Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa cho protein azurin từ một số chủng Pseudomonas aeruginosa

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:52

Thêm vào BST

Báo xấu

30
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa cho protein azurin từ một số chủng Pseudomonas aeruginosa được thực hiện với mục tiêu nhằm tách dòng gen mã hóa protein azurin từ chủng P. aeruginosa để tiến hành tạo protein azurin tái tổ hợp ứng dụng trong ức chế tế bào ung thư vú. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa cho protein azurin từ một số chủng Pseudomonas aeruginosa

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LA THỊ SINH NHÂN DÒNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA PROTEIN AZURIN TỪ MỘT SỐ CHỦNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên, 2020
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LA THỊ SINH NHÂN DÒNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA PROTEIN AZURIN TỪ MỘT SỐ CHỦNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 8 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS. Trịnh Đình Khá Thái Nguyên, 2020
i LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các Thầy Cô, bạn bè và người thân. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo – QLKH&HTQT, Khoa Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi trong qua trình học tập. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trịnh Đình Khá, người Thầy đã tận tình chỉ bảo và cung cấp cho tôi những kiến thức quý báu về phương pháp nghiên cứu cũng như kiến thức chuyên ngành. Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô trong Hội đồng chấm luận văn đã đóng góp cho tôi nhiều ý kiến quý báu, đã đánh giá và ghi nhận sự nỗ lực của tôi trong học tập. Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp bộ Giáo dục và Đào tạo “Nghiên cứu tạo chủng Escherichia coli sản xuất protein Azurin có hoạt tính ức chế tế bào ung thư vú”, mã số B2019-TNA-16. Thái nguyên, tháng 10 năm 2020 Học viên La Thị Sinh
ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT............................................................................ iv DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................................... v DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................... vi MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về protein azurin ................................. 3 1.2. Tình hình nghiên cứu protein azurin tại Việt Nam..................................... 6 1.3. Khái quát về trực khuẩn mủ xanh (P. aeruginosa) .................................... 7 1.3.1. Các tính chất sinh học chính ....................................................................... 7 1.3.2. Các yếu tố độc lực .................................................................................... 10 1.3.3. Sức đề kháng............................................................................................. 12 1.3.4. Dịch tễ học ................................................................................................ 12 1.4. Tổng quan về protein azurin ..................................................................... 13 1.4.1. Sơ lược về protein azurin .......................................................................... 13 1.4.2. Cấu trúc của gen azurin ............................................................................ 14 1.4.3. Khả năng chống ung thư ........................................................................... 16 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 21 2.1. Vật liệu, trang thiết bị, dụng cụ nghiên cứu ............................................. 21 2.1.1. Chủng vi sinh vật và plasmid ................................................................... 21 2.1.2. Thiết bị dụng cụ và hóa chất ..................................................................... 21 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu............................................................. 23 2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 23 2.3.1. Nuôi cấy vi sinh vật .................................................................................. 23 2.3.2. Tách chiết ADN tổng số của vi khuẩn...................................................... 23 2.3.3. Điện di trên gel argarose ........................................................................... 24
