặc điểm hình thái của một số mẫu lan Một lá thu thập ở địa phương khác nhau. - Dựa trên phân tích trình tự gen ITS và matK để xác định được mối quan hệ di truyền giữa các mẫu nghiên cứu và phục vụ xây dựng mã vạch DNA cho lan Một lá (Nervilia fordii). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu đặc điểm hình thái của một số mẫu lan Một lá thu được ở một số địa phương khác nhau. - Phân lập và giải trình tự vùng ITS và đoạn gen matK từ một số mẫu lan Một lá. - Phân tích, so sánh trình tự nucleotit của vùng ITS và đoạn gen matK từ các mẫu lan Một lá thu được và lập cây phát sinh chủng loại. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm sinh học của lan Một lá 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại Chi lan Một lá (Nervilia) gồm các loài sống sát mặt đất. Chi Nervilia có khoảng 65 loài đã được ghi nhận. Ở Việt Nam có 5 loài thuộc chi Nervilia đó là: Nervilia aragoana, Nervilia crispata, Nervilia fordii, Nervilia plicata và Nervilia prainiana. Cây đầu tiên thuộc chi Nervilia được Roptrostemom phát hiện vào năm 1828. Sở dĩ cây này có tên là Nervilia do chữ Nerve nói về những đường gân trên lá. Giáo sư Phạm Hoàng Hộ đặt tên là Trân Châu và Trần Hợp gọi là Thanh Thiên Quỳ [8]. Bảng 1.1. Phân loại khoa học Chi lan Một lá (Nervilia fordii (Hance) Schlechter) Ngành Magnoliophyta Lớp Liliopsida Bộ Orchidales Họ Orchidaceae Chi Nervilia 1.1.2. Đặc điểm sinh học Theo tài liệu "Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” - của Đỗ Tất Lợi, lan Một lá còn có tên Thanh thiên quỳ hay Bầu thoọc (bầu nghĩa là lá, thoọc là một) hay Trân châu diệp. Lan Một lá thường mọc ở kẽ núi đá, nơi thấp và ẩm ướt, dưới bóng cây to hoặc dưới đám cỏ dày đặc. Hầu như không thấy mọc ở bờ ruộng hay ở những môi trường khác. Lan Một lá là loại cây địa sinh, sống lâu, cao từ 10 - 20cm. Thân rất ngắn, củ tròn to, có thể nặng tới 1,5 - 20g. Thẳng từ củ, chỉ mọc lên có một lá riêng lẻ sau khi hoa tàn. Lá hình tim Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
tròn, xếp theo các gân lá hình chân vịt, đường kính 10 - 25cm mép uốn lượn. Gân lá toả đều từ cuống lá, cuống lá dài 10 - 20cm, màu tím hồng. Cụm hoa có cán dài 20 - 30cm, hoa thưa 15- 20 cái, mọc thành chùm hay bông màu trắng, đốm tím hồng hay màu vàng hơi xanh lục. Lá đài và cánh hoa giống nhau. Cánh môi 3 thuỳ, có rất nhiều gân, có lông ở quãng giữa, thuỳ bên và thuỳ tận cùng hình ba cạnh, cột dài 6mm, phồng ở đỉnh. Ra hoa tháng 3 - 4 - 5, quả nang vào các tháng 4 - 5 - 6. Khi hoa nở, đầu cánh hoa phía trên chụm lại làm toàn hoa giống như chiếc đèn lồng. Quả hình thoi, trên có múi trông giống như quả khế con, dài 2 - 3cm. Thường sau khi hoa tàn rồi lá mới phát triển do đó hoặc ta chỉ thấy cây mang hoa, hoặc quả, không có lá, hoặc chỉ thấy cây có lá, thường một lá [8]. Hình 1.1. Cây lan Một lá (Nervilia fordii) thu thập ở Hòa An - Cao Bằng và Định Hóa - Thái Nguyên. 1.1.3. Phân bố Lan Một lá được tìm thấy tại các vùng châu Phi, châu Úc và Châu Á, Trung và Đông Nam Á. Ở Việt Nam, lan Một lá phân bố ở các tỉnh Hà Giang, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Lai Châu, Sơn La, Hòa Bình, Lào Cai, Yên Bái, Tuyên Quang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Hà Tây, Thanh Hóa… Trước đây, cây lan Một lá ít được chú ý khai thác ở nước ta nhưng trong những năm gần đây, do loài cây này có giá trị lớn nên bị khai thác nhiều để bán qua biên giới cho Trung Quốc. Người Trung Quốc tìm mua cây lan Một lá với giá cao từ 1 - 2 triệu đồng/1 kg. Do lượng cây lan Một lá trong tự nhiên không nhiều cùng với tốc độ khai thác của người dân để bán và làm thuốc khiến cho loài cây này trở nên quý hiếm và có nguy cơ bị đe dọa tuyệt chủng. Cây lan Một lá được ghi vào danh sách các loài cây cần được bảo vệ trong “Sách đỏ Việt Nam”. 