Luận văn Thạc sĩ Sinh học thí nghiệm: Phân tích đặc điểm phân tử của Canine parvovirus gây bệnh tiêu chảy cấp tính trên chó tại thành phố Hồ Chí Minh

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:78

Thêm vào BST

Báo xấu

22
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học thí nghiệm "Phân tích đặc điểm phân tử của Canine parvovirus gây bệnh tiêu chảy cấp tính trên chó tại thành phố Hồ Chí Minh" trình bày các nội dung chính sau: Chẩn đoán và nhận diện phân tử CPVs bằng phản ứng PCR; Phân tích đặc điểm phân tử của Canine parvovirus gây bệnh tiêu chảy cấp tính trên chó tại Thành phố Hồ Chí Minh.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học thí nghiệm: Phân tích đặc điểm phân tử của Canine parvovirus gây bệnh tiêu chảy cấp tính trên chó tại thành phố Hồ Chí Minh

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN THANH VIỆT Nguyễn Thanh Việt PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ CỦA CANINE SINH HỌC THỰC NGHIỆM PARVOVIRUS GÂY BỆNH TIÊU CHẢY CẤP TÍNH TRÊN CHÓ TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM NĂM 2021 Thành phố Hồ Chí Minh - 2021
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Thanh Việt PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ CỦA CANINE PARVOVIRUS GÂY BỆNH TIÊU CHẢY CẤP TÍNH TRÊN CHÓ TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Hướng dẫn 1: TS. Thân Văn Thái Hướng dẫn 2: TS. Nguyễn Hoàng Dũng Thành phố Hồ Chí Minh - 2021
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “Phân tích đặc điểm phân tử của Canine Parvovirus gây bệnh tiêu chảy cấp tính trên chó tại Thành phố Hồ Chí Minh” là kết quả của sự nghiên cứu nghiêm túc, được tiến hành dựa trên sự cố gắng học hỏi của bản thân dưới sự hướng dẫn nhiệt tình của thầy TS. Thân Văn Thái và thầy TS. Nguyễn Hoàng Dũng. Tôi xin cam đoan số liệu, kết quả nghiên cứu và kết luận trong luận văn này là hoàn toàn trung thực. Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2021 Người cam đoan (Ký và ghi rõ họ tên) Nguyễn Thanh Việt
LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ quý báu của quý thầy cô, các anh chị và các bạn. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới các thầy cô giáo khoa Công nghệ Sinh học, các thầy cô giáo Học viện Khoa học và Công nghệ đã chia sẻ tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy TS. Thân Văn Thái, Trường Đại học PHENIKAA; và TS. Nguyễn Hoàng Dũng, Viện Sinh học Nhiệt Đới,Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ bảo, luôn giúp đỡ hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận. Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo cùng toàn thể các anh chị, các bạn trong Đại học Nguyễn Tất Thành, đặc biệt là các anh chị tại Viện Khoa học môi trường nơi tôi công tác đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, các bạn trong tập thể lớp BIO2019B, những người luôn động viên, giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành tốt luận văn này. TP. HCM, ngày tháng năm 2021 Học viên Nguyễn Thanh Việt
1 MỤC LỤC MỤC LỤC ........................................................................................................ 1 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................ 3 DANH MỤC CÁC BẢNG .............................................................................. 5 DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... 6 MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 7 Chương 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU .................................................. 10 1.1. Tổng quan về Canine parvovirus ............................................................. 10 1.2. Phân loại Canine parvovirus .................................................................... 11 1.3. Cấu trúc genome của CPVs ..................................................................... 11 1.4. Phương thức lây nhiễm của CPVs ........................................................... 13 1.5. Đặc điểm sinh bệnh học CPVs ................................................................. 13 1.6. Phương pháp phòng và điều trị bệnh ....................................................... 15 1.7. Các phương pháp thường dùng trong chẩn đoán bệnh do CPVs gây ra .. 16 1.8. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về lưu hành CPVs ......................... 16 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 23 2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện............................................................... 23 2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 23 2.3. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 23 2.4. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 23 2.4.1. Phương pháp thu nhận mẫu................................................................... 23 2.4.2. Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu ............................................................ 23 2.5.1 Chẩn đoán CPVs bằng Kít xét nghiệm nhanh ....................................... 24 2.5.2. Phương pháp PCR ................................................................................. 25 2.5.2.1. Tách chiết DNA ................................................................................. 25 2.5.2.2. Thực hiện phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR)................... 25 2.5.3. Giải trình tự gen .................................................................................... 27 2.5.4. Phân tích trình tự gene .......................................................................... 28 2.5.5. Xây dựng và phân tích cây phát sinh loài ............................................. 28 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 29 3.1. Kết quả thu nhận mẫu .............................................................................. 29 3.2. Kết quả PCR phát hiện CPVs trong mẫu bệnh phẩm .............................. 30 3.3. Kết quả PCR khuyếch đại gen VP2 ......................................................... 31
2 3.4. Kết quả PCR genome hoàn chỉnh của chủng CPVs trong nghiên cứu này ......................................................................................................................... 32 3.5. Kết quả giải trình tự gen VP2 .................................................................. 33 3.6. Kết quả giải trình tự genome hoàn chỉnh chủng CPVs nghiên cứu ......... 33 3.8. Kết quả phân tích và so sánh trình tự amino acid (aa) của VP2 protein.. 35 3.9. Kết quả phân tích cây phát sinh loài ........................................................ 38 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ ................................................... 46 4.1. Kết luận .................................................................................................... 46 4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 46 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN CỦA TÁC GIẢ........................47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 58 PHỤ LỤC ....................................................................................................... 62
3 DANH MỤC CÁC CHŨ VIẾT TẮT CPV Canine parvovirus FPV Feline panleukopenia virus PCR Polymerase Chain Reaction NS1 Non-structural protein 1 NS2 Non-structural protein 2 ORF Open reading frame ssDNA Single-stranded DNA dsDNA Double-stranded DNA Ori origin of replication RCR rolling-circle replication PIF Parvovirus initiation factor SF3 superfamily 3 ATP Adenosine triphosphat DNA Deoxyribonucleic acid TfR Transferrin receptor HI Hemagglutination Inhibition ddNTP dideoxynucleotide CL cell lysis PBS Phosphate-buffered saline WB1 washing buffer 1 WB2 washing buffer 2 EB elution buffer TAE Tris-acetate-EDTA Arg Arginine Lys Lysine Asn Asparagine
4 Glu Axit glutamic Gly Glycine Ile Isoleucine Leu Leucine Met Methionine Phe Phenylalanin Pro Proline Ser Serine Thr Threonine Tyr Tyrosine Val Valine
5 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Các thành phần trong phản ứng PCR…………………………………...25 Bảng 2.2. Primers sử dụng trong phản ứng PCR…………………………………..26 Bảng 2.3. Các cặp mồi sử dụng trong khuếch đại trình tự bộ genome CPV………26 Bảng 2.4. Nhiệt độ và thời gian trong phản ứng PCR……………………………..27 Bảng 3.1. Kết quả thu nhận mẫu phân chó tiêu chảy trong nghiên cứu này………29 Bảng 3.2. Kết quả sau điều trị của có bị nhiễm CPV……………………………...29 Bảng 3.3. Kết quả PCR phát hiện CPVs trong mẫu thí nghiệm…………………...30 Bảng 3.4. Trình tự nucleotide và amino acid của gene VP2 của các mẫu CPVs sử dụng trong nghiên cứu này………………………………………………………….37
6 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Sơ đồ tiến hóa của CPVs theo thời gian………………………………….10 Hình 1.2. Cấu trúc của Canine parvovirus ………………………………………...11 Hình 1.3. Sơ đồ minh họa genome của chủng CPV (mã số NC_001539) …………12 Hình 1.4. Kết quả chẩn đoán nhanh kháng nguyên CPVs………………………….16 Hình 2.1. Thu thập mẫu ……………………………………………………………24 Hình 2.2. Chẩn đoán nhanh kháng nguyên CPVs ………………………………….24 Hình 2.3. Sơ đồ minh họa genome và vị trí các cặp mồi……………………………27 Hình 3.1. Kết quả PCR chẩn đoán CPVs …………………………………………..30 Hình 3.2. Kết quả PCR khuếch đại trình tự đầy đủ gen VP2 ………………………31 Hình 3.3. Sản phẩm PCR khuếch đại genome hoàn chỉnh chủng CPVs trong nghiên cứu này……………………………………………………………………………..32 Hình 3.4. Kết quả so sánh tương đồng trình tự trên hệ thống BLAST NCBI ……..33 Hình 3.5. So sánh trình tự genome của các chủng trong nghiên cứu này với chủng tham chiếu CPV-SH1516 phân lập tại Trung Quốc ……………………………….34 Hình 3.6. Cây phát sinh loài dựa trên gene VP2 trong nghiên cứu này ……………39 Hình 3.7. Cây phát sinh loài dựa trên gene VP1 trong nghiên cứu này ……………41 Hình 3.8. Cây phát sinh loài dựa trên gene NS1 trong nghiên cứu này ……………42 Hình 3.9. Cây phát sinh loài dựa gene NS2 trong nghiên cứu này …………………43 Hình 3.10. Cây phát sinh loài dựa trên vùng mã hóa genome trong nghiên cứu này………………………………………………………………………………….44
7 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết: Việt Nam là quốc gia có số lượng chó nuôi tương đối lớn và đặc biệt là chó nuôi làm cảnh (thú cưng) có xu hướng ngày càng tăng do điều kiện kinh tế và nhu cầu nuôi thú cảnh ngày càng tăng. Tuy nhiên, việc quản lý và chăm sóc gặp rất nhiều khó khăn do chó được nuôi rộng rãi với nhiều loại giống khác nhau nên sức đề kháng và khả năng thích nghi cũng rất khác nhau. Bên cạnh đó các yếu tố như điều kiện nuôi dưỡng, vệ sinh, khí hậu nóng ẩm, vv... cũng làm cho sự lây lan của các bệnh truyền nhiễm trở nên nghiêm trọng hơn tại nước ta. Canine paroviruses (CPVs) là tác nhân gây bệnh tiêu chảy cấp tính nguy hiểm trên chó, đặc biệt là chó ở độ tuổi từ 6 tuần tới 6 tháng và chưa được tiêm vắc-xin. CPVs có khả năng lây lan rất nhanh chủ yếu qua đường tiêu hóa thông qua thức ăn hoặc dụng cụ bị nhiễm vi-rút. Bệnh thường phát triển rất nhanh trong vòng từ 3-7 ngày, tỷ lệ tử vong khoảng 10% đối với chó trưởng thành và 91% đối với chó con. CPVs là vi-rút DNA sợi đơn, thuộc giống Parvovirus trong họ Parvoviridae. CPVs phân chia thành 2 nhóm là CPV-1 và CPV-2. Trong đó CPV-2 có 3 phân nhóm là CPV-2a, CPV-2b và CPV-2c. Tính đến nay thì CPV-2c được đánh giá là có đặc tính kháng nguyên và độc lực là mạnh nhất. Bộ gen của CPVs dài khoảng 5,3 kb, có 2 gen mã hóa protein phi cấu trúc NS1 và NS2, và 2 gen mã hóa protein cấu trúc là VP1 và VP2. Vỏ capsid của CPVs được tạo thành từ phức hợp của khoảng 60 bản sao của hai protein cấu trúc VP1 (84 kDa) và VP2 (67 kDa) với tỷ lệ tương đương khoảng 10% và 90%. Ngoài ra, protein VP2 là yếu tố độc lực chính có vai trò quan trọng trong khả năng gây bệnh và kích thích hệ thống miễn dịch hình thành kháng thể trung hòa; và protein VP1 hình thành nên một cấu trúc khối 20 mặt (icosahedral) đối xứng giúp vi- rút có khả năng chống lại axit, bazơ, dung môi và nhiệt độ lên đến 50ºC [1]. Bệnh do CPVs gây ra xuất hiện vào cuối những năm 1970, được công nhận lần đầu tiên vào năm 1978 và được xác nhận nguồn gốc từ đột biến của vi-rút gây bệnh bạch cầu ở mèo và có xu hướng lan rộng tại nhiều khu vực trên thế giới [2], [3]. Từ năm 1979, CPV-2a (một biến thể di truyền của CPV-2) lây lan trên toàn cầu. Các chủng CPV-2a trải qua các quá trình tiến hóa và giữ lại một số đột biến điểm tại vùng kháng nguyên vỏ và do đó có khả năng lây lan cao. Ngoài loại kháng nguyên CPV- 2a ban đầu, có hai biến thể kháng nguyên được biết đến, được gọi là CPV-2b và CPV- 2c. CPV-2b được phát hiện lần đầu vào năm 1984 tại Hoa Kỳ [4], [5] và CPV-2c được phát hiện lần đầu vào năm 2001 tại Ý [6]. Sự khác biệt về kháng nguyên giữa
8 ba biến thể được thể hiện qua biến đổi tại vị trí amino acid 426 (Asn trong CPV-2a, Asp trong CPV-2b, và Gla trong CPV-2c) trên vùng gene VP2 [4], [5]. Các nghiên cứu cho thấy khi một biến thể CPV-2 mới xuất hiện, nó sẽ thay thế rất nhanh các biến thể cũ [6], [7]. Trong những năm gần đây, CPV-2c đã được phát hiện phổ biến ở các nước Châu Âu [6], Hoa Kỳ [8], Nam Mỹ [9] và Châu Phi [10]. Lần đầu tiên CPV-2c được báo cáo ở Việt Nam vào năm 2004 [11]. Hiện nay, chủng CPV-2c không còn phổ biến ở Châu Á [12] mà được thay thế bởi các biến thể CPV-2c mới xuất hiện và phổ biến tại nhiều quốc gia như Trung Quốc [13-15], Đài Loan [16], Thái Lan và Việt Nam [11]. Nhìn chung, các biến thể của CPV (-2a, -2b và -2c) đang lưu hành trên thế giới với tần suất và mức độ tiến hóa thay đổi theo địa lý và thời gian [12], [13]. Hiện nay, tại Việt Nam các nghiên cứu về bệnh do CPVs trên chó vẫn còn hạn chế, trong đó các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào phương pháp chẩn đoán phát hiện, phân lập, và đánh giá đặc điểm di truyền dựa trên phân tích một phần trình tự đoạn gen VP2 của các chủng CPVs đang lưu hành [11], [14-17]. Gần đây, chỉ có duy nhất một nghiên cứu phân tích phân tử và phát sinh loài bộ gen đầy đủ của các biến thể CPV-2c được phân lập từ 2017 đến năm 2018 ở Việt Nam [18]. Điều này, cho thấy sự thiếu hụt thông tin về đặc điểm di truyền của các chủng CPVs tại Việt Nam nói riêng và chủng CPVs trên thế giới nói chung. Vì vậy, để xác định các đột biến có thể ảnh hưởng đến vắc-xin và cơ chế tiến hóa của các chủng CPV thì cần có thêm nhiều nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu về đặc điểm trình tự genome chứa đầy đủ các vùng mã hóa của protein phi cấu trúc NS1/NS2 và protein cấu trúc VP1/VP2 của các chủng CPVs đã và đang lưu hành hiện tại. Chó nhiễm CPVs hiện không có thuốc đặc hiệu để điều trị mà sử dụng các biện pháp như truyền dịch, bổ sung chất điện giải nhằm tăng cường sức đề kháng, kết hợp sử dụng kháng sinh để tránh bội nhiễm vi khuẩn. Do đó, việc sử dụng vắc-xin được coi là phương pháp hiệu quả nhất trong phòng và trị bệnh do CPVs gây ra. Tuy nhiên, các loại vắc-xin CPV-2 được sử dụng ở Việt Nam chủ yếu được nhập khẩu từ nước ngoài và đa số chỉ được sử dụng tiêm cho các loại chó giống nhập khẩu và chó lai từ 6 tuần đến 6 tháng tuổi. Chó bản địa Việt Nam hiếm khi được tiêm phòng vì vậy đây có thể là một trong những nguyên nhân dẫn đến sự lây lan CPV-2 trên khắp cả nước. Hơn nữa, đây cũng có thể là nguồn gốc dẫn đến sự đột biến, khi có nhiều trường hợp mặc dù đã được tiêm vắc-xin nhưng vẫn nhiễm bệnh tiêu chảy cấp tính nặng do các biến thể CPVs mới gây ra được báo cáo trên toàn quốc [19]. Sự bùng phát CPVs ở những con chó được tiêm chủng cũng được báo cáo ở nhiều quốc giá khác nhau trên thế giới.
9 Từ các yếu tố thực tiễn trên, các nghiên cứu nhằm bổ sung và cập nhật các thông tin như dịch tễ học, đặc điểm di truyền phân tử, mức độ tương đồng của các chủng vắc-xin CPVs thương mại so với các chủng CPVs đang lưu hành, vv… là cần thiết để hỗ trợ công tác chẩn đoán và điều trị bệnh do CPVs gây ra. Do đó, để xây dựng cơ sở dữ liệu nhằm hỗ trợ trong công tác sàng lọc CPV vắc-xin phù hợp và đồng thời giúp hiểu rõ hơn về cơ chế tiến hóa của CPVs tại Việt Nam chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài “Phân tích đặc điểm phân tử của Canine Parvovirus gây bệnh tiêu chảy cấp tính trên chó tại Thành phố Hồ Chí Minh”. Mục đích của đề tài Phân tích đặc điểm phân tử của Canine parvovirus gây bệnh tiêu chảy cấp tính trên chó tại Thành phố Hồ Chí Minh. Nội dung nghiên cứu: - Thu thập và bảo quản mẫu phân tiêu chảy của chó tại phòng khám Thú y với kết quả dương tính CPVs bằng Kit chẩn đoán nhanh. - Chẩn đoán và nhận diện phân tử CPVs bằng phản ứng PCR. - Giải trình tự và phân tích đặc điểm trình tự (trình tự nucleotides, amino acids, xây dựng cây phát sinh loài) của gene mã hóa protein bề mặt VP2. - Giải trình tự và phân tích trình tự genome đầy đủ của 02 mẫu CPVs (trình tự nucleotides, amino acids, xây dựng cây phát sinh loài). Kết quả đạt được trong nghiên cứu: Bổ sung và cập nhật thông tin về dịch tễ học, xác định các đặc điểm di truyền trên gene VP2 và genome của các chủng CPVs đang lưu hành tại Tp. Hồ Chí Minh so với các chủng lưu hành trên thế giới. Ngoài ra, kết quả đạt được góp phần xác định đặc điểm đa dạng trong tiến hóa cũng như cung cấp thông tin nhằm hỗ trợ công tác sản xuất vắc-xin phù hợp trong phòng và trị bệnh do CPVs gây ra tại nước ta.
10 Chương 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 . Tổng quan về Canine parvovirus Canine parvovirus (CPVs) được phát hiện lần đầu tiên vào khoảng năm 1976 trên chó tại Châu Âu. Đến năm 1978, CPV đã lây lan rộng rãi và trở thành đại dịch, gây ra các chứng bệnh viêm cơ tim và viêm dạ dày và gây chết nhiều ở chó con, chó trưởng thành trên khắp thế giới. CPVs được xem như là một biến thể của Feline panleukopenia virus (FPV), một loại vi-rút được phát hiện từ những năm 1920, gây ra các bệnh trên mèo, chồn và một số động vật khác. CPV có thể phát sinh do quá trình đột biến gen cho phép nó mở rộng phạm vi vật chủ lên trên chó, chó sói, gấu trúc cũng như một số động vật hoang dã khác [20]. Ngay sau khi xuất hiện, CPV-2 đã trải qua quá trình tiến hóa liên tiếp tạo ra 2 biến thể kháng nguyên: CPV-2a được báo cáo năm 1979 và CPV-2b năm 1984, hai biến thể này dần thay thế các chủng CPV ban đầu. Năm 2000, tiếp tục xuất hiện biến thể kháng nguyên mới là CPV-2c, được phát hiện đầu tiên ở Ý và nhanh chóng lây lan sang nhiều số quốc gia khác nhau. CPV-2c dần trở nên phổ biến ở các khu vực địa lý khác nhau và gây ảnh hưởng đến cả trên các loại chó trưởng thành và cả những giống chó đã được tiêm ngừa vắc-xin [21]. Các nghiên cứu cho thấy các biến chủng của CPV-2c có khả năng chịu tác động một phần hoặc né tránh được hệ miễn dịch của chó đã được tiêm phòng với vắc-xin chủng CPV-2b [22] (Hình 1.1). Mặc dù đã có nhiều loại vắc-xin CPV có hiệu lực giúp giảm tỷ lệ nhiễm và tỷ lệ tử vong do CPVs gây ra. Tuy nhiên do đặc tính dễ phát sinh những biến chủng mới của CPVs với độc tính thay đổi thì CPVs vẫn luôn là tác nhân gây bệnh hàng đầu cho chó nhà và chó hoang [22]. Do đó việc nghiên cứu các biện pháp phòng ngừa và điều trị bệnh hiệu quả do CPVs là vô cùng quan trọng (Nguồn https://www.vet.cornell.edu/). Hình 1.1. Sơ đồ tiến hóa của CPVs theo thời gian [22]
11 1.2. Phân loại Canine parvovirus Phân loại khoa học: Family (Họ): Parvoviridae Subfamilies (Phân họ): Parvovirinae Genus (Chi): Protoparvovirus Species (Loài): Carnivore protoparvovirus 1 Virus: Canine parvovirus Họ Parvoviridae bao gồm hai phân họ, Parvovirinae và Densovirinae, lây nhiễm lần lượt trên vật chủ là động vật có xương sống và côn trùng. Tính đến nay, có năm chi nằm trong phân họ Parvovirinae, bao gồm Protoparvovirus, Erythrovirus, Dependovirus, Amdovirus và Bocavirus. CPV nằm trong chi Protoparvovirus, cùng với Feline panleukopenia virus (FPV), Mink enteritis virus (MEV) và Racoon parvovirus (RPV). Có hai loại CPV gây bệnh trên chó là CPV-1 và CPV-2. Tuy nhiên, tác nhân phổ biến gây ra bệnh tiêu chảy cấp trên chó là do CPV-2 còn CPV-1 đã được phân loại vào trong chi Bocavirus cùng với Parvovirus gây bệnh trên bò [23]. 1.3. Cấu trúc genome của CPVs Canine parvovirus là vi-rút DNA sợi đơn (single strain, ssDNA), đường kính từ 20-26mm. Genome của CPVs có chiều dài khoảng 5,3 kb. Chứa hai khung đọc mở (open reading frame, ORF) chính (Hình 1.3). Hình 1.2. Cấu trúc của Canine parvovirus [24] Khung đọc mở đầu tiên của nửa đầu 3’ mã hóa hai gen phi cấu trúc NS1 và NS2, đây là các gen đóng vai trò thiết yếu cho sự nhân lên của vi-rút và gây ra quá trình apoptosis trong các tế bào vật chủ [24]. Trong đó:
12 NS1 (non-structural protein 1): đây là loại protein đa chức năng hiển thị các hoạt động endonuclease và helicase cần thiết để bắt đầu và điều khiển quá trình sao chép DNA của vi-rút. Ngoài ra, NS1 còn đóng vai trò trong quá trình đóng gói vi-rút và chuyển hóa một số chất xúc tác [24]. NS2 (non-structrual protein 2): đây là loại protein được tạo ra từ khung đọc mở chứa 87 acid amin đầu tận cùng với NS1 liên kết với 78 acid amin từ một khung đọc mở tiếp theo. NS2 của CPV gây bệnh trên loài gặm nhấm đóng vai trò kiểm soát quá trình lắp ráp và dịch mã protein. Tuy nhiên, theo Wang và cs thì NS2 của CPV được dự đoán khác với protein của parvovirus gây bệnh ở loài gặm nhấm. Các đặc tính và chức năng của protein NS2 của CPV vẫn chưa được nghiên cứu chính xác [24]. Khung đọc mở thứ hai từ nửa đầu 5’ mã hóa cho hai gen cấu trúc, VP1 và VP2, có nhiệm vụ cấu tạo nên vỏ capsid từ 6 bản sao của VP1 và 54 bản sao của VP2, chúng còn là kháng nguyên chính tạo ra các kháng thể trung hòa và cũng là yếu tố gây độc lực [25]. Vỏ CPV (capsid) có đường kính khoảng 25 nm, được lắp ráp từ 60 bản sao kết hợp từ các protein VP1 và VP2, khác nhau bởi sự hiện diện của N- mở rộng đầu cuối trong minor protein VP1 capsid bao bọc ssDNA của bộ gen. Trong đó: VP1 chiếm khoảng 10%, hình thành nên một icosa-herdal giúp chúng có khả năng chống lại acid, bazơ, v.v. Đây là protein có vai trò chủ chốt trong quá trình lây nhiễm trong tế bào, chúng thường nằm sâu trong capsid và khó bị phát hiện bởi các kháng thể. Đây là protein cần thiết trong vai trò lây nhiễm của capsid nhưng lại không đóng góp cao trong việc hình thành vỏ của vi-rút. Vùng kết thúc của VP1 còn chứa một số nhóm acid amin cơ bản giống với trình tự hạt nhân cổ điển, bao gồm trình tự được bảo tồn gần cuối vùng kết thúc bao gồm 4 acid amin cơ bản, có nhiệm vụ vận chuyển các protein vào trong nhân tế bào [26]. VP2 chiếm phần lớn còn lại có nhiệm vụ cấu tạo nên vỏ capsid và là yếu tố độc lực chính. Các protein Capsid chịu trách nhiệm cho việc gắn vào TFRC (Transferrin receptor) thụ thể của tế bào chủ. Sự gắn kết này chủ yếu gây ra sự nội hóa virion thông qua quá trình nội bào hóa clathrin. Liên kết với các thụ thể vật chủ cũng gây ra sự sắp xếp lại capsid dẫn đến sự tiếp xúc trên bề mặt của VP1 N-endinus, đặc biệt là vùng giống như phospholipase A2 của nó [25]. Hình 1.3. Sơ đồ minh họa genome của chủng CPVs
13 1.4. Phương thức lây nhiễm của CPVs CPVs có khả năng chống lại tác động của nhiệt độ, chất tẩy rửa và cồn nên chúng có thể tồn tại rất lâu từ năm tháng trở lên trong môi trường tự nhiên và có khả năng lây nhiễm rất cao. Nguồn lây nhiễm CPVs là chất thải từ phân của chó bệnh, nó dễ dàng lây truyền qua lông hoặc chân của những con chó bị nhiễm bệnh và cả những vật bị ô nhiễm như lồng hoặc giày. Bệnh có thể lây nhiễm trực tiếp khi tiếp xúc với phân của chó bệnh hay tiếp xúc gián tiếp qua quần áo, giày dép, thiết bị, dây xích, chuồn nuôi nhốt, trên da người đã từng tiếp xúc với mầm bệnh hay trong môi trường bị ô nhiễm như bệnh viện thú y, cửa hàng thú cưng, các cơ sở chăn nuôi thương mại, vv… Vì vậy việc quản lý và chăm sóc gặp rất nhiều khó khăn do chó được nuôi rộng rãi với nhiều loại giống khác nhau nên sức đề kháng cũng khác nhau. Bên cạnh đó các yếu tố như điều kiện nuôi dưỡng, vệ sinh, khí hậu nóng ẩm, vv... cũng làm cho sự lây lan của các bệnh truyền nhiễm trở nên nghiêm trọng hơn. 1.5. Đặc điểm sinh bệnh học CPVs CPVs lây nhiễm trên chó và phát triển rất nhanh, thông thường thời gian ủ bệnh trong khoảng từ ba đến bảy ngày và sau đó chó xuất hiện các biểu hiện lâm sàng. CPVs sử dụng nguồn nguyên liệu trong tế bào của vật chủ để tiến hành phân chia hàng loạt. Đầu tiên, vi-rút tấn công các hạch amidan hoặc hạch bạch huyết tại vùng hầu họng, tiếp tục xâm nhập vào tế bào lympho trong một hoặc hai ngày rồi tạo ra nhiều bản sao của nó. Những vi-rút này cản trở đường đi bên trong của các tế bào lympho, nơi chúng được bảo vệ tránh khỏi hệ thống phòng thủ của vật chủ và xâm nhập vào máu. Nhiều trong số các tế bào lympho bị nhiễm CPV này cuối cùng sẽ bị tiêu diệt, làm giảm số lượng bạch cầu. Khi đi vào trong máu, vi-rút tấn công mạnh vào tủy xương cũng như trong các tế bào xếp dọc theo thành của ruột non. CPV có thể gây nhiễm trùng tim, dẫn đến viêm cơ tim, chức năng kém và rối loạn nhịp tim trên và bệnh trở nên đặc biệt nghiêm trọng ở chó non dưới 4 tháng tuổi. Thống kê cho thấy tỷ lệ tử vong khi nhiễm CPVs trong khoảng 10% đối với chó trưởng thành và 91% đối với chó con nếu không được điều trị kịp thời [27]. Các thể bệnh điển hình: Parvovirus đường ruột: tiến triển nhanh, đặc biệt với các chủng mới bao gồm CPV-2a, -2b, và -2c. Triệu chứng điển hình như nôn mửa dữ dội, tiêu chảy, chán ăn và mất nước nhiều. Phân chuyển màu xám vàng, có lẫn máu tươi và máu thẫm. Nhiệt độ trực tràng tăng cao (40-41oC) và tăng bạch cầu, đặc biệt là trong các trường hợp nghiêm trọng. Chết trên chó xảy ra sớm trong vòng 2 ngày sau khi bị bệnh tấn công
14 và thường kết hợp bội khuẩn gram âm hoặc đông tụ nội mạc thành mạch hoặc cả hai [28]. Bệnh thần kinh: Dấu hiệu thần kinh có thể do sự xuất huyết trong hệ thống thần kinh trung ương hoặc bị giảm đường huyết trong suốt quá trình bệnh, sự nhiễm khuẩn hoặc sự rối loạn các ion acid-bazơ [28]. Bệnh về da: Những tổn thương gồm: loét ở gang bàn chân, miệng và màng nhầy âm đạo. Các hốc trong xoang mũi và các mảng ban đỏ ở bụng và vùng da xung quanh âm hộ cũng được phát hiện [28]. Viêm cơ tim: CPV gây viêm cơ tim có thể phát triển do lây nhiễm từ dạ con hoặc bào thai nhỏ hơn 6 tuần thai. Tất cả chó con đều bị ảnh hưởng, chó con bị nhiễm CPV gây viêm cơ tim đều bị chết hoặc chết sau một thời gian ngắn có biểu hiện triệu chứng, khó thở, và nôn mửa [28]. Chứng huyết khối: CPV gây ra tình trạng huyết khối động mạch chủ, do sự xuất hiện các cục máu đông trong động mạch chủ, dẫn đến sự gián đoạn truyền lưu lượng máu đến các mô được phân đoạn bởi động mạch chủ chó, có thể gây ra các biến chúng nghiêm trọng [28]. Nhiễm khuẩn nước tiểu: Do sự nhiễm bẩn từ phân của cơ quan sinh dục ngoài kết hợp với Neutropenia. Bệnh phát triển trên hệ tiết niệu nếu không được điều trị kịp thời có thể dẫn đến bệnh đường niệu mạn tính (Nguồn: https://www.vet.cornell.edu/). Chu kỳ nhân lên của CPV CPV là một loại vi-rút DNA sợi đơn nhỏ, chưa phát triển. Chu kỳ nhân lên CPV xảy ra trong nhân của các tế bào đang phân chia vào cuối pha S hoặc đầu pha G2. Sự lây nhiễm của các tế bào phân chia diễn ra nhanh chóng và vi-rút thường tác động trên tủy xương và đường tiêu hóa của vật chủ. Một gam phân từ một con chó bị nhiễm trùng nặng có thể chứa đủ vật chất vi-rút để lây nhiễm cho hơn 10 triệu con chó thông qua việc tiếp xúc bằng tiêu hóa.[53] Vi-rút ban đầu nhân lên trong mô bạch huyết hầu họng và sau đó được cho là lây lan qua huyết tương. Biểu mô của đường ruột thường bị nhiễm vào ngày thứ 4 sau khi nhiễm bệnh. Kháng thể bắt đầu xuất hiện khoảng 5 ngày sau khi nhiễm trùng và tăng đến mức tối đa vào ngày thứ 7 đến ngày 10. Các dấu hiệu lâm sàng xuất hiện từ 4 đến 10 ngày sau khi nhiễm bệnh [53]. Sự tương tác giữa virus CPV và vật chủ Vi-rút tấn công vào tủy xương của vật chủ, làm suy yếu khả năng tự bảo vệ của cơ thể vật chủ bằng cách phá hủy các tế bào miễn dịch non và gây giảm số lượng bạch cầu bảo vệ. Vi-rút gây ra sự phá hủy này bằng cách nhắm mục tiêu vào biểu mô
15 của ruột non, lớp niêm mạc có vai trò hấp thụ chất dinh dưỡng và cung cấp màng bảo vệ quan trọng chống lại sự mất chất lỏng và sự xâm nhập của vi khuẩn từ ruột vào cơ thể. Các tế bào tạo nên bề mặt biểu mô tồn tại trong thời gian ngắn và được thay thế liên tục bởi các tế bào mới sinh ra. Vi-rút xâm nhập vào các tế bào biểu mô mới được sinh ra và vô hiệu hóa khả năng bổ sung chất dinh dưỡng cho bề mặt ruột của cơ thể vật chủ. Bằng cách ngăn chặn việc thay thế các tế bào già và gây chết các tế bào mới sinh ra, khiến cho bề mặt ruột không thể hấp thụ đầy đủ chất dinh dưỡng, gây ra hiện mất nước trong cơ thể vật chủ. Từ đó, gây ra tiêu chảy dữ dội và buồn nôn là kết quả ban đầu, nhưng cuối cùng bề mặt ruột có thể bị tổn thương đến mức bắt đầu phân hủy và vi khuẩn thường sống trong ruột xâm nhập vào thành ruột và đi vào máu. Điều này gây mất nước đáng kể do tiêu chảy và nhiễm trùng lan rộng bên trong cơ thể. Tệ hơn nữa, hệ thống miễn dịch của cơ thể đã bị suy yếu, do khả năng sản xuất các tế bào bạch cầu mới để chống lại nhiễm trùng đã bị cản trở bởi sự xâm nhập của CPV vào tủy xương có khả năng dẫn đến tỷ lệ tử vong cao đối với vật chủ (Nguồn: https://www.vet.cornell.edu/). 1.6. Phương pháp phòng và điều trị bệnh Ở chó nhiễm CPVs có tỷ lệ tử vong rất cao, do vi-rút gây mất nước, thiếu máu, nhiễm trùng máu, xuất huyết viêm ruột. Để điều trị bước đầu tiên là điều chỉnh mất nước và mất cân bằng điện giải. Điều này đòi hỏi phải sử dụng dịch truyền tĩnh mạch có chứa chất điện giải. Thuốc kháng sinh và thuốc chống viêm được dùng trong trường hợp ngăn ngừa hoặc kiểm soát nhiễm trùng máu. Thuốc chống co thắt được sử dụng để ức chế tiêu chảy và nôn mửa. Hầu hết những chó bị nhiễm CPVs có khả năng phục hồi nếu điều trị tích cực trước khi quá trình nhiễm trùng máu nặng và mất nước xảy ra. Vì những lý do khác nhau, một số giống có tỷ lệ tử vong cao hơn nhiều so với các giống khác [28]. Sử dụng vắc-xin được coi là phương pháp hiệu quả nhất trong phòng và trị bệnh do CPVs gây ra. Chó con được tiêm vắc-xin CPVs mũi đầu tiên ở 5 đến 6 tuần tuổi và tiêm nhắc lại 2 mũi sau mỗi 2 đến 3 tuần và yêu cầu tiêm tăng cường sau mỗi 1 đến 3 năm [28]. Hiện nay trên thị trường có nhiều loại CPV vắc-xin được nhập vào nước ta. Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào cho thấy được hiệu quả sử dụng các loại vắc-xin này trong phòng và trị bệnh do CPVs gây ra. Do đó, cần tiếp tục nghiên cứu về đặc điểm dịch và phân tử của các chủng CPVs nhằm đánh giá khả năng bảo hộ của CPV vắc-xin cũng như lựa chọn được các chủng vi-rút phù hợp cho công tác sản xuất CPV vắc-xin đặc hiệu tại nước ta.
16 1.7. Các phương pháp thường dùng trong chẩn đoán bệnh do CPVs gây ra Để chẩn đoán nguyên nhân bệnh là CPVs, có thể sử dụng các phương pháp dưới đây. Chẩn đoán theo triệu chứng: CPV có thể gây ra những triệu chứng như lờ đờ, mệt mỏi, chán ăn, nôn mửa và đi phân ra máu. Tuy nhiên, chỉ dựa vào triệu chứng bệnh chỉ có thể chẩn đoán trong ít trường hợp. Trên chó, không chỉ có CPV gây ra các triệu chứng trên mà còn có một vài chủng vi-rút gây hại đường ruột cũng biểu hiện như trên. Chẩn đoán theo nguyên lý kháng thể - kháng nguyên: Đây là phương pháp phổ biến để phát hiện nhanh sự hiện diện của kháng nguyên CPV trong mẫu bệnh phẩm (CPV rapid test kit). Kết quả được quan sát thông qua sự biến đổi màu tín hiệu được thực hiện bởi cơ chất và enzyme của phản ứng (Hình 1.3). Tuy nhiên, phương pháp này có tỷ lệ kết quả chẩn đoán không chính xác (dương tính giả hoặc âm tính giả) do thao tác của người sử dụng. C T Hình 1.4. Kết quả chẩn đoán nhanh kháng nguyên CPVs Chẩn đoán bằng phương pháp PCR: Đây là phương pháp chẩn đoán dựa trên trình tự di truyền của CPV. Đây là phương pháp có độ chính xác cao và đặc hiệu hơn nhiều so với phương pháp kháng thể-kháng nguyên. Phương pháp PCR được thực hiện dựa trên tính đặc hiệu của các cặp mồi được thiết kế trên các vùng trình tự ít biến đổi nhưng đặc trưng của CPVs (thông tin các cặp mồi đặc hiệu sử dụng trong chẩn đoán CPVs được trình bày ở phần Phương pháp nghiên cứu). Sản phẩm PCR được điện di và hiển thị màu trên gel argarose (Hình 3.1). 1.8. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về lưu hành CPVs Một số nghiên cứu về CPVs trong nước: Sự lây nhiễm CPV-2 và sự bùng phát của nó ở Việt Nam đã được nghiên cứu từ năm 1994 và sau đó được coi là mối quan tâm quan trọng nhất về sức khỏe của chó với tỷ lệ mắc bệnh và tử vong cao ở cả chó nhà và chó hoang [14].