iii 2.3.4. PCR phân lập gen azurin .......................................................................... 24 2.3.5. Phương pháp tạo dòng gen ....................................................................... 25 2.3.6. Phương pháp giải trình tự gen .................................................................. 26 2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................ 28 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 29 3.1. Tách chiết DNA tổng số của chủng Pseudomonas ...................................... 29 3.2. Phân lập gen azurin ...................................................................................... 30 3.3. Gắn gen vào vector nhân dòng và chọn dòng .............................................. 30 3.4. Phân tích trình tự gen azurin ........................................................................ 32 3.4.1. Phân tích trình tự gen azurin của chủng VTCC-B-657 ............................ 32 3.4.2. Phân tích trình tự gen azurin của chủng QN1 ........................................... 34 3.4.3. So sánh trình tự amino acid suy diễn ........................................................ 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 38 1. Kết luận ........................................................................................................... 38 2. Đề nghị ............................................................................................................ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 39
iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ 1 DNA Deoxyribonucleic Acid 2 dNTP Deoxyribonucleic triphosphate 3 EDTA Ethylen Diamin Tetraacetic Acid 4 ETA Exotoxin A 5 HIV Human Immunodeficiency Virus 6 kDa Kilo Dalton 7 LB Luria and Bertani 8 PCR Polymerase Chain Reaction 9 PTD Miền tải nạp protein 10 TAE Tris – Acetic acid - EDTA 11 P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa 12 NXB Nhà xuất bản
v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Các thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm ....................................... 21 Bảng 2.2. Các dung dịch và đệm sử dụng ........................................................... 22 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR ................................................................. 24 Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR ........................................................ 25
vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. 1 Cấu trúc của protein azurin ........................................................ 15 Hình 1.2 Cơ chế azurin gây ra quá trình apoptosis và ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư ở người. ..................................................................... 17 Hình 2.1. Cấu trúc vector tách dòng pTZ57R/T ......................................... 26 Hình 2.2. Hình ảnh mô tả quá trình giải trình tự thế hệ mới theo nguyên lý Sanger sử dụng các ddNTP có đánh dấu huỳnh quang........................... 28 Hình 3.1. Hình ảnh điện di DNA tổng số của các chủng nghiên cứu ......... 29 Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen azurin ...................... 30 Hình 3.3. Hình ảnh điện di plasmid tách chiết từ các khuẩn lạc sau biến nạp ........................................................................................................... 31 Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt .................................................... 32 Hình 3.5. Trình tự gen azurin của chủng P. aeruginosa VTCC-B-657...... 33 Hình 3.6. Hình ảnh kết quả so sánh trình tự gen azurin của chủng P. aeruginosa VTCC-B-657 trên phần mềm Blast ..................................... 33 Hình 3.7. Trình tự gen azurin của chủng QN1. .......................................... 34 Hình 3.8. Hình ảnh kết quả so sánh trình tự gen azurin của chủng P. aeruginosa QN1 trên phần mềm Blast.................................................... 35 Hình 3.9. So sánh trình tự nucleotide của gen azurin chủng VTCC-B-657, chủng QN1 với trình tự gen azurin của P. aeruginosa mã số M30389 trên GenBank.................................................................................................. 35 Hình 3.10. So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein azurin chủng VTCC-B-657, chủng QN1 với trình tự amino acid của P. aeruginosa mã số M30389 trên GenBank ....................................................................... 37
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Hiện nay, bệnh ung thư và sức khoẻ cộng đồng là những vấn đề ngày càng được quan tâm ở hầu hết các quốc gia trên thế giới. Bởi lẽ, ung thư là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở các nước kinh tế phát triển và là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ hai ở các nước đang phát triển [27]. Theo WHO, năm 2008 thế giới có 12,6 triệu người mắc ung thư, trong đó có 7,5 triệu người tử vong. Năm 2015, có khoảng 90,5 triệu người bị ung thư. Mỗi năm có 14,1 triệu ca mắc mới, trong đó tử vong 8,8 triệu ca (15,7%). Ở Mỹ và các nước phát triển tử vong do ung thư chiếm khoảng 25% và hàng năm có khoảng 0,5% dân số được chẩn đoán ung thư [6], [20]. Tính đến năm 2018, ước tính trên toàn thế giới có khoảng 18,1 triệu trường hợp ung thư mới (17 triệu không bao gồm ung thư da không phải u ác tính) và 9,6 triệu ca tử vong do ung thư (9,5 triệu không bao gồm ung thư da không hắc tố) [18]. Việt Nam cũng là một trong số nước có tỉ lệ mắc ung thư cao trên thế giới, WHO xếp Việt Nam nằm trong 50 nước thuộc top 2 của bản đồ ung thư (50 nước cao nhất thuộc top 1). Mỗi năm có khoảng 115.000 người chết vì ung thư, tương ứng 315 người/ngày. Trong đó, ung thư vú với tỷ lệ mắc là 15.000 ca/năm. Tỷ lệ tử vong 35% và 70% người bệnh đến khám ở giai đoạn muộn [6]. Hiện nay, phương pháp điều trị ung thư chủ yếu sử dụng phương pháp hóa trị, xạ trị và phẫu thuật. Các liệu pháp điều trị ung thư mới đang được các nhà khoa học nghiên cứu. Trong đó những hoạt chất sinh học từ thực vật, vi sinh vật đang được quan tâm nghiên cứu. Trên thế giới các nghiên cứu được chứng minh hoạt tính chống ung thư giữa azurin và exotoxin A (ETA) từ Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), Pep27anal2 từ Streptococcus pneumoniae, độc tố bạch hầu từ Corynebacterium diphtheriae, và gần đây đã phát hiện Entap từ Enterococcus sp. [29]. Các chất này ngăn chặn quá trình tổng hợp protein và gây ra quá trình tự chết ở tế bào ung thư. Vào năm 2012, các nhà khoa học Trung Quốc đã nghiên cứu đặc tính nhắm mục
2 tiêu khối u của E. coli Nissle 1917 để ức chế khối u ác tính B16 ở chuột và khối u vú 4T1 thông qua sự biểu hiện của protein azurin. Kết quả của họ đã chứng minh được rằng sự phát triển khối u ác tính B16 và khối u vú 4T1 trực tiếp được hạn chế đáng kể và di căn phổi đã được ngăn chặn ở những con chuột có khả năng miễn dịch [51]. Việc nghiên cứu tách chọn dòng, biểu hiện và tinh sạch protein azurin sẽ giúp con người có thể tiến đến gần việc nghiên cứu điều trị ung thư một cách hiệu quả và không gây hại đến các tế bào bình thường khác. Bởi lẽ, sản phẩm protein azurin từ chủng P. aeruginosa đã được chứng minh là có khả năng đặc biệt nhắm vào các tế bào ung thư mà không gây bất kỳ tác động có hại nào đến các tế bào bình thường [43]. Ở Việt Nam, những nghiên cứu về azurin và gen mã hóa azurin chưa có công bố. Chính vì vậy, tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa cho protein azurin từ một số chủng P. aeruginosa”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Tách dòng gen mã hóa protein azurin từ chủng P. aeruginosa để tiến hành tạo protein azurin tái tổ hợp ứng dụng trong ức chế tế bào ung thư vú. 3. Nội dung nghiên cứu  Tuyển chọn chủng P. aeruginosa mang gen mã hóa azurin.  