1.1.4. Thành phần hóa học của cây lan Một lá Hiện nay, ở nước ta chưa có các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của cây lan Một lá (Nervilia fordii). Tuy nhiên, trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của các hợp chất chiết xuất từ cây lan Một lá. Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy, lan Một lá (Nervilia fordii) chứa terpenoids, flavonoid, axit amin và một số loại dầu dễ bay hơi. Các hợp chất này có hoạt tính dược lý chống viêm, chống vi rút và giảm đau, giảm ho, hen suyễn và viêm phế quản mãn tính [19]. Năm 2012, Zhang Li và cộng sự tiến hành nghiên cứu về thành phần hóa học trên toàn bộ cây lan Một lá (Nervilia fordii). Kết quả, Zhang Li đã phân lập được 10 chất và xác định được đó là các chất như: rhamnetin, rhamnazin, rhamnocitrin, rhamnazin-3O-β-D-glucoside, rhamnocitrin-4'- D-glucoside, rhamnocitrin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1-4)-β-Dglucopyranoside, oblanatuoside, stigmastero, stigmasterol-3 -D-glucoside và cerevistero [23]. Trong một công trình nghiên cứu khác Zhang Li và cộng sự còn phát hiện ra ba loại flavonol glycoside mới được phân lập từ cây lan Một lá (Nervilia fordii) là rhamnazin 3-O-β-d- xylopyranosyl-(1→4)-β-d-glucopyranoside,rhamnazin3-O-d-glucopyranosyl- Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
(1→4) d-glucopyranoside và rhamnazin 3-O-β-d-xylopyranosyl- (1 → 4) -β-d- glucopyranoside-4′-O-d-glucopyranoside [25]. Hiện nay, các nhà nghiên cứu tập trung nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính ức chế khối u của các chất chiết xuất từ cây lan Một lá (Nervilia fordii). Kết quả sàng lọc hoạt tính chống ung thư trong ống nghiệm chỉ ra rằng dịch chiết từ cây lan Một lá có tác động ức chế đáng kể đối với sự phát triển của tế bào ung thư. Các cấu trúc hóa học đã được làm sáng tỏ trên cơ sở các tính chất hóa lý và dữ liệu quang phổ và được xác định là cycloeucalenol; stigmaterol; sitosterol; axit ursolic; aurantiamide; (20S, 22E, 24R)-ergosta-7,22-dien-3β, 5α, 6β-triol; 6 methoxy-cerevisterol; và-daucosterol [13]. 1.1.5. Công dụng của cây lan Một lá Ở Việt Nam, chưa có các công trình nghiên cứu về cây lan Một lá cũng như thành phần hoá học có trong thân lá và củ của loài này. Tuy nhiên, từ lâu cây lan Một lá đã được sử dụng như một loài dược liệu quý, có giá trị kinh tế. Về tính vị và tác dụng: Cây lan Một lá có vị ngọt nhạt, hơi đắng, tính bình, có tác dụng thanh nhiệt, nhuận phế, giảm ho, làm dịu cơn đau, tán ứ. Ở nước ta, đồng bào dân tộc ở miền núi thường sử dụng lá của cây làm thuốc giải độc, nhất là ngộ độc nấm. Người ta dùng 2 - 3 lá phơi khô thái nhỏ, hãm với nước sôi trong ít phút rồi chiết nước uống 2 lần/ngày. Cây lan Một lá cũng được dùng làm thuốc bồi dưỡng cơ thể, làm thuốc bổ phổi và mát phổi, chữa lao phổi, ho lâu ngày. Liều dùng thông thường là dùng 10 - 20 lá dưới dạng thuốc sắc, thuốc hãm, hấp đường hoặc chế biến thành cao lỏng để uống hàng ngày. Ngoài ra, loài cây này còn dùng để chữa các bệnh như mụn nhọt, lở, ngứa bằng cách lấy lá tươi giã nát, đắp lên các chỗ đau nhức hoặc đắp lên mụn, nhọt hoặc các vết lở [2],[8]. Ở Trung Quốc, người ta dùng toàn bộ cây để trị các bệnh: ho, lao phổi, viêm phế quản, viêm miệng, viêm họng cấp tính, tạng lao; trẻ em hấp thụ kém và nuôi dưỡng kém; rối loạn kinh nguyệt; đòn ngã tổn thương, viêm mủ da. Liều Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
