Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh tổng hợp Bacteriocin

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:117

Thêm vào BST

Báo xấu

54
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn trình bày các nội dung chính sau: Khảo sát khả năng đối kháng với vi sinh vật chỉ thị của các chủng vi khuẩn biển phân lập được; Xác định phổ kháng khuẩn và bản chất của hợp chất kháng khuẩn; Tuyển chọn và định danh bằng gene 16s rRNA của một số chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin; Nghiên cứu độ bền nhiệt của hợp chất kháng khuẩn và khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh chất kháng khuẩn của ít nhất 01 chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh tổng hợp Bacteriocin

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Lê Trọng Bằng NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN BIỂN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2021
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Lê Trọng Bằng NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CÁC CHỦNG VI KHUẨN BIỂN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Huỳnh Hoàng Như Khánh Hà Nội – 2021
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Huỳnh Hoàng Như Khánh và tham khảo thêm các tài liệu đã được công bố trước đó có nguồn gốc rõ ràng. Kết quả nghiên cứu này được thực hiện bởi sự tài trợ kinh phí từ đề tài “Nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi sinh vật biển có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin nhằm ứng dụng trong nuôi trồng thủy hải sản”, mã số: VAST 02.05/20-21. Các số liệu nêu trong luận văn là kết quả làm việc của tôi trong suốt quá trình thực nghiệm tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2021 Tác giả luận văn Lê Trọng Bằng
LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Huỳnh Hoàng Như Khánh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Châu Minh Khánh - Phòng Công nghệ sinh học biển - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, người đã giúp tôi hoàn thành tốt phần thực nghiệm của mình, tôi xin chân thành cám ơn TS. Huỳnh Hoàng Như Khánh – Chủ nhiệm đề tài VAST 02.05/20-21 đã cho phép tôi sử dụng nội dung công trình nghiên cứu này vào mục đích nghiên cứu, viết và bảo vệ luận văn thạc sĩ. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đào Tấn Học và ThS. Lê Thị Thu Thảo, Viện Hải dương học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam đã hỗ trợ định danh đối với các mẫu tôm và cá biển sử dụng làm nguồn phân lập vi sinh vật biển trong luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ, Phòng Đào tạo, Khoa Công nghệ Sinh học và Quý Thầy Cô giáo đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn cũng như hoàn thành mọi thủ tục cần thiết. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang cũng như các anh, chị trong phòng Công nghệ sinh học biển đã giúp đỡ và tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến lãnh đạo trường THPT Nguyễn Chí Thanh, Sở Giáo dục và Đạo tạo Khánh Hòa luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2021 Tác giả luận văn Lê Trọng Bằng
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Thông tin đầy đủ Acute HepatoPancreatic Necrosis Disease AHPND (Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính) Vi khuẩn biển biểu hiện hoạt tính đối kháng với Bac+ Vibrio spp. Bacteriocin-like inhitory subtance BLIS (Hợp chất có đặc điểm giống bacteriocin) Gross Domestic Product GDP (Tổng sản phẩm quốc nội) Lab-Prepared Marine Agar LPMA (Môi trường thạch biển được chuẩn bị trong phòng thí nghiệm) NTTS Nuôi trồng thủy sản Polymerase Chain Reaction PCR (Phản ứng khuếch đại gen) PTN Phòng thí nghiệm rRNA Ribosome Ribonucleic Acid TCBS Thiosulphate Citrate Bile Salts Sucrose Agar TSA Tryptic Soy Agar TSB Tryptic Soy Broth VK Vi khuẩn VKB Vi khuẩn biển VSV Vi sinh vật VSVCT Vi sinh vật chỉ thị