Tách dòng gen mã hóa protein azurin từ chủng đã tuyển chọn.  Phân tích trình tự gen mã hóa cho protein azurin.
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về protein azurin Để giảm thiểu những nguy cơ một cách tối đa cho bệnh nhân, các nhà khoa học đã nghiên cứu và có những kết quả bước đầu về những phương pháp điều trị ung thư mới, tuy nhiên những phương pháp này cũng còn nhiều hạn chế. Như liệu pháp miễn dịch ung thư là một phương pháp điều trị sáng tạo đầy hứa hẹn cho nhiều dạng ung thư, đặc biệt là u ác tính. Mặc dù liệu pháp miễn dịch đã được chứng minh là có hiệu quả, tỷ lệ đáp ứng của bệnh nhân khác nhau và chỉ một nhóm nhỏ bệnh nhân trong một nhóm lớn đáp ứng tốt với điều trị [40]. Hay như một số cuộc điều tra đã được thiết kế để nghiên cứu tác dụng chống ung thư tiềm năng của chiết xuất vi tảo, trong đó họ chủ yếu kết luận khả năng gây chết tế bào ung thư apoptotic thông qua các con đường độc lập hoặc phụ thuộc caspase [9]. Hay Nanomedicine, một công nghệ thay thế đầy hứa hẹn cho phép tích tụ có chọn lọc các chất hóa trị liệu được quản lý một cách có hệ thống trong các mô khối u thông qua tác dụng tăng cường tính thấm và lưu giữ (EPR) do khối u bị rò rỉ mạch máu và dẫn lưu bạch huyết kém. Tuy nhiên hiệu quả điều trị bị ảnh hưởng bởi thời gian lưu thông của các thuốc nano này trong máu, tương tác giữa các hạt nano và protein sau khi sử dụng và sự tương tác phức tạp tại môi trường vi mô khối u quanh mạch (TME) do sự hiện diện của nhiều các quá trình sinh học [21]. Việc sử dụng một số peptit tổng hợp được thiết kế để tối ưu hóa các đặc tính kháng sinh và chống khối u cũng như cải thiện khả năng điều trị, chúng có ưu điểm độc đáo của peptit, chẳng hạn như trọng lượng phân tử thấp, khả năng nhắm mục tiêu cụ thể vào tế bào khối u và độc tính thấp trong các mô bình thường. Tuy nhiên, các peptit trị liệu có một số nhược điểm đáng kể liên quan đến tính ổn định và thời gian bán hủy ngắn của chúng [34], [47], [45]. Azurin, một protein oxy hóa khử chống ung thư mạnh được tiết ra bởi các loài P. aeruginosa đã được báo cáo là có hoạt tính chống lại các dòng tế bào ung thư vú. Azurin là một protein oxy hóa khử trọng lượng phân tử thấp, là một trong những sản phẩm vi khuẩn tiêu biểu được sử dụng trong điều trị khối u, điều này
4 đã thúc đẩy các nhà nghiên cứu tìm kiếm các phương pháp mới để tăng cường sản xuất protein này. Trong một nghiên cứu năm 2010, P. aeruginosa đã được phân lập từ phổi của bệnh nhân xơ nang ở Ai Cập và được xác định bằng rRNA 16S. Gen azurin được khuếch đại bằng chương trình PCR thích hợp. Gen được nhân bản thành vectơ dễ dàng pGEM-T và được giải trình tự. Sau đó được nhân dòng vào vectơ biểu hiện quá mức pET-28a (+) bằng cách sử dụng vi khuẩn E. coli BL21 làm vi khuẩn biểu hiện. Protein tái tổ hợp được tinh chế bằng cách tinh chế một bước sử dụng nhựa Ni++. Kết quả cho thấy azurin ức chế mạnh sự tăng sinh của cả dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết và dòng tế bào ung thư vú. Đồng thời, azurin không cho thấy bất kỳ ảnh hưởng nào đến tế bào hắc tố bình thường của con người [38], [35]. Một nghiên cứu khác, tại Bệnh viện Đại học Mansoura đã phân lập 95 chủng P. aeruginosa từ bệnh nhân nội trú và bệnh nhân ngoại trú đã tham dự các phòng khám tại Bệnh viện Đại học Mansoura. Kết quả nghiên cứu cho thấy azurin từ các phân lập địa phương khác nhau của P. aeruginosa đã phát huy tác dụng gây độc tế bào có thể nhìn thấy trên dòng tế bào MCF-7 của ung thư vú [50]. Năm 2011, thì một nhóm nhà khoa học đã sử dụng các protein azurin từ các loài Pseudomonas khác nhau được phân tích để phân tích cấu trúc sinh lý sơ cấp, thứ cấp và mối quan hệ phát sinh loài của chúng. Nghiên cứu này chỉ ra rằng thành phần axit amin, trọng lượng phân tử khác nhau giữa protein azurin. Phân tích phát sinh loài cho thấy rằng protein azurin của các loài Pseudomonas khác nhau có tổ tiên chung, có quan hệ họ hàng chặt chẽ với nhau và các trình tự được bảo tồn cao [28]. Trong một nghiên cứu khác cũng vào năm 2011, một nhóm nhà khoa học đã sử dụng các phương pháp tùy chỉnh để tập trung vào việc tổng hợp azurin từ các chủng P. aeruginosa khác nhau với sự đồng nhất rõ ràng. Họ đã sàng lọc sự phát triển của các chủng P. aeruginosa khác nhau (1934, 741, 2453 và 1942) để tổng hợp azurin và tăng cường sản xuất azurin. Và cho thấy các đặc tính của azurin bằng cách sử dụng giải hấp thụ/ion hóa laser được hỗ trợ bởi ma trận, natri dodecyl sulfat điện di trên gel polyacrylamide và quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier. Kết quả cho thấy 2453 là chủng tiết ra nhiều azurin nhất và cho thấy sự chết rụng
5 đáng kể ở các tế bào ung thư biểu mô vú như T-47D và ZR-75-1. Nghiên cứu này chứng minh các phương pháp tùy chỉnh để tổng hợp azurin từ các chủng P. aeruginosa khác nhau với tính đồng nhất rõ ràng và tác động tự chết của chúng trên các tế bào ung thư biểu mô vú với các cơ chế phân tử có thể có và các loại oxy phản ứng [38]. Trong một nghiên cứu của các nhà khoa học Mỹ và Ý, đã báo cáo về hoạt động chống khối u của p28 (một đoạn peptid của azurin) phát sinh từ sự ổn định sau dịch mã của chất ức chế khối u p53 thường được điều chỉnh giảm bởi sự liên kết của một số ligase ubiquitin. Điều này đòi hỏi p28 phải liên kết đặc biệt với p53 để ức chế các ligase cụ thể bắt đầu phân hủy qua trung gian proteosome. Trong nghiên cứu này, quang phổ lực nguyên tử, một phương pháp tiếp cận công nghệ nano, được sử dụng để khảo sát tương tác của p28 với p53 có chiều dài đầy đủ và các miền cô lập của nó ở cấp độ phân tử đơn lẻ. Phân tích các lực không liên kết và hằng số tốc độ phân ly cho thấy rằng p28 tạo thành một phức bền vững với vùng liên kết DNA của p53, ức chế sự liên kết của các ligase ubiquitin khác với Mdm2 để giảm sự phân hủy protein của p53 [39]. Nghiên cứu khác tại Bồ Đào Nha đã báo cáo rằng, azurin nhắm mục tiêu P- cadherin biểu hiện quá mức của bệnh ung thư vú, chống lại tác dụng xâm lấn của nó. P-cadherin biểu hiện quá mức xảy ra ở khoảng 30% của ung thư biểu mô tuyến vú đại diện cho một trong những loại ung thư vú nguy hiểm nhất [11]. Năm 2015, tại Đại học Calicut Ấn Độ đã thực hiện phân lập gen azurin sản xuất các chủng P. aeruginosa bản địa và xác nhận sự hiện diện của nó bằng kỹ thuật phân tử. Trong số 10 mẫu được chọn cho nghiên cứu này, 8 mẫu cho thấy sự hiện diện của gen azurin bằng cách sử dụng cặp mồi oligonucleotide cụ thể trong PCR gradient, khuếch đại một đoạn DNA 545 bp đơn đặc trưng của gen azurin. Tổng số protein tế bào chiết xuất được phân tích bằng điện di trên gel SDS- Polyacrylamide, có nhiều dải băng bao gồm một dải tương ứng với trọng lượng phân tử 14 KD trong tất cả 8 mẫu được chọn từ PCR [42]. Gần đây nhất vào năm 2018, Sarwar và Fahim tại Đại học BRAC đã tiến hành với 25 chủng phân lập trong môi trường (đất) mục đích là phân lập azurin sản xuất Pseudomonas spp bản
6 địa cùng với việc xác nhận sự hiện diện của azurin bằng kỹ thuật phân tử. Họ sử dụng cặp mồi oligonucleotide cụ thể (AZU-F và AZU-R) trong PCR gradient. Kết quả là trong số 25 chủng phân lập, 10 chủng cho thấy sự hiện diện của gen azurin bằng cách khuếch đại một đoạn DNA 545 bp duy nhất trong PCR. Việc phát hiện ra các chủng vi sinh vật sản xuất azurin có năng suất cao có thể dẫn chúng ta đến việc phát triển các loại thuốc chống ung thư [41]. 1.2. Tình hình nghiên cứu protein azurin tại Việt Nam Nghiên cứu đầu tiên là của nhóm nghiên cứu vật lý lý thuyết, Đại học Tôn Đức Thắng thành phố Hồ Chí Minh đã đưa ra giả thuyết rằng vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn đồng loại cư trú lâu dài trong cơ thể người có thể tạo ra protein giống azurin như một vũ khí chống lại sự xâm nhập của bệnh ung thư. Trong nghiên cứu trước đây của họ, các vi khuẩn giả định đã được sàng lọc từ các bộ gen hoàn chỉnh của 66 loài vi khuẩn ưu thế trong hệ vi sinh vật đường ruột của con người và sau đó được đặc trưng bằng cách coi chúng như các thuật toán chú thích chức năng với azurin làm đối chứng. Họ đã dự đoán định tính 14 loại vi khuẩn giả định sở hữu các đặc tính chức năng rất giống với azurin. Trong công việc này, họ thực hiện một số phân tích định lượng và dựa trên cấu trúc bao gồm tính toán tỷ lệ phần trăm kỵ nước, mô hình cấu trúc, và nghiên cứu gắn kết phân tử về vi khuẩn quan tâm chống lại protein p53, một mục tiêu ung thư. Cuối cùng, họ đã xác định được 8 vi khuẩn giả định liên kết p53 theo cách tương tự như p28-azurin và azurin, trong đó 3 peptit (p1seq16, p2seq20 và p3seq24) được chỉ ra từ nghiên cứu trước đây của họ và 5 peptit mới (p1seq09, p2seq05, p2seq08, p3seq02 và p3seq17) được phát hiện lần đầu tiên [36]. Sau đó vào tháng 12 năm 2019, tác giả Nguyễn Duy cùng một nhóm nhà khoa học khác đã thực hiện một nghiên cứu khác với mục đích cải thiện quy trình sàng lọc và đánh giá tính đa dạng di truyền của gen azurin ở P. aeruginosa và gen giống azurin trong hệ vi sinh vật đường ruột của một quần thể cụ thể ở Việt Nam và quần thể toàn cầu. Kết quả là, nghiên cứu này đã tối ưu hóa thành công nhiệt độ ủ để khuếch đại DNA nhằm sàng lọc các gen azurin và áp dụng cho các gen giống azurin từ hệ vi sinh vật đường ruột của con người; là nghiên cứu đầu tiên phân loại gen azurin thành 5 kiểu gen khác
7 nhau ở quy mô toàn cầu và xác nhận hoạt động chống ung thư tiềm năng của 3 protein tổng hợp giống azurin (Cnazu1, Dlazu11 và Ruazu12). Các kết quả đóng góp cho sự phát triển thủ tục được áp dụng để sàng lọc các protein chống ung thư từ microbiome của con người và sự hiểu biết toàn diện về đáp ứng trị liệu của chúng ở cấp độ di truyền [37]. Các nghiên cứu tại Việt Nam chỉ dừng lại ở việc phân lập sàng lọc và phân loại. Ngoài ra, đến thời điểm hiện nay chưa có công bố nào về nhân dòng và biểu hiện gen azurin và sử dụng azurin như một phương pháp điều trị ung thư. 1.3. Khái quát về trực khuẩn mủ xanh (P. aeruginosa) Trực khuẩn mủ xanh được tìm thấy trong đất, nước, hệ vi sinh vật da và hầu hết các môi trường nhân tạo trên khắp thế giới. Nó phát triển mạnh không chỉ trong môi trường bình thường, mà cả trong khí quyển oxy thấp, do đó đã xâm chiếm nhiều môi trường tự nhiên và nhân tạo [17]. 1.3.1. Các tính chất sinh học chính 1.3.1.1. Hình thái tính chất bắt màu Là trực khuẩn thẳng hoặc hơi cong (không xoắn), hai đầu tròn, nhỏ, đứng riêng lẻ, thành đôi và có khi xếp thành chuỗi. Bắt màu Gram âm. Di động nhờ một lông duy nhất ở một cực. Có các pili, là nơi tiếp nhận page và giúp vi khuẩn bám dính vào cơ thể vật chủ. Không có khả năng sinh nha bào [7], [1]. 1.3.1.2. Về tính chất nuôi cấy Là trực khuẩn hiếu khí tuyệt đối. Mọc dễ trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Có thể mọc trong khoảng nhiệt độ 5-420C, tối ưu ở 370C; pH từ 4,5-9,0; tối ưu ở pH 7,2-7,5. Trên môi trường đặc khuẩn lạc có thể dạng S (thường gặp khi nuôi cấy từ bệnh phẩm lâm sàng), dạng M hoặc R. Sinh sắc tố là tính chất đặc trưng của trực khuẩn mủ xanh. Có hai loại sắc tố chính: - Pyocyanin: khi nuôi cấy trên môi trường aka King A sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn tiết ra sắc tố này, sắc tố có màu xanh lá cây, tan trong nước và chloroform, sắc tố này làm cho mủ và môi trường nuôi cấy có màu xanh.
8 - Pyoverdins: khi nuôi cấy trên môi trường aka King B, sắc tố có màu vàng – lục, là sắc tố huỳnh quang, phát xanh khi chiếu tia cực tím, dễ mất trong môi trường nuôi cấy không chuẩn. Ngoài ra còn có hai loại sắc tố thứ yếu khác đó là: Pyorubin và Pyomelanin. - Pyorubrin: sắc tố màu hồng nhạt, chỉ 1% số chủng trực khuẩn mủ xanh sinh ra sắc tố này. - Pyomelanin: sắc tố màu nâu đen, chỉ 1- 2% số chủng trực khuẩn mủ xanh sinh sắc tố này. Có khoảng 5-10% số chủng trực khuẩn mủ xanh không sinh sắc tố. Có vẻ như việc tiếp xúc lâu dài với các tác nhân khác cũng như sulfathiazole có thể khích thích sự phát triển của các biến thể sắc tố [7], [1], [8], [5], [26]. 1.3.1.3. Tính chất sinh hóa Trực khuẩn mủ xanh có oxydase dương tính, làm lỏng gelatin, khử NO3 thành N2. Sử dụng carbohydrat bằng hình thức oxy hoá có sinh axit như glucose, mannitol, glycerol, arabinose... Lactose âm tính, Citrat simmon dương tính, ADH dương tính; Urease âm tính, indol âm tính, H2S âm tính [5]. Mặc dù được phân loại là một sinh vật hiếu khí, P. aeruginosa còn được xem như là sinh vật kị khí tùy nghi, vì vi khuẩn này có thể tăng sinh trong môi trường thiếu một phần hay toàn phần khí oxy. Nó có thể tăng sinh yếm khí bằng cách sử dụng nitrat như là chất nhận điện tử cuối cùng, và thậm chí khi thiếu nitrat nó cũng có thể lên men arginine bằng phosphoryl hóa ở mức cơ chất. Khả năng thích nghi trong môi trường vi hiếu khí hay kị khí mang ý nghĩa quan rất quan trọng đối với cơ chế sinh bệnh của P. aeruginosa, ví dụ ở những bệnh nhân bị viêm phổi do bệnh xơ nang, khi mà lớp alginate dày bao quanh những tế bào vi khuẩn nhầy có thể giới hạn sự khuếch tán của oxy vào máu [8]. Sự đa dạng của các cơ chế trao đổi gen, bao gồm biến nạp, tải nạp và tiếp hợp, giúp P. aeruginosa thích nghi với các điều kiện thay đổi bằng cách thu nhận thông tin di truyền mới [46].
9 1.3.1.4. Hình thái khuẩn lạc Trên môi trường đặc, khuẩn lạc điển hình, thường gặp nhất của P.aeruginosa khi cấy bệnh phẩm lâm sàng: kích thước lớn,nhẵn, bờ dẹt, giữa lồi lên, có thể gặp khuẩn lạc xù xì hoặc nhầy [7]. 1.3.1.5. Khả năng gây bệnh Trực khuẩn mủ xanh là một mầm bệnh cơ hội gây nhiễm trùng bệnh viện thường gặp nhất tấn công các bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch. Có thể gây nhiều bệnh khác nhau như nhiễm trùng vết thương, vết bỏng, hô hấp, tiết nhiệu; nhiễm trùng huyết và dịch não tủy [7], [8]. Do đó các nhóm bệnh nhân có nguy cơ mắc phải P. aeruginosa nhiễm trùng bao gồm những người mắc bệnh di truyền như u nang bệnh nhân xơ hóa, bệnh nhân liệt, bỏng, những người nhập viện trong các đơn vị chăm sóc đặc biệt và những người phải thở máy, và bệnh nhân bị ức chế miễn dịch bởi một số bệnh như ung thư và AIDS. P. aeruginosa thường tồn tại nhiều và dai dẳng trong môi trường bệnh viện. Chúng có mặt ở nền nhà, giường, chăn, đệm, lavabo, tay nhân viên y tế, nhiều dụng cụ máy móc trong bệnh viện như ống thông, máy hô hấp nhân tạo. Chúng xâm nhập vào cơ thể qua da (nhất là sau khi bị bỏng) hoặc qua vết thương, do phẫu thuật. Từ đó, vi khuẩn xâm nhập vào bệnh nhân và gây bệnh. Tại chỗ vi khuẩn gây viêm có mủ, điển hình là mủ có màu xanh. Nếu cơ thể giảm sức đề kháng hoặc do bệnh toàn thân, vi khuẩn xâm nhập và gây viêm các cơ quan như viêm bàng quang, viêm tai giữa, viêm màng não, viêm màng bụng. Có thể vi khuẩn vào máu gây nhiễm khuẩn huyết, viêm nội tâm mạc. Nhiễm khuẩn do trực khuẩn mủ xanh ngày càng trở nên trầm trọng do sự kháng kháng sinh rất mạnh của vi khuẩn. Mặc dù liệu pháp kháng sinh đã được cải thiện đáng kể trong quản lý các bệnh truyền nhiễm nói chung, nhiều P. aeruginosa nhiễm trùng không thể được điều trị đầy đủ hoặc loại bỏ bởi ứng dụng thuốc chống Pseudomonas và do đó có thể gây nhiễm trùng mãn tính [2], [44], [1]. Khả năng gây bệnh của P. aeruginosa là đa yếu