Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Tối ưu hóa điều kiện tách chiết và làm giàu axit béo không no omega-6, 7, 9 từ sinh khối vi khuẩn tía quang hợp

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:106

Thêm vào BST

Báo xấu

28
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm mục đích có được điều kiện thích hợp cho tách chiết axit béo tổng số (TFA) từ sinh khối khô VKTQH và làm giàu axit béo không no omega-6, 7, 9 bằng phương pháp tạo phức với urê. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Tối ưu hóa điều kiện tách chiết và làm giàu axit béo không no omega-6, 7, 9 từ sinh khối vi khuẩn tía quang hợp

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Trần Thị Thu Quỳnh TỐI ƢU HÓA ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT VÀ LÀM GIÀU AXIT BÉO KHÔNG NO OMEGA-6, 7, 9 TỪ SINH KHỐI VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội - 2020
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Trần Thị Thu Quỳnh TỐI ƢU HÓA ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT VÀ LÀM GIÀU AXIT BÉO KHÔNG NO OMEGA-6, 7, 9 TỪ SINH KHỐI VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: Cán bộ hƣớng dẫn 1 Cán bộ hƣớng dẫn 2 TS. Hoàng Thị Yến GS. TS. Đặng Diễm Hồng Hà Nội - 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài: “Tối ƣu hóa điều kiện tách chiết và làm giàu axit béo không no omega-6, 7, 9 từ sinh khối vi khuẩn tía quang hợp” là do tôi trực tiếp thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Hoàng Thị Yến và GS. TS. Đặng Diễm Hồng. Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn chính xác, trung thực. Mọi thông tin nội dung tham khảo trong báo cáo đều đƣợc trích dẫn rõ ràng tên tác giả, tên công trình, thời gian, địa điểm và nguồn gốc. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này! Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Học viên Trần Thị Thu Quỳnh
LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập và nghiên cứu, để hoàn thành luận văn này, trƣớc tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. Hoàng Thị Yến - cán bộ Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen và GS. TS. Đặng Diễm Hồng - nguyên trƣởng Phòng Công nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam, là những ngƣời thầy đã trực tiếp hƣớng dẫn, lên ý tƣởng, định hƣớng nghiên cứu, tận tình chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu này. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến Ths. Lê Thị Thơm, Ths. Lƣu Thị Tâm - cán bộ Phòng Công nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hƣớng dẫn, nhiệt tình giúp đỡ em trong các thí nghiệm khi gặp những khó khăn và cũng truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý giá trong công tác nghiên cứu Sinh học. Luận văn đƣợc thực hiện bằng kinh phí của Đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất omega 6, 7, 9 từ vi khuẩn tía quang hợp ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm” do TS. Hoàng Thị Yến làm chủ nhiệm thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến của Bộ Công thƣơng, năm 2017-2020. Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám đốc, các thầy, cô giáo thuộc Khoa Công nghệ sinh học và Phòng Đào tạo, Quản lý Khoa học và Hợp tác quốc tế của Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện, hƣớng dẫn, truyền đạt cho em rất nhiều kiến thức trong quá trình học tập tại Học viện. Xin cảm ơn gia đình, bạn bè và ngƣời thân đã động viên, là hậu phƣơng vững chắc giúp em có động lực học tập. Em xin chân thành cảm ơn! Học viên Trần Thị Thu Quỳnh
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ Tên tiếng Việt VKTQH Vi khuẩn tía quang hợp Axit béo không bão hào MUFA Monounsaturated fatty acid một nối đôi Axit béo không bão hòa đa PUFA Polyunsaturated fatty acid nối đôi SFA Saturated fatty acid Axit béo bão hòa UFA Unsaturated fatty acid Axit béo không bão hòa OD Optical density Mật độ quang TFA Total fatty acid Axit béo tổng số SKK Sinh khối khô ω Omega Omega HUFA Highly unsaturated fatty acid Axit béo không bão hòa cao EPA Eicosapentaenoic acid Eicosapentaenoic acid DHA Docosahexaenoic acid Docosahexaenoic acid DPA Docosapetaenoic acid Docosapetaenoic acid ARA Arachidonic acid Arachidonic acid ACP Acyl carrier protein Protein mang acyl
DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng kim loại nặng trong mẫu dầu sinh học 36 Bảng 2.2. Phƣơng pháp xác định chỉ tiêu vi sinh vật có trong dầu sinh học 37 Bảng 3.1. Hàm lƣợng sinh khối khô, lipid và omega-3, 6, 7, 9 của VKTQH khi nuôi trong bể quang sinh thể tích 1m3 38 Bảng 3.2. Thành phần axit béo của hỗn hợp MUFAs và PUFAs với tỷ lệ TFA: urê khác nhau 46 Bảng 3.3. Hiệu suất thu hồi MUFAs, PUFAs và chỉ số iot của mẫu thu đƣợc sau các lần tạo phức với urê 50 Bảng 3.4. Phân tích chỉ tiêu cảm quan, hóa lý của mẫu dầu sinh học omega-6, 7, 9 54 Bảng 3.5. Kết quả phân tích hàm lƣợng omega-6, 7, 9. 55 Bảng 3.6. Kết quả phân tích dƣ lƣợng urê, kim loại nặng trong dầu sinh học giàu axit béo omega-6, 7, 9 56 Bảng 3.7. Kết quả phân tích chỉ tiêu vi sinh vật 56
DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Tổng hợp axit béo 17 Hình 1.2. Phản ứng ester hóa dầu mỡ 21 Hình 3.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH 40 Hình 3.2. Ảnh hƣởng của chất xúc tác lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH 41 Hình 3.3. Ảnh hƣởng của tỷ lệ sinh khối/ dung môi lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH 42 Hình 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH 43 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của điều kiện khuấy trộn lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH 43 Hình 3.6. Hiệu suất tách chiết SFAs (A) và MUFAs, PUFAs (B) ở các tỷ lệ TFA: urê khác nhau. 45 Hình 3.7. Hiệu suất tách chiết SFAs (A) và MUFAs, PUFAs (B) ở các tỷ lệ TFA: urê : methanol khác nhau. 47 Hình 3.8. Hiệu suất tách SFAs (A) và MUFAs, PUFAs (B) ở các nhiệt độ khác nhau. 49 Hình 3.9. Sơ đồ quy trình tách chiết và làm giàu axit béo không no omega-6, 7, 9 từ sinh khối VKTQH 51 Hình 3.10. Hình ảnh minh họa quá trình làm giàu hỗn hợp axit béo omega-6, 7, 9 bằng phƣơng pháp tạo phức urê 53
1 MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỤC LỤC 1 MỞ ĐẦU 4 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6 1.1. TỔNG QUAN VỀ LIPID, AXIT BÉO KHÔNG NO MỘT NỐI ĐÔI (MUFAs) VÀ ĐA NỐI ĐÔI (PUFAs) (DẠNG OMEGA-6, 7, 9) 6 1.1.1. Giới thiệu về lipid 6 1.1.2. Giới thiệu về MUFAs và PUFAs (dạng omega-6, 7, 9) 7 1.1.3. Các nguồn cung cấp omega-6, 7, 9 9 1.2. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP (VKTQH) 13 1.2.1. Định nghĩa 13 1.2.2. Sinh thái học của VKTQH 14 1.2.3. Ứng dụng của VKTQH 14 1.2.4. Khả năng sinh tổng hợp axit béo không no của VKTQH 17 1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH DẦU 19 1.3.1. Các phƣơng pháp tách chiết dầu 19 1.3.2. Các phƣơng pháp làm giàu 23 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU OMEGA-6, 7, 9 TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 25 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 25 1.4.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt nam 27 CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 29
2 2.2. ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 29 2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 29 2.2.2. Vật liệu nghiên cứu 29 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.3.1. Phƣơng pháp chuyển vị ester trực tiếp từ sinh khối để tạo ra hỗn hợp các axit béo ở dạng methyl ester 30 2.3.2. Tối ƣu các thông số của quá trình tách chiết TFA 31 2.3.3. Làm giàu hỗn hợp axit béo omega-6, 7, 9 trong dầu vi khuẩn tía bằng phƣơng pháp tạo phức với ure 32 2.3.4. Phƣơng pháp phân tích thành phần axit béo của dầu 33 2.3.5. Phƣơng pháp xác định trạng thái cảm quan 34 2.3.6. Phƣơng pháp xác định chỉ số axit 34 2.3.7. Phƣơng pháp xác định chỉ số iot 35 2.3.8. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng urê 35 2.3.9. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng các kim loại nặng trong dầu sinh học 36 2.3.10. Phƣơng pháp xác định vi sinh vật trong dầu sinh học 37 2.3.11. Phƣơng pháp xử lý thống kê 37 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1. HÀM LƢỢNG SINH KHỐI KHÔ, LIPID VÀ THÀNH PHẦN AXIT BÉO (OMEGA-6, 7, 9) CỦA SINH KHỐI HỖN HỢP 2 CHỦNG VKTQH SẢN XUẤT TRONG BỂ QUANG SINH THỂ TÍCH 1M3 38 3.2. TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG TÁCH CHIẾT TFA TỪ SINH KHỐI KHÔ VKTQH 39 3.2.1. Kết quả xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng 39 3.2.2. Kết quả xác định ảnh hƣởng của chất xúc tác 40 3.2.3. Kết quả xác định ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi (khối lƣợng/ thể tích) 41 3.2.4. Kết quả xác định ảnh hƣởng của thời gian phản ứng 42 3.2.5. Kết quả xác định ảnh hƣởng của điều kiện khuấy trộn 43
3 3.3. TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN LÀM GIÀU OMEGA-6, 7, 9 TỪ HỖN HỢP AXIT BÉO TỔNG SỐ THU ĐƢỢC BẰNG PHƢƠNG PHÁP TẠO PHỨC VỚI URÊ 44 3.3.1. Kết quả xác định ảnh hƣởng của tỷ lệ hỗn hợp TFA: urê trong quá trình làm giàu hỗn hợp axit béo 44 3.3.2. Kết quả xác định ảnh hƣởng của tỷ lệ TFA: urê: methanol trong quá trình làm giàu hỗn hợp axit béo 47 3.3.3. Kết quả xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ kết tinh trong quá trình làm giàu hỗn hợp axit béo 48 3.3.4. Kết quả nghiên cứu tăng hiệu suất thu hồi các omega-6, 7, 9 bằng việc tạo phức 2 lần với urê 49 3.4. QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ LÀM GIÀU AXIT BÉO KHÔNG NO OMEGA-6, 7, 9 TỪ SINH KHỐI VKTQH 50 3.5. KẾT QUẢ KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG DẦU SINH HỌC OMEGA-6, 7, 9 TÁCH CHIẾT ĐƢỢC SAU QUÁ TRÌNH LÀM GIÀU 54 3.5.1. Kết quả xác định chỉ tiêu cảm quan, hóa lý 54 3.5.2. Kết quả xác định thành phần axit béo 55 3.5.3. Kết quả xác định dƣ lƣợng urê, kim loại nặng 55 3.5.4. Kết quả chỉ tiêu vi sinh vật có trong dầu sinh học omega-6, 7, 9 56 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 KẾT LUẬN 58 KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC 2 PHỤ LỤC 3 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
4 MỞ ĐẦU Thực phẩm bảo vệ sức khỏe (thực phẩm chức năng) giàu omega-3, 6, 7, 9 đã đƣợc chứng minh là có vai trò rất quan trọng trong việc giảm nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch, giảm cân, tiêu hóa, giữ ẩm cho da, tóc và móng tay, giảm đau dây thần kinh, đái tháo đƣờng... Omega-3, 6, 9 có nhiều trong các loại dầu động, thực vật nhƣ dầu oliu, dầu đậu nành, dầu hạt hƣớng dƣơng, dầu cá thu, cá hồi, cá basa... Tuy nhiên, omega-7 lại rất khan hiếm trong cả giới động vật và thực vật. Chúng chủ yếu đƣợc chiết xuất từ cây hắc mai biển và dầu macadamia. Hiện nay các loài vi tảo biển hoặc các loài vi khuẩn sinh dầu có thể là nguồn nguyên liệu thay thế cho việc sản xuất các axit béo không no này. Vi khuẩn tía quang hợp (VKTQH) là một nhóm các vi sinh vật quang tự dƣỡng, phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có nhiều ứng dụng trong một số lĩnh vực nhƣ: sản xuất các chất có hoạt tính sinh học cao, sản xuất protein đơn bào làm thức ăn cho gia súc, gia cầm và nuôi trồng thuỷ sản, xử lý nƣớc thải, sản xuất phân bón sinh học... Thành phần axit béo của VKTQH không lƣu huỳnh chứa hàm lƣợng các axit béo không bão hòa một nối đôi (monounsaturated fatty acid - MUFAs) và đa nối đôi (polyunsaturated fatty acid - PUFAs) (dạng omega-3, 6, 9 và đặc biệt là omega-7) khá cao. Hàm lƣợng lipit ở VKTQH (chiếm khoảng 20 - 40% sinh khối khô – SKK) thấp hơn khi so với vi tảo. Tuy nhiên, công nghệ nuôi trồng chúng lại đơn giản hơn nhiều so với vi tảo cũng nhƣ không đòi hỏi môi trƣờng nuôi nghiêm ngặt để sản xuất axit béo. Thành phần axit béo của Rhodobacter sphaeroides có nhiều C16 - C18, thích hợp cho sản xuất diesel sinh học. Ngoài ra, thành phần axit béo từ R. sphaeroides chủ yếu bao gồm các axit béo không bão hòa, đƣợc sử dụng làm thực phẩm bổ sung vào thức ăn cho ngƣời nhƣ omega-6, 7, 9. Trong đó, axit vaccenic (C18:1, omega-7) chiếm 60% so với axit béo tổng số - total fatty acid - TFA là nguồn axit béo omega-7 chính có vai trò quan trọng trong việc duy trì sức khỏe của da và màng tế bào của ngƣời. Ngoài ra, hàm lƣợng omega-7 (C18: 1, omega-7) của các loài thuộc chi Rhodovulum cũng đạt đến 60 - 80% so với TFA.