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Sự khác nhau giữa vi khuẩn Gram dương và Gram âm ................. 10 Bảng 1.2. Một số vi khuẩn gây bệnh cho thủy, hải sản .................................. 13 Bảng 1.3. Tác động về kinh tế – xã hội và tác động khác của bệnh liên quan đến Vibrio trong ngành nuôi trồng thủy sản ................................................... 15 Bảng 1.4. Một số bacteriocin ở vi khuẩn Gram âm ........................................ 19 Bảng 1.5. Một số bacteriocin ở vi khuẩn Gram dương ................................... 20 Bảng 1.6. Một số khác biệt giữa bacteriocin và kháng sinh ........................... 22 Bảng 1.7. Độ bền nhiệt, pH và enzyme thủy phân của một số bacteriocin sinh tổng hợp bởi vi khuẩn lactic .................................................................... 24 Bảng 1.8. Một số bacteriocin có nguồn gốc từ biển ....................................... 25 Bảng 2.1. Danh sách chủng chỉ thị sử dụng trong thí nghiệm sàng lọc hoạt tính ........................................................................................................... 36 Bảng 3.1. Thông tin về số lượng chủng VKB được phân lập tương ứng với từng mẫu và từng môi trường.......................................................................... 46 Bảng 3.2. Kết quả sàng lọc những chủng cho hoạt tính đối kháng Vibrio spp. ....................................................................................................... 47 Bảng 3.3. Tổng hợp về hình thái khuẩn lạc của 30 chủng biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp. ghi nhận trên môi trường thạch Mueller Hinton ... 51 Bảng 3.4. Kết quả xác định phổ kháng khuẩn của 30 chủng vi khuẩn biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp. xác định bằng phương pháp cấy dọc...... 54 Bảng 3.5. Tổng hợp khả năng kháng khuẩn của 30 chủng vi khuẩn biển biểu hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp. được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch ........................................................................................ 57 Bảng 3.6. Hoạt tính đối kháng V. parahaemolyticus của 15 chủng vi khuẩn biển sau khi ủ với proteinase E ................................................................................ 61 Bảng 3.7. Sự biến động mật độ tế bào và hoạt tính đối kháng với vi sinh vật chỉ thị của chủng Bacillus spp. 2002NTBD1 theo thời gian ................................ 68
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. So sánh sản lượng nuôi trồng thủy sản và đánh bắt cá trên toàn cầu trong giai đoạn từ 1950 – 2017 ....................................................................... 11 Hình 1.2. Số lượng các ấn phẩm khoa học trong 20 năm qua liên quan đến từ khóa “marine bacteria” và “antimicrobial activity” phân phối theo mười quốc gia hàng đầu .................................................................................................... 17 Hình 1.3. Cơ chế hoạt động của bacteriocin ................................................... 21 Hình 2.1. Quy trình phân lập vi khuẩn biển từ ruột tôm, ruột cá, bọt biển và rong .................................................................................................................. 39 Hình 2.2. Hình ảnh một số nguồn mẫu biển thu nhận cho phân lập vi khuẩn biển ................................................................................................... 40 Hình 2.3. Sơ đồ các nội dung nghiên cứu chính ............................................. 44 Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn biển được làm thuần .................. 45 Hình 3.2 Hoạt tính đối kháng của VKB đối với 3 chủng Vibrio spp. được xác định bằng phương pháp cấy dọc ............................................................... 50 Hình 3.3. Hình thái của một số đại diện bac+ trên môi trường Mueller Hinton agar .................................................................................................................. 53 Hình 3.4. Phổ kháng khuẩn của VKB đối với 7 chủng VSVCT được xác định bằng phương pháp cấy dọc.............................................................................. 56 Hình 3.5. Khả năng sinh chất kháng khuẩn trong canh trường bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch ............................................................................... 59 Hình 3.6. Ảnh hưởng của enzyme lên hoạt tính kháng Vibrio spp. của dịch lên men chủng 2002NTBD1 ........................................................................... 62 Hình 3.7. Cây phân loại thể hiện mối liên quan giữa 4 chủng có hoạt tính mạnh và loài có trình tự gen 16S rRNA tương đồng ................................................ 63 Hình 3.8. Khảo sát độ bền nhiệt của hợp chất kháng Vibrio spp. sinh bởi 4 chủng vi khuẩn biển ..................................................................................... 67 Hình 3.9. Hoạt tính đối kháng với vi sinh vật chỉ thị của dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus spp. 2002NTBD1 các thời điểm sinh trưởng khác nhau .................. 69