dùng 10 - 15 gam dạng thuốc hoặc ngâm rượu. Dùng ngoài bằng cách giã củ tươi vừa đủ đắp vào chỗ đau [8]. Một số bài thuốc dùng cây lan Một lá như: - Viêm miệng, viêm họng cấp tính: cây tươi một lá dùng nhai. - Tạng lao: lan Một lá 15 gam nấu với thịt lợn làm canh ăn. - Trẻ em hấp thụ kém và nuôi dưỡng kém: Củ lan Một lá 5 - 10 gam nấu với thịt lợn nạc hoặc trứng gia cầm và ăn như thức ăn. 1.2. Mã vạch DNA (DNA barcode) Có nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau trong phân loại và xác định loài sinh vật. Khi tiến hành phân loại hay giám định sinh vật theo phương pháp truyền thống thì chủ yếu là dựa trên các chỉ thị về hình thái hoặc các đặc tính sinh lý sinh hóa bên trong nhờ vào bảng hướng dẫn định danh có sẵn. Phân loại theo phương pháp truyền thống trong nhiều trường hợp còn gặp phải khó khăn và hạn chế như: có nhiều sinh vật mang những đặc điểm hình thái rất giống nhau nhưng thực tế lại rất khác nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất khác nhau); ngược lại nhiều sinh vật có hình thái rất khác nhau nhưng lại rất gần nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất giống nhau). Một hạn chế khác của phương pháp phân loại truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái đó là rất khó phân biệt được sự khác biệt giữa các biến dị dưới loài. Đặc biệt, đối với những mẫu vật có nguồn gốc sinh vật đã bị biến đổi về hình thái, như: những mẫu sinh vật đã chết, bị chôn vùi dưới đất hoặc đã qua chế biến thì không thể xác định được bằng chỉ thị hình thái. Gần đây nhờ vào sự phát triển của khoa học công nghệ nói chung và các kỹ thuật sinh học phân tử nói riêng đã cho phép chúng ta nhanh chóng xác định được sự khác biệt về vật chất di truyền giữa các loài sinh vật, thậm chí giữa các cá thể sinh vật trong cùng loài. Từ đó có thể định danh được sinh vật và xác định được mối quan hệ di truyền giữa các cá thể, quần thể hay xuất xứ. Như vậy, việc kết hợp giữa chỉ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
thị hình thái và chỉ thị phân tử DNA sẽ nhanh chóng xác định được sự khác biệt giữ sinh vật này với sinh vật khác một cách chính xác. Vì vậy, các kỹ thuật sinh học phân tử được xem là công cụ hỗ trợ có hiệu quả cho việc phân tích di truyền ở các loài sinh vật. Trong đó, mã vạch DNA được xem như là một công cụ để giám định sinh vật và xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài. Gần đây, việc sử dụng các DNA mã vạch (DNA barcode) để định danh loài đang được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu và có những đóng góp đáng kể trong việc phân loại loài. Để nhận dạng gen hay đánh giá mức độ tiến hoá loài thì các nhóm gen chính thường được sử dụng là gen ribosome rRNA, gen ty thể, và gen lục lạp (thực vật) trong đó gen rRNA 18S, 5S và 16S hay được dùng để đánh giá mối quan hệ tiến hoá giữa các sinh vật. So với chỉ thị hình thái và chỉ thị hoá học, chỉ thị DNA cho độ chính xác cao hơn mà không lệ thuộc vào bất cứ yếu tố khách quan nào. Năm 2003, Paul Hebert đưa ra khái niệm mã vạch DNA (DNA