5 Hai chủng VKTQH Rhodovulum sulfidophilum HPB.6 và R. sphaeroides VTN.2 đƣợc phân lập tại Việt Nam có các đặc điểm: sinh trƣởng mạnh (với mật độ quang đo tại bƣớc sóng 660nm - ∆OD660 >1,2); lipit tổng số cao (đạt đến 20% SKK) và hàm lƣợng omega-6, 7, 9 cao (chiếm 80% so với TFA) có tiềm năng sử dụng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe giàu omega-6, 7, 9. Tuy nhiên, hàm lƣợng axit béo cũng nhƣ hiệu suất của quá trình tách chiết các axit béo từ sinh khối VKTQH lại phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trƣờng nuôi và điều kiện tách chiết. Hiện nay chƣa có nghiên cứu về tách chiết omega trên đối tƣợng VKTQH. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện luận văn với tiêu đề “Tối ưu hóa điều kiện tách chiết và làm giàu axit béo không no omega-6, 7, 9 từ sinh khối vi khuẩn tía quang hợp”. Luận văn đƣợc thực hiện với mục tiêu và nội dung nghiên cứu nhƣ sau:  Với mục tiêu: Có đƣợc điều kiện thích hợp cho tách chiết axit béo tổng số (TFA) từ sinh khối khô VKTQH và làm giàu axit béo không no omega-6, 7, 9 bằng phƣơng pháp tạo phức với urê.  Nội dung nghiên cứu của đề tài: - Tối ƣu điều kiện của phản ứng tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH; - Tối ƣu điều kiện làm giàu omega-6, 7, 9 từ TFA thu đƣợc bằng phƣơng pháp tạo phức với urê; - Xây dựng quy trình tách chiết và làm giàu axit béo không no omega-6, 7, 9 từ sinh khối khô VKTQH; - Phân tích đánh giá chất lƣợng dầu sinh học omega-6, 7, 9 tách chiết đƣợc.
6 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ LIPID, AXIT BÉO KHÔNG NO MỘT NỐI ĐÔI (MUFAs) VÀ ĐA NỐI ĐÔI (PUFAs) (DẠNG OMEGA-6, 7, 9) 1.1.1. Giới thiệu về lipid Lipid là những hợp chất hữu cơ tự nhiên rất phổ biến trong tế bào của các cơ thể sống. Lipid trong thực phẩm có thể đƣợc cung cấp từ cả động vật và thực vật. Lipid có nguồn gốc thực vật nhƣ bơ thực vật, dầu tinh luyện, shortening, đậu nành, đậu lạc, vừng... Lipid có nguồn gốc động vật nhƣ: trứng, thịt, cá, thuỷ sản... Các lipid có nguồn gốc động vật gọi là mỡ, lipid có nguồn gốc thực vật gọi là dầu. Chúng có thành phần hoá học và cấu tạo khác nhau nhƣng có tính chất chung là không hoà tan trong nƣớc mà hoà tan trong các dung môi hữu cơ nhƣ: ether, cloroform, n-hexan, benzen… Lipid là hợp phần cấu tạo quan trọng của các màng sinh học tế bào, là nguồn cung cấp năng lƣợng (37,6.106 J/kg), nguồn cung cấp các vitamin A, D, E, F và K cho cơ thể sống [1]. Trong thực phẩm, lipid có rất nhiều loại nhƣ: phospholipid, triglycerid, cholesterol, glycolipid, lipoprotein và sáp với 2 nhóm chính là: lipid đơn giản cấu tạo bao gồm hydro (H), carbon (C), oxy (O) và lipid phức tạp có tạo phức ngoài C, H, O còn có các thành phần khác nhƣ P, S... Những hợp chất thuộc về lipid tồn tại trong tự nhiên rất đa dạng nhƣ: các hydrocacbon bậc cao, ancohol, aldehyde, axit béo và sản phẩm thứ cấp của chúng nhƣ glycerid, sáp, phospholipid, glucolipid, sulfolipid... [1]. Lipid có nhiều dạng cấu trúc khác nhau. Tuy nhiên, thƣờng có chung một nguyên tắc trong cấu trúc phân tử lipid bao gồm hai phần: một phần là các đuôi mạch hydrocarbon kị nƣớc, phần kia là tổ hợp nhóm các chất ƣa nƣớc (gọi là đầu phân cực). Cấu trúc đa dạng của lipid đƣợc bắt nguồn từ các axit béo khác nhau tham gia vào trong thành phần của nó. Cho đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện đƣợc hơn 500 axit béo khác nhau bởi mức độ và đặc điểm phân nhánh của mạch hydrocacbon, số lƣợng và vị trí các nối đôi trong mạch, vị trí và số lƣợng các nhóm chức, độ dài của mạch
7 hydrocacbon… Các axit béo có mặt trong thành phần lipid thực vật, động vật trên cạn thƣờng có từ 16 đến 20 nguyên tử cacbon trong phân tử. Trong khi ở sinh vật biển thành phần lipid đa phần chứa các axit béo mạch dài từ 20 đến 26, thậm chí đến 30 nguyên tử carbon [1]. Axit béo đƣợc chia thành axit béo bão hòa và axit béo không bão hòa. Các axit béo không bão hòa gồm axit béo không bão hoà đơn (monounsaturated fatty acid - MUFAs) có một nối đôi trong phân tử và axit béo không bão hoà đa nối đôi (polyunsaturated fatty acid - PUFAs) có hơn một nối đôi trong phân tử. 1.1.2. Giới thiệu về MUFAs và PUFAs (dạng omega-6, 7, 9) Các axit béo không bão hoà MUFA và PUFA đã đƣợc quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong lĩnh vực dinh dƣỡng và dƣợc phẩm. Đây là các axit béo không thay thế bởi cơ thể con ngƣời không thể tự tổng hợp đƣợc mà phải lấy từ thức ăn bên ngoài [2]. MUFAs và PUFAs có 3 vai trò sinh học chủ yếu. Đầu tiên là tham gia vào sự điều hoà trao đổi lipid, vận chuyển và hƣớng tới các mô. Thứ hai là tham gia vào thành phần cấu trúc nên thành tế bào. Ngoài ra, một số PUFAs còn đóng vai trò là cơ chất cho việc tổng hợp các phân tử có hoạt tính sinh học nhƣ prostaglandin, thromboxan và leukotrien [3]. Các PUFAs đƣợc chia làm 2 nhóm chính là omega-3 và omega-6. Ngoài ra, còn có omega-7, 9 [4]. Tên gọi của omega dựa vào liên kết đôi đầu tiên tại vị trí carbon. Mạch hydrocarbon có 2 đầu: một đầu là nhóm methyl và một đầu là nhóm cacboxyl. Chúng đƣợc phân loại theo vị trí của liên kết đôi đầu tiên tính từ gốc methyl hay gốc cacboxyl. Để chỉ vị trí nối đôi đầu tiên trên mạch cacbon đƣợc tính từ đầu methyl ngƣời ta có thể sử dụng ký hiệu “n” hoặc “ω”. Các liên kết đôi trong MUFA, PUFAs cũng có thể đƣợc tính từ gốc carboxyl và đƣợc ký hiệu “Δ”. Những nhóm omega-6, omega-7 hay omega-9 có liên kết đôi đầu tiên tƣơng ứng tại vị trí cacbon số 6, 7 hay 9 [2]. Các axit béo omega-6 là một họ các axit béo không no đa nối đôi, chúng có nối đôi C=C ở vị trí carbon thứ 6 tính từ đầu methyl của chuỗi axit
8 béo. Công thức chung của omega-6 là CH3(CH2)4(CH=CHCH2)x(CH2)y COOH. Các axit béo chính trong họ omega-6 là axit linoleic (AL) (C18:2, n- 6); axit gamma linoleic (GLA) (C18:3, n-6); axit eicosadienoic (C20:2, n-6); axit dihomo gamma-linoleic (DGLA) (C20:3, n-6); axit arachidonic (C20:4, n-6); axit docosadienoic (C22:2, n-6) và axit docosapetaenoic (DPA) (C22:5, n-6) [5]. Các axit béo omega-7 thuộc họ các axit béo không no có một nối đôi và đa nối đôi. Chúng có nối đôi C=C ở vị trí carbon thứ 7 tính từ đầu methyl của chuỗi axit béo. Công thức chung của omega-7 là CH3(CH2)5CH=CH(CH2)nCOOH. Các axit béo chính trong họ omega-7 là axit palmitoleic (C16:1, n-7); axit vaccenic (C18:1, n-7), axit paulinic (C20:1, n-7) và axit có 2 nối đôi là axit rumenic (C18:2n-7) [6]. Các axit béo omega-9 cũng thuộc họ các axit béo không no một nối đôi và đa nối đôi. Chúng có nối đôi C=C ở vị trí carbon thứ 9 tính từ đầu methyl của chuỗi axit béo. Công thức chung của omega-9 là CH3(CH2)7CH=CH(CH2)nCOOH . Các axit béo chính là axit oleic (C18:1, n- 9); axit elaidic (C18:1, n-9); axit gondoic (C20:1, n-9); axit mead (C20:3, n- 9); axit erucic (C22:1, n-9) và axit nervonic (C24:1, n-9) [6]. 1.1.3. Vai trò của omega-6, 7, 9 đối với sức khỏe con ngƣời Trong khoảng 3 thập kỷ gần đây, các axit béo không no một nối đôi (MUFAs) và đa nối đôi (PUFAs) đã đƣợc các nhà khoa học đặc biệt quan tâm bởi vai trò to lớn của chúng mang lại. Mặc dù omega-6, 9 có nhiều trong các loại dầu động, thực vật nhƣng omega-7 lại rất khan hiếm trong cả giới thực vật và động vật. Chúng đƣợc chiết xuất chủ yếu từ cây hắc mai biển và dầu macadamia [7]. Tác dụng của omega-6 [8] Một số nghiên cứu cho thấy uống GLA trong 6 tháng trở lên có thể làm giảm triệu chứng đau dây thần kinh, ức chế hoạt động của khối u trong các dòng tế bào ung thƣ vú và giúp giảm huyết áp cao. Thiếu omega-6 có khả năng gây loãng xƣơng. Nghiên cứu cho thấy, phụ nữ trên 65 tuổi bị loãng
9 xƣơng, khi đƣợc uống bổ sung omega-6 đã giảm bị loãng xƣơng ít nhất 3 năm so với không bổ sung chất này. Omega-6 còn có tách dụng làm đẹp da, kích thích mọc tóc, điều tiết trao đổi chất và duy trì hoạt động các hệ thống sinh sản. Tác dụng của omega-7 [9] Sử dụng omega-7 giúp cung cấp các dƣỡng chất và độ ẩm cần thiết cho da, tóc, chống lại các triệu chứng lão hoá sớm nhƣ: nếp nhăn, khô, mất độ đàn hồi, các dấu hiệu lão hoá và suy dinh dƣỡng. Omega-7 còn có tác dụng duy trì mức cholesterol khoẻ mạnh và lƣợng đƣờng trong máu, giúp cho động mạch hoạt động tốt hơn. Nghiên cứu gần đây cho thấy omega-7 có tác dụng bôi trơn các màng nhầy, cải thiện nhiều vấn đề về viêm và loét đƣờng tiêu hoá, chống táo bón và có lợi cho những ngƣời mắc bệnh khô mắt, những phụ nữ bị khô âm đạo vì nó nuôi dƣỡng và giữ ẩm cho các màng nhầy. Tác dụng của omega-9 [10] Omega-9 có tác dụng giảm cholesterol xấu, giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch, giảm xơ cứng động mạch, giúp tăng cƣờng hệ miễn dịch và ổn định lƣợng đƣờng trong máu. Sự tiêu thụ các PUFAs đƣợc khuyến cáo ở mức trung bình khoảng 6% tổng năng lƣợng và không vƣợt quá 10%. Trong đó, nên giảm hàm lƣợng các axit béo bão hoà và chỉ nên duy trì ở mức 8-10% tổng năng lƣợng hấp thụ. Để giảm nguy cơ các bệnh kinh niên thì hàm lƣợng PUFAs mạch dài (DHA - Docosahexaenoic acid, EPA - Eicosapentaenoic acid, DPA) nên d ng là 610 mg ngày đối với đàn ông và 430 mg ngày đối với phụ nữ. Và tỷ lệ omega-6 với omega-3 PUFA nằm giữa 5:1 và 3:1 là tối ƣu cho con ngƣời [8]. 1.1.3. Các nguồn cung cấp omega-6, 7, 9 Nguồn cung cấp các axit béo omega trong tự nhiên rất phong phú và đa dạng, nhiều nghiên cứu về tách chiết các axit béo có nguồn gốc động vật, thực vật và đặc biệt là vi sinh vật đã đƣợc các nhà khoa học quan tâm trong vài năm trở lại đây. 1.1.3.1. Từ động, thực vật
10 Nguồn cung cấp omega-6 trong tự nhiên khá phong phú, chúng đƣợc tìm thấy trong hầu hết các loại dầu thực vật nhƣ: dầu bắp, dầu hạt bông vải, dầu hạt nho, dầu mè, dầu đậu nành, dầu hoa hƣớng dƣơng, dầu hoa anh thảo, dầu lý chua đen. Omega-6 còn đƣợc tìm thấy trong các loại gia cầm, trứng gà, trong mỡ, trong bơ, lúa mì cứng, ngũ cốc nguyên hạt, bánh mỳ và đặc biệt từ Tảo xoắn Spirunila platensis [11]. Không giống nhƣ các omega khác, nguồn cung cấp omega-7 rất hiếm ở cả trong giới thực vật và giới động vật. Chúng đƣợc cung cấp từ dầu cá (các loài cá nƣớc lạnh nhƣ cá hồi, cá ngừ, cá mòi, cá thu), một số loại dầu động vật và thực vật nhƣ macadamia (Macadamia integrifolia), chủ yếu là cây hắc mai biển (Hippophae rhamnoides) và một lƣợng nhỏ trong quả bơ. Hai axit béo omega-7 thƣờng gặp trong tự nhiên là axit palmitoleic (C16:1(n-7)) và axit vaccenic (C18:1(n-7)) đƣợc phát hiện năm 1928 trong mỡ động vật và quả bơ [12]. Nguồn cung cấp omega-9 là dầu oliu, dầu macadamia, cây hồng hoa, dầu hoa hƣớng dƣơng, quả bơ, quả hạnh nhân, hạt điều, óc chó, hạt mắc ca, đậu phộng, quả hồ đào, hồ trăn, hạt cải và cây đinh hƣơng… [10]. Dầu thực vật chỉ chứa các axit béo không bão hoà có mạch carbon  18 (C18:1; C18:2; C18:3) và chủ yếu là mạch thẳng. Trong các loại dầu thực vật (dầu lanh, canola và đậu tƣơng) chứa PUFAs chủ yếu là axit -linolenic (ALA). Các loại dầu khác (dầu bắp, dầu hạt bông vải, dầu nho) chứa chủ yếu là các PUFAs omega-6. Các loại axit béo có số carbon  20 và 22 chủ yếu thu đƣợc từ nguồn cá biển. Nguồn cung cấp PUFAs là các loài cá nhiều mỡ nhƣ: cá trích, cá thu, cá sardine, cá hồi, cá basa và saba. Dầu cá biển thực tế là một hỗn hợp phức tạp các axit béo có chiều dài mạch carbon và mức độ bão hoà rất khác nhau. Do vậy, việc tinh sạch chúng là khó khăn và đòi hỏi chi phí tốn kém trƣớc khi có thể sử dụng chúng vào các mục đích khác nhau cũng nhƣ nâng cao giá trị sử dụng các sản phẩm tạo ra so với giá trị ban đầu [13]. 1.1.3.2. Từ vi sinh vật
11 Mặc d động vật có vú và cá biển có một số khả năng nào đó trong việc sinh tổng hợp các axit béo (MUFAs và PUFAs), nhƣng phần lớn chúng lại có nguồn gốc từ chế độ ăn. Cá sử dụng sinh vật ph du nhƣ vi khuẩn, nấm bậc thấp, vi tảo và động vật nguyên sinh làm thức ăn. Những sinh vật này từ lâu đã đƣợc biết đến là những sinh vật sản xuất sơ cấp trong chuỗi thức ăn ở biển và đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp MUFAs và PUFAs sơ cấp [14]. Cá biển là nguồn cung cấp nguyên liệu truyền thống để sản xuất axit béo. Tuy nhiên, nguồn cung cấp này không ổn định do mùa vụ khai thác, vị trí địa lý và phụ thuộc vào từng loài cá. Hơn thế nữa dầu cá chứa nhiều cholesterol và có mùi vị khó chịu. Do đó, cần có nguồn nguyên liệu để sản xuất axit béo. Các vi sinh vật bao gồm (nấm, vi khuẩn, tảo biển…) là các nguồn tiềm năng cho việc sản xuất axit béo này. Vi tảo biển hoặc các loài vi khuẩn chứa dầu có thể thay thế dầu cá trong việc cung cấp các axit béo. Việc sản xuất các axit béo bằng vi sinh vật sẽ đƣợc phát triển trong những năm tới do chúng có một số thuận lợi sau: có thể sản xuất đƣợc dầu quanh năm; không phụ thuộc vào mùa vụ và có thể kiểm soát tốt mọi thông số cần thiết trong suốt quá trình nuôi cấy. So với dầu cá, dầu vi sinh vật thƣờng chứa hàm lƣợng cao các axit béo mong muốn và do thành phần cấu tạo lipid, việc tinh sạch axit béo không no thƣờng rất dễ dàng [4]. Tuy nhiên, điều kiện quyết định để sản xuất axit béo là phải lựa chọn đƣợc các loài vi sinh vật thích hợp, phải có phƣơng pháp nuôi trồng tối ƣu cũng nhƣ quy trình công nghệ tách chiết và làm sạch axit béo rẻ tiền và hiệu quả [15]. Hiện nay, các loài vi tảo biển quang tự dƣỡng chứa hàm lƣợng PUFAs cao đều đƣợc sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản. Ví dụ: tảo silic, Cryptomonads và Eustigmatophytes giàu một hoặc cả hai EPA và DHA (chiếm 5-35% so với TFA); Eustigmatophytes (Nannochloropsis spp.) có phần trăm axit arachidonic (ARA) cao nhất (0-4% so với TFA); Prasinophytes (4-10% so với TFA) [16]. Việc sản xuất PUFAs thƣơng mại bằng vi tảo biển dị dƣỡng đang đƣợc quan tâm nghiên cứu và phát triển với một số thuận lợi chính đó là: có thể duy
12 trì đƣợc các điều kiện nuôi trồng tối ƣu và giảm tạp nhiễm [17]; sản xuất dầu có thể đƣợc tiến hành quanh năm, không phụ thuộc vào mùa hay khí hậu; quá trình nuôi trồng có thể kiểm soát và đảm bảo đƣợc chất lƣợng sản phẩm nhƣ mong muốn; mật độ tế bào tảo cao, có thể lên tới trên 100g khô/lít; có thể sử dụng các kỹ thuật lên men hiện đại đang đƣợc sử dụng rộng rãi cho việc nuôi trồng các vi tảo biển dị dƣỡng [4]. Việc vi khuẩn có khả năng tổng hợp MUFAs, PUFAs đã đƣợc nghiên cứu trong khoảng 20 năm trở về trƣớc. Tuy nhiên, trong thời gian này ngƣời ta chƣa thực sự quan tâm nhiều đến lĩnh vực sinh thái biển và hoá sinh biển [18]. Theo thống kê thì 30% các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp PUFAs đƣợc phân lập từ những vùng có khí hậu lạnh nhƣ v ng biển sâu và vùng Nam Cực. Chúng bao gồm các thành viên của nhóm γ-Proteobacteria và tổ hợp của các nhóm Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides. Hầu hết các chủng có khả năng tổng hợp PUFAs là ƣa lạnh (cần nhiệt độ thấp cho sinh trƣởng) và ƣa mặn (cần muối cho sinh trƣởng) [19]. David và cộng sự (1993) đã phân lập đƣợc 38 chủng vi khuẩn ở vùng Nam Cực và sàng lọc chúng cho mục đích tổng hợp PUFAs. Trong số 38 chủng vi khuẩn này có 5 chủng có khả năng tổng hợp đƣợc EPA (các chủng này có tổng axit béo từ dạng vết đến 3,3%. 13 chủng có khả năng tổng hợp PUFAs (C18:26, C18:33, C18:43, C18:46) (các chủng này có tổng axit béo từ dạng vết đến 7,0%). Từ đó đến nay có rất nhiều các loài vi khuẩn biển đã đƣợc công bố về khả năng tổng hợp axit béo, điển hình là các chi: Pseudomonas, Vibrio, Shewanella, Colwellia; Moritella; Psychromonas... phân lập từ biển đã đƣợc chứng minh là có khả năng tổng hợp PUFAs [20]. Ngoài các nhóm vi khuẩn kể trên, VKTQH cũng đã đƣợc chứng minh là có khả năng tổng hợp đƣợc axit béo không no (mà đặc biệt là axit béo không no một nối đôi – omega-7 (axit vaccenic) với làm lƣợng rất cao chiếm 65-82% so với TFA) [21, 22]. Ngoài ra, một số loài VKTQH còn có khả năng tổng hợp PUFAs và thậm chí còn có loài tổng hợp đƣợc cả HUFAs - highly unsaturated fatty acid (EPA và DHA) [23]. Các loài có khả năng tổng hợp axit béo không no điển hình thuộc các chi: Rhodovulum (với một số loài nhƣ R.
13 strictum, R. sulfidophilum, R. adriaticum, R. euryhalinum; R. tesquicola); Rhodobacter marinus; Rhodopseudomonas palustris; Rhodobacter viridis. 1.2. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP (VKTQH) 1.2.1. Định nghĩa Vi khuẩn quang hợp là nhóm vi sinh vật tiền nhân có khả năng tiến hành quang hợp nhƣng không thải oxy nhƣ vi khuẩn lam. Khi đƣợc chiếu sáng, rất nhiều loài trong nhóm này có khả năng sinh trƣởng quang tự dƣỡng với CO2 là nguồn carbon hoặc sinh trƣởng quang dị dƣỡng với các chất hữu cơ làm nguồn carbon. Đặc trƣng của nhóm vi khuẩn quang hợp này là chứa sắc tố quang hợp bacteriochlorophyll (Bchl) và nguồn cho điện tử trong quá trình quang hợp không phải là nƣớc (nhƣ những đối tƣợng quang dƣỡng khác) mà là các hợp chất khác nhau nhƣ: lƣu huỳnh, các hợp chất khử của lƣu huỳnh, hydro phân tử hoặc các hợp chất hữu cơ đơn giản nhƣ các axit hữu cơ, đƣờng và rƣợu [24]. Theo Hệ thống phân loại của Bergey (1989), vi khuẩn quang hợp đƣợc chia làm ba nhóm: vi khuẩn tía quang hợp, vi khuẩn xanh quang hợp và nhóm vi khuẩn chứa bacteriochlorophyll (Bchl) (nhƣng không xếp vào hai nhóm trên) [25]. Riêng nhóm VKTQH đƣợc chia làm 3 họ:  Họ Chromatiaceae: gồm tất cả các vi khuẩn lƣu huỳnh màu tía có khả năng hình thành “giọt” lƣu huỳnh bên trong tế bào.  Họ Ectothiorhodospiraceae: gồm tất cả các vi khuẩn lƣu huỳnh màu tía có khả năng hình thành “giọt” lƣu huỳnh bên ngoài tế bào.  Họ Rhodospirilaceae: gồm tất cả các vi khuẩn quang hợp không tích lũy giọt lƣu huỳnh Tuy nhiên, theo Hệ thống phân loại của Bergey 2001 [26], VKTQH lại đƣợc chia thành 3 nhóm:  “Alphaproteobacteria” gồm nhóm vi khuẩn tía không lƣu huỳnh và vi khuẩn tía hiếu khí