1 MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỤC LỤC ........................................................................................................ 1 MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 8 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN ............................................................ 8 1.1.1. Đặc điểm vi khuẩn ........................................................................ 8 1.1.2. Tác động của vi khuẩn ................................................................ 10 1.1.3. Vi khuẩn gây bệnh cho thủy, hải sản .......................................... 11 1.1.4. Vi khuẩn biển – nguồn cung cấp các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học ................................................................................................... 16 1.2. TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN................................................... 17 1.2.1. Định nghĩa về bacteriocin ........................................................... 17 1.2.2. Phân loại bacteriocin ................................................................... 18 1.2.3. Cơ chế hoạt động của bacteriocin ............................................... 20 1.2.4. Điểm khác biệt giữa kháng sinh và bacteriocin .......................... 22 1.2.5. Đặc tính của bacteriocin ............................................................. 23 1.2.6. Một số bacteriocin có nguồn gốc từ biển.................................... 25 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BACTERIOCIN TỪ CÁC CHỦNG VI KHUẨN ................................................................................................. 27
2 1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới ....................................................... 27 1.3.2. Các nghiên cứu trong nước ......................................................... 29 1.4. TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA BACTERIOCIN .......................... 30 1.4.1. Ứng dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm ...................... 30 1.4.2. Ứng dụng bacteriocin trong bảo vệ sức khỏe con người và động vật trên cạn ..................................................................................... 31 1.4.3. Ứng dụng bacteriocin trong nuôi trồng thủy sản ........................ 31 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .. 33 2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .................................... 33 2.2. NGUYÊN LIỆU.................................................................................. 33 2.2.1. Vật liệu thí nghiệm ...................................................................... 33 2.2.2. Môi trường nuôi cấy ................................................................... 33 2.2.3. Chủng vi sinh vật chỉ thị ............................................................. 36 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................... 37 2.3.1. Phương pháp thu mẫu và phân lập vi khuẩn biển ....................... 37 2.3.2. Phương pháp khảo sát khả năng đối kháng với Vibrio spp. của các chủng vi khuẩn biển phân lập được ........................................................ 40 2.3.3. Xác định phổ kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn biển được tuyển chọn ............................................................................................... 41 2.3.4. Xác định khả năng sinh chất kháng khuẩn trong môi trường lỏng .. 41 2.3.5. Xác định bản chất hợp chất kháng khuẩn ................................... 42 2.3.6. Phân tích trình tự nucleotide của gen mã hóa 16S rRNA ........... 42 2.3.7. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của hợp chất kháng khuẩn ............................................................................................ 43 2.3.8. Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng sinh chất kháng khuẩn của vi khuẩn biển .................................................................................... 43
3 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................. 45 3.1. PHÂN LẬP VI KHUẨN BIỂN .......................................................... 45 3.2. TUYỂN CHỌN CHỦNG BIỂU HIỆN HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG VỚI VIBRIO SPP. ....................................................................................... 47 3.3. PHỔ KHÁNG KHUẨN VI KHUẨN TRÊN MÔI TRƯỜNG THẠCH DINH DƯỠNG ........................................................................................... 53 3.4. XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH CHẤT KHÁNG KHUẨN TRONG DỊCH MÔI TRƯỜNG LỎNG .................................................................... 57 3.5. XÁC ĐỊNH BẢN CHẤT CỦA HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN ...... 60 3.6. PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CỦA GEN MÃ HÓA 16S RRNA .......................................................................................................... 63 3.7. ĐỘ BỀN NHIỆT CỦA CÁC HỢP CHẤT KHÁNG VIBRIO SPP. ... 66 3.8. ẢNH HƯỞNG THỜI GIAN LÊN MEN ĐẾN KHẢ NĂNG SINH CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN BIỂN .................................. 67 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................. 70 4.1. KẾT LUẬN ......................................................................................... 70 4.2. KIẾN NGHỊ ........................................................................................ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 71 PHỤ LỤC
4 MỞ ĐẦU 1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Thủy sản là ngành quan trọng của Việt Nam, đóng góp vào nền kinh tế khoảng 3 – 4 % tổng GDP hằng năm, đem lại công ăn việc làm cho hàng triệu lao động và là nguồn cung cấp thực phẩm quan trọng cho tiêu dùng [1]. Tuy nhiên, ngành này đang bị đe dọa bởi tình trạng dịch bệnh ngày càng tăng, chủ yếu do các tác nhân là vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn thuộc chi Vibrio. Vi khuẩn Vibrio gây ra nhiều bệnh nghiêm trọng trên động vật thủy sản, chẳng hạn như chủng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh “hoại tử gan tụy cấp” (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease – AHPND) với tỷ lệ chết lên đến 100 % trên tôm hoặc chủng Vibrio harveyi, Vibrio vulnificus là tác nhân gây nhiều bệnh nghiêm trọng trên nhuyễn thể, cá, cũng như nhiều loài động vật thủy hải sản khác [2, 3]. Theo nghiên cứu của Trần Thị Hồng Tơ và cộng sự [4], vi khuẩn V. parahaemolyticus được phát hiện trong 86,2 % sản phẩm thủy hải sản và 78,1 % mẫu nước nuôi thủy sản được thu thập khắp vùng sông Mê Kông – nơi tập trung phần lớn diện tích nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam. Có thể nói, nguy cơ bùng phát trên diện rộng dịch bệnh do Vibrio có thể xảy ra bất cứ lúc nào. Do đó, việc cần thiết có một biện pháp phòng chống Vibrio hữu hiệu nên được ưu tiên, nhằm phát triển ngành nuôi trồng thủy sản bền vững ở Việt Nam. Trước đây, kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng và điều trị các bệnh ở thủy sản, đặc biệt là bệnh gây ra bởi Vibrio spp. Tuy nhiên, việc lạm dụng kháng sinh trong thời gian dài đã đem lại nhiều hệ lụy khó khắc phục, như: i) tồn dư kháng sinh trong các sản phẩm thủy sản ảnh hưởng lớn đến sức khỏe người tiêu dùng và giảm giá trị xuất khẩu; ii) phát sinh các dòng vi khuẩn Vibrio spp. kháng kháng sinh; iii) gây ô nhiễm vùng nuôi do kháng sinh tiêu diệt các hệ vi sinh vật có lợi trong ao nuôi, dẫn đến thất bại triền miên trong nuôi trồng thủy sản [5, 6]. Trên thực tế, các dòng Vibrio kháng thuốc đã được phát hiện và ảnh hưởng nghiêm trọng đến nhiều khu vực sản xuất ở Việt Nam, như Sóc Trăng, Bạc Liêu và Trà Vinh, gây tổn thất to lớn cho ngành công nghiệp nuôi tôm trong nước. Nguyễn Diễm Thư và cộng sự [7] đã công bố tỷ lệ 12,37 % mẫu tôm, nước nuôi và bùn đáy ao thu ở khu vực sông Mê Kông
5 mang Vibrio có gen gây bệnh “hoại tử gan tụy”, trong đó 80,85 % và 78,72 % chủng kháng lại lần lượt 2 kháng sinh là Doxycycline và Enrofloxacin. Đây là con số đáng báo động, là hệ lụy từ việc sử dụng kháng sinh tràn lan trong nuôi trồng thủy hải sản ở khu vực này trong thời gian dài. Cùng với xu hướng nuôi tôm “sạch”, kháng sinh đang dần bị hạn chế sử dụng trong nuôi trồng thủy sản, thay thế bằng việc sử dụng các chế phẩm vi sinh trong xử lý môi trường nước nuôi thủy sản, một trong những chế phẩm đang được quan tâm hiện nay đó là bacteriocin – peptide có phổ kháng khuẩn hẹp, do đó tiêu diệt vi khuẩn mục tiêu một cách hiệu quả, ít ảnh hưởng đến các vi khuẩn có lợi khác và không gây độc cho động vật. Phương thức này đang gặt hái nhiều ưu điểm, tuy nhiên đa phần các chế phẩm tích hợp các vi sinh vật có nguồn gốc trên cạn. Do đó, hoạt động vẫn chưa tối ưu trong môi trường đặc trưng nuôi tôm nước mặn. Một vài nghiên cứu trong nước cũng đã công bố tiềm năng sử dụng vi khuẩn để kiểm soát các bệnh do vi khuẩn Vibrio spp. gây ra, tuy nhiên số lượng nghiên cứu còn rất hạn chế. Nhìn chung, đa số các vi khuẩn được công bố thuộc chi Bacillus và nhóm xạ khuẩn (Actinobacteria). Theo đó, 2 chủng B. subtilis HY1 và Lactococcus lactis CC4K đã được nhóm tác giả thuộc Viện Công nghệ Sinh học công bố có hoạt tính đối kháng với Vibrio trong nước nuôi tôm [8]. Tuy nhiên, hợp chất kháng khuẩn không có bản chất protein, mà là các acid hữu cơ. Các chất acid hữu cơ kháng khuẩn khó áp dụng thực tế, do tác động diệt khuẩn sẽ giảm hoặc mất đi khi pha loãng trong nước nuôi hoặc trong pH kiềm tính của nước nuôi. Nguyễn Thị Bích Đào và cộng sự [9] đã phân lập được các chủng Bacillus subtilis B1, Bacillus subtilis B2, Bacillus amyloliquefaciens B4 từ mẫu nước và bùn đáy ao nuôi ở tỉnh Thừa Thiên Huế. Nguyễn Xuân Cảnh và cộng sự [10] đã thu nhận 2 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng Vibrio. Một nghiên cứu khác đã công bố Vibrio trong ao nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) bị ức chế khi bổ sung vi khuẩn B. subtilis và xạ khuẩn Streptomyces parvulus vào mẫu nước nuôi [11]. Có thể thấy hầu hết các công bố chỉ dừng lại ở việc tìm kiếm và sử dụng trực tiếp các chủng vi sinh vật có khả năng kháng Vibrio nhằm kiểm soát các bệnh do vi khuẩn Vibrio spp. gây ra hoặc tìm kiếm các hợp chất có khả năng
6 kháng Vibrio phân lập từ nguồn vi sinh vật trên cạn và ứng dụng trong lĩnh vực nuôi trồng thủy hải sản. Do đó, các chế phẩm có hiệu quả diệt khuẩn không cao, chưa được tối ưu trong môi trường nuôi nước mặn. Vì vậy “Nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin” là cách tiếp cận hiệu quả, có ý nghĩa khoa học lẫn thực tiễn nhằm đánh giá tiềm năng và ứng dụng các hợp chất có hoạt tính từ vi sinh vật (VSV) biển trong môi trường nuôi trồng thủy hải sản. 2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI Sàng lọc và tuyển chọn được các chủng vi khuẩn biển (VKB) có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin đối kháng với VSV gây bệnh trên các đối tượng thủy hải sản (chủ yếu đối kháng với Vibrio). 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Phạm vi nghiên cứu: khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh trên thủy, hải sản của các chủng vi khuẩn biển thu được. 4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn từ VSV biển nhằm ứng dụng trong lĩnh vực nuôi trồng thủy hải sản là cách tiếp cận mới, có ý nghĩa khoa học. Thành công của đề tài sẽ định hướng khả năng sử dụng VSV biển trong nghiên cứu thu nhận hợp chất có hoạt tính sinh học, góp phần giảm thiểu lượng thuốc kháng sinh sử dụng trong nuôi trồng thủy hải sản, nâng cao chất lượng sản phẩm. Chế phẩm sinh học có lợi thế thân thiện môi trường, giảm thiểu ô nhiễm môi trường và góp phần phát triển bền vững. 5. CÁC NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHÍNH Thu nhận mẫu sinh vật biển (tôm, cá, rong biển, bọt biển …) và phân lập vi khuẩn biển.
7 Khảo sát khả năng đối kháng với vi sinh vật chỉ thị của các chủng vi khuẩn biển phân lập được. Xác định phổ kháng khuẩn và bản chất của hợp chất kháng khuẩn. Tuyển chọn và định danh bằng gene 16s rRNA của một số chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Nghiên cứu độ bền nhiệt của hợp chất kháng khuẩn và khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh chất kháng khuẩn của ít nhất 01 chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin.
8 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN 1.1.1. Đặc điểm vi khuẩn Vi khuẩn là nhóm vi sinh vật có cấu tạo tế bào nhưng chưa có cấu trúc nhân hoàn chỉnh, vi khuẩn có các đặc điểm đặc trưng: kích thước nhỏ bé, hấp thụ nhiều và chuyển hóa nhanh, sinh trưởng nhanh và phát triển mạnh, thích ứng mạnh, dễ phát sinh biến dị, nhiều chủng loại và phân bố rộng [12]. Vi khuẩn có kích thước rất nhỏ, thay đổi tùy từng loài, đường kính từ 0,2 – 2,0 µm, chiều dài từ 2 – 10 µm, một số vi khuẩn có kích thước dài đến vài chục micromet. Vi khuẩn có hình thái riêng, đặc tính sinh vật riêng, chúng có khả năng gây bệnh cho người, động vật và thực vật, một số có khả năng tiết chất kháng khuẩn. Phương thức dinh dưỡng đa dạng, đa số vi khuẩn sống hoại sinh trong tự nhiên [13]. Mỗi loại vi khuẩn có hình dạng và kích thước nhất định. Các hình dạng và kích thước này là do vách tế bào của vi khuẩn quyết định. Hình thái là một tiêu chuẩn rất quan trọng để xác định vi khuẩn [12]. Về hình thái, có thể chia vi khuẩn thành 3 nhóm lớn sau: i) Cầu khuẩn (Cocci): Là những vi khuẩn có hình cầu, mặt cắt của chúng có thể là những hình tròn, nhưng cũng có thể là hình bầu dục hoặc ngọn nến. Đường kính trung bình khoảng 0,5 – 1 µm. Cầu khuẩn lại được chia làm nhiều loại như: đơn cầu khuẩn (Micrococcus), song cầu khuẩn (Diplococcus), tứ cầu khuẩn (Tetracoccus), tụ cầu khuẩn (Staphylococcus), liên cầu khuẩn (Streptococcus). ii) Trực khuẩn (Bacilli): Là những vi khuẩn hình que, đầu tròn hay vuông, kích thước vi khuẩn gây bệnh thường gặp là 0,5 – 1 x 2 – 5 µm. Các trực khuẩn không gây bệnh thường có kích thước lớn hơn [12]. Một số loại trực khuẩn thường gặp bao gồm: Trực khuẩn Gram dương, sống hiếu khí sinh nha bào: Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, v.v...; Trực khuẩn Gram âm, sống hiếu khí, không sinh nha bào, thường có tiên mao ở xung quanh thân vi khuẩn: Salmonella, Escherichia, Shigella, Proteus, v.v... iii) Xoắn khuẩn (Spirillum, Spirochete): Là những vi khuẩn có hình sợi lượn sóng và di động. Chiều dài của các vi khuẩn loại này có thể tới 30 µm. Trong loại này có 3 giống vi khuẩn gây bệnh quan trọng là Treponema, Leptospira và Borrelia [12].
9 Ngoài những vi khuẩn có hình dạng điển hình như trên còn có những loại vi khuẩn có hình thái trung gian: Trung gian giữa cầu khuẩn và trực khuẩn là cầu – trực khuẩn, như vi khuẩn dịch hạch (Yersinia pestis); Trung gian giữa trực khuẩn và xoắn khuẩn là phẩy khuẩn mà điển hình là phẩy khuẩn tả (Vibrio cholerae) [12]. Việc nghiên cứu đặc điểm hình thái của vi khuẩn được thực hiện thông qua sự hỗ trợ của các thiết bị chuyên dụng như kính hiển vi quang học, kính hiển vi điện tử. Mỗi loại vi khuẩn đều có cấu trúc tế bào và hình dạng khác nhau. Do đó để nhận diện được vi khuẩn phải thực hiện qua nhiều phương pháp, kỹ thuật. Một trong số đó là phương pháp nhuộm Gram [14]. Nhuộm Gram là kỹ thuật nhuộm sử dụng nhiều loại hóa chất để phân biệt 2 nhóm vi khuẩn là Gram dương (+) và Gram âm (–) dựa trên cấu tạo vách tế bào của vi khuẩn. Đây là phương pháp được phát minh bởi nhà khoa học có tên Hans Christian Gram từ năm 1884 và đến nay vẫn được ứng dụng phổ biến [15]. Đặc tính bắt màu của vi khuẩn trong phương pháp nhuộm Gram là do vách tế bào quyết định, từ đó dẫn đến sự khác nhau trong kết quả nhuộm, vi khuẩn Gram dương sẽ bắt màu từ xanh đến tím, vi khuẩn Gram âm sẽ bắt màu từ hồng đến đỏ [14]. Sự khác nhau giữa vi khuẩn Gram dương và Gram âm được tóm tắt trong Bảng 1.1.
10 Bảng 1.1. Sự khác nhau giữa vi khuẩn Gram dương và Gram âm [14] Vi khuẩn Gram dương Vi khuẩn Gram âm Cấu tạo bên ngoài có 2 lớp: Cấu tạo bên ngoài có 3 lớp: - Bên trong là màng nguyên sinh. - Bên trong là màng nguyên sinh. - Bên ngoài là lớp peptidoglycan - Lớp peptidoglycan mỏng (5 – 10 % dày (60 – 100 % peptidoglycan). peptidoglycan). - Bên ngoài là lớp lipopolysaccharide. Hàm lượng lipid thấp Hàm lượng lipid cao Không có nội độc tố Có nội độc tố Không có khoảng chu chất Có khoảng chu chất (periplasmic (periplasmic space) space) Không có kênh porin Có kênh porin Dễ bị tổn thương bởi sự tấn công của Chống lại sự tấn công của lysozyme lysozyme và penicillin và penicillin Lớp peptidoglycan có chứa acid Lớp peptidoglycan không chứa acid teichoic teichoic 1.1.2. Tác động của vi khuẩn Vi khuẩn tham gia tích cực vào việc khép kín vòng tuần hoàn các vật chất trong tự nhiên, làm sạch môi trường. Vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong chu trình carbon, nitơ… các chu trình vật chất có ý nghĩa quyết định cho sự sống của sinh vật trên trái đất. Tham gia chuyển hóa, phân hủy các chất khó tiêu trong đất thành các chất dễ tiêu cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng, một số loại vi khuẩn làm giàu dinh dưỡng bằng cách cố định nitơ cho đất. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm và dược phẩm: ứng dụng quá trình lên men để sản xuất thực phẩm, sản xuất men vi sinh, sản xuất vaccine, các loại thuốc, hormon, v.v... mang lại giá trị kinh tế cao. Vi khuẩn là đối tượng để
11 nghiên cứu về di truyền phân tử, hóa sinh học, vì chúng có số lượng gen ít, phát triển nhanh, kích thước nhỏ, nên dễ dàng cho sự nghiên cứu và thực nghiệm. Nhiều loại vi khuẩn gây bệnh cho người, động vật, thực vật... Vi khuẩn là căn nguyên của các bệnh nhiễm trùng, gây ô nhiễm môi trường, hủy hoại thức ăn và các sản phẩm sinh học cần bảo quản, là mối đe dọa tiềm tàng trong tương lai khi tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng tăng [12, 13]. 1.1.3. Vi khuẩn gây bệnh cho thủy, hải sản Dân số thế giới tính đến năm 2020 là 7,795 tỷ người [16]. Với quy mô dân số hiện tại và được dự báo có thể đạt đến 10,5 tỷ người vào năm 2050 thì an ninh lương thực, thực phẩm được xem như một vấn đề cấp bách trên toàn cầu [17]. Từ nhu cầu trên đã thúc đẩy sự phát triển của các ngành sản xuất thực phẩm. Nuôi trồng thủy sản đã có bước phát triển mạnh mẽ trong những thập kỷ qua và tiếp tục dẫn đầu trong việc sản xuất thực phẩm từ thủy sản tại châu Á và trên toàn cầu. Hơn 91 % sản lượng nuôi trồng thủy sản được sản xuất tại châu Á (102,9 triệu tấn trong năm 2017). Hình 1.1. So sánh sản lượng nuôi trồng thủy sản và đánh bắt cá trên toàn cầu trong giai đoạn từ 1950 – 2017 [18] Tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản toàn cầu đã vượt qua sản lượng đánh bắt cá toàn thế giới 18,32 triệu tấn (Hình 1.1), giá trị của ngành ước tính hơn 250 tỷ USD (tính đến năm 2017) [18]. Hơn 95 % sản lượng của ngành được
12 sản xuất tại các nước đang phát triển, tốc độ tăng trưởng sản lượng trung bình hằng năm đạt 6,13 %, giúp tạo ra hàng nghìn việc làm và góp phần tăng trưởng kinh tế ở những quốc gia này [18]. Tuy nhiên, cùng với việc tăng cường hoạt động nuôi trồng thủy sản, dịch bệnh bùng phát, đặc biệt là các bệnh nhiễm khuẩn, ngày càng trở thành một thách thức lớn đối với việc mở rộng sản xuất và ảnh hưởng đến sự phát triển kinh tế của một số quốc gia. Dịch bệnh đã làm nền kinh tế toàn cầu bị tổn thất hơn 9 tỷ USD mỗi năm (số liệu công bố năm 2010); gây thiệt hại cho Trung Quốc hơn 120 triệu USD trong giai đoạn từ 1990 – 1992 [19, 20]. Ước tính có khoảng 15 % thiệt hại do cá chết vì dịch bệnh trong các lồng lưới và ao nuôi trong tổng số 16.100 trang trại nuôi cá tại Brazil [21, 22]. Tại Việt Nam, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (hay còn gọi là Hội chứng tôm chết sớm) là bệnh nặng nhất hiện nay ảnh hưởng đến nuôi tôm nước lợ. Căn bệnh này gây ra thiệt hại lớn cho người nuôi tôm ở Đồng bằng sông Cửu Long, nơi có hơn 70 % sản lượng tôm của Việt Nam. Thiệt hại do hội chứng tôm chết sớm đã được ghi nhận ở khoảng 59.000 ha trang trại ở Đồng bằng sông Cửu Long khi bệnh mới xuất hiện vào năm 2011, đến năm 2017 bệnh đã lan ra 294 xã thuộc 86 huyện của 25 tỉnh trong cả nước [23]. Dịch bệnh gia tăng là một trong những hệ quả của việc tăng cường nuôi trồng thủy sản. Các yếu tố môi trường như chất lượng nước xấu, nhiệt độ không thích hợp, mật độ nuôi dày, quản lý chăm sóc kém, thức ăn và con giống không đảm bảo chất lượng làm cho động vật thủy sản bị giảm sức đề kháng, các tác nhân gây bệnh phát triển. Đồng thời, động vật thủy sản sống trong môi trường nước với mật độ nuôi cao làm cho bệnh có điều kiện lây lan nhanh chóng và gây thiệt hại lớn [24]. Một trong những nguyên nhân gây bệnh phổ biến cho thủy sản là vi khuẩn. Vi khuẩn gây bệnh ở động vật thủy sản đã phân lập được vài trăm loài thuộc 9 họ, vi khuẩn điển hình là nhóm vi khuẩn Aeromonas spp., Pseudomonas spp. gây bệnh ở động vật thủy sản nước ngọt và nhóm Vibrio spp. gây bệnh ở động vật thủy sản nước mặn [24]. Một số vi khuẩn gây bệnh cho thủy, hải sản được thống kê trong Bảng 1.2.
13 Bảng 1.2. Một số vi khuẩn gây bệnh cho thủy, hải sản [24, 25] Tên vi khuẩn Tên bệnh Đối tượng mắc bệnh Flexibacter columnaris Bệnh Columnaris ở cá Cá nước ngọt Flexibacter maritimus Bệnh Columnaris ở cá Cá nước mặn Flavobacterium branchiophila Bệnh thối mang ở cá Cá Myxococcus piscicolas Cytophaga spp. Thiothrix spp. Bệnh vi khuẩn dạng sợi Giáp xác mặn hay ngọt Leucothrix mucor Flavobacterium spp. Hafnia alvei Bệnh hoại tử nội tạng Cá da trơn Proteus rettgeri Bệnh xuất huyết Cá Bệnh xuất huyết đốm đỏ Aeromonas spp. ở cá, đốm nâu ở tôm Cá, tôm càng xanh Edwardsiella spp. Bệnh nhiễm trùng máu Cá Bênh đỏ thân và ăn mòn Vibrio alginolyticus vỏ kitin ở tôm, bệnh xuất Cá, tôm huyết ở cá biển Bênh đỏ thân và ăn mòn Vibrio anguillarum vỏ kitin ở tôm, bệnh xuất Cá, tôm huyết ở cá Vibrio Bệnh phát sáng, đỏ thân Tôm parahaemolyticus và ăn mòn vỏ kitin ở tôm Vibrio harveyi Bệnh phát sáng ở tôm Tôm Pasteurella piscinida Bệnh nhiễm khuẩn Cá biển Pseudomonas spp. Bệnh xuất huyết Cá