barcode), nhằm giúp nhận diện các mẫu vật. Mã vạch DNA sử dụng một trình tự DNA ngắn nằm trong hệ gen của sinh vật như một chuỗi kí tự duy nhất giúp phân biệt hai loài sinh vật với nhau [17]. Xác định loài bằng mã vạch DNA sẽ cho mức độ chính xác cao và đặc biệt hữu dụng với các loài gần gũi và những quan sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ cơ sở để nhận dạng hoặc phân biệt loài [9]. Taberlet và cs (2007) cho rằng, hệ thống mã vạch DNA lý tưởng phải đáp ứng các yêu cầu là: (i) Đoạn DNA chỉ thị phải đủ độ biến thiên để phân biệt giữa các loài nhưng cũng phải không khác nhau quá mức giữa các cá thể trong cùng loài; (ii) Hệ thống định danh bằng DNA phải được chuẩn hóa, với cùng một vùng DNA có thể được sử dụng cho các nhóm phân loại khác nhau; (iii) Đoạn DNA chỉ thị cần chứa đủ thông tin phát sinh loài để có thể dễ dàng định danh loài vào các nhóm phân loại; (iv) Có khả năng áp dụng với các mẫu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
vật thô, với vị trí cặp mồi nhân gen có độ bảo thủ cao, dễ dàng thực hiện phản ứng khuếch đại và đọc trình tự DNA [21]. 1.3. Sử dụng mã vạch DNA trong nhận biết cây dược liệu Đối với các loài thực vật dùng làm thuốc luôn cần được xác định ở cấp độ loài, xác định chính xác loài đóng vai trò quan trọng để đảm bảo về chất lượng sản phẩm. Hiện nay với sự phát triển của thị trường thảo dược vấn đề giả mạo các nguyên liệu thảo dược càng trở nên phổ biến. Các nguyên liệu thảo dược bị thay thế bằng các loại thảo dược khác có quan hệ họ hàng gần gũi mang những đặc điểm hình thái tương tự do vậy rất khó có thể phân biệt bằng mắt thường. Việc nhận biết các nguyên liệu thảo dược bằng phương pháp mã vạch DNA sẽ mang lại kết quả chính xác và giúp bảo vệ người tiêu dùng trước nguy cơ sử dụng phải các dược liệu giả mạo. Một số trình tự, vùng gen thường được nghiên cứu và sử dụng phổ biến trong phân loại thực vật nói chung và nhận biết cây dược liệu nói riêng như trình tự vùng gen ITS thuộc hệ gen nhân, trình tự gen matK, rbcL, rpoB, rpoC1, trnH – psbA,… thuộc hệ gen lục lạp,... 1.3.1. Đặc điểm vùng ITS Vùng gen ITS (internal transcribed spacer) là một đoạn DNA nằm giữa các gen mã hóa RNA cấu trúc của ribosome. Vùng gen ITS bao gồm 2 vùng riêng biệt là ITS1 và ITS2 và được nối với nhau qua locus 5.8S. Vùng 5.8S khá bảo thủ do đó vùng gen này có thể được sử dụng để nghiên cứu phát sinh loài và nhận diện loài [18]. Các vùng ITS có độ dài 600 đến 700 bp là các vùng tiến hóa nhanh nên có thể thay đổi về trình tự cũng như độ dài. Các vùng bên cạnh ITS lại rất bảo thủ nên được sử dụng để thiết kế các mồi chung cho nhân bản vùng ITS. Số bản sao các đoạn lặp lại của DNA mã hóa ribosome lên tới 30 000 trong một tế bào. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Điều này làm cho ITS trở thành đối tượng lý thú cho nghiên cứu tiến hóa, phát sinh loài [17] và đa dạng di truyền [12]. 1.3.2. Đặc điểm gen matK Gen matK mã hóa cho maturaseK được phát hiện lần đầu tiên trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum). Gen matK là một trong những gen tiến hoá nhanh nhất, có kích thước khoảng 1500 bp, nằm trong hệ gen lục lạp. MaturaseK liên quan đến quá trình loại bỏ các intron loại 2 trong quá trình phiên mã RNA. Do matK tiến hoá nhanh và có mặt hầu hết trong thực vật nên đã được sử dụng như một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh loài ở thực vật. Hiệp hội mã vạch CBOL (Consortium for the Barcode of Life) đã thử nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và thấy rằng 90% mẫu thực vật hạt kín dễ dàng khuếch đại trình tự bằng cách sử dụng một cặp mồi đơn và đề nghị sử dụng matK là một trong những locus barcode chuẩn cho thực vật [22], [23]. Sử dụng trình tự gen matK đã đạt được một số thành công trong việc xác định các loại thuốc thảo dược "Dahuang" có nguồn gốc từ Rheum palmatum L (Polygonaceae), R. tanguticum (Maxim. ex Regel) Maxim. ex Balf, R. officinale Baill., và loài gần gũi Rheum L. với mức độ biến đổi nội bộ loài và giữa các loài khác nhau là cao. Vì vậy, nó thường được sử dụng để xác định các nguyên liệu thảo dược ở những vị trí địa lý khác nhau [12], [15]. Từ các kết quả phân tích trình tự gen matK trên Genbank cho thấy gen này có tính đa dạng rất cao [11]. Gen matK được dùng để phân biệt loài và nhận diện loài một cách dễ dàng vì gen matK khác nhau giữa các loài nhưng lại gần như trùng khớp trong cùng một loài. Gen matK giúp chúng ta có thể dễ dàng phân biệt những loài có hình thái giống nhau mà bằng phương pháp phân loại truyền thống khó có thể phân biệt được. 1.4. Tình hình nghiên cứu về gen matK, ITS của Việt Nam và trên thê giới Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Ở Việt Nam, đến nay đã có một số công trình nghiên cứu về mã vạch DNA như: Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Phong (2015) đã nhân bản thành công đoạn gen matK từ nguồn DNA tổng số của loài Trà hoa vàng bằng kỹ thuật PCR. Đã xác định được trình tự nucleotit của đoạn gen matK của các mẫu nghiên cứu, sản phẩm PCR có kích thước 951 bp, kết quả so sánh cho thấy không có sự khác biệt về trình tự nucleotit của đoạn gen matK ở các lần lặp lại và các mẫu trong cùng một loài. Trình tự đoạn gen matK phân lập được có thể là một trong các chỉ thị dùng để phân loại các loài trà hoa vàng của Việt Nam [6]. Để hỗ trợ cho việc định danh loài Bảy lá một hoa Việt Nam - Paris vietnamensis phục vụ nghiên cứu chọn tạo giống và nhân trồng nhóm các tác giả nghiên cứu đã tiến hành phân tích mã vạch DNA dựa trên hai vùng gen là ITS và psbA-trnH. Kết quả phân tích các mã vạch DNA cho thấy vùng gen ITS có thể sử dụng để phân biệt cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam với các loài thuộc chi Paris với độ tin cậy cao (giá trị bootstrap là 100) [4]. Nguyễn Như Hoa (2017) đã tiến hành phân tích trình tự vùng ITS của loài Lan hoàng thảo thủy tiên nhằm phân biệt, nhận diện nhanh, chính xác, chỉ ra mối quan hệ họ hàng giữa các loài trong nhóm Thủy tiên và tạo tiền đề cho việc xác định DNA barcode cho nhóm lan Hoàng Thảo. Trình tự vùng ITS của 15 mẫu thuộc 5 loài Hoàng thảo Thủy Tiên đã được xác định có kích thước từ 674-702bp. Kết quả nghiên cứu còn cho thấy việc sử dụng trình tự vùng ITS có thể giúp phân tách rõ ràng các loài trong nhóm Hoàng Thảo Thủy Tiên [5]. Lê Đình Chắc , Nguyễn Thị Hiền (2017) đã tiến hành phân tích trình tự vùng ITS của 4 mẫu Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được thu tại Khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên và Pù Luông, Thanh Hóa nhằm cung cấp một quy trình hiệu quả cho việc xác định trình tự gen ITS loài Lan kim tuyến và có thể áp dụng cho những loài cùng chi. Kết quả, trình tự DNA vùng ITS đã được xác định thành công, kích thước thu được là 643 nucleotit. So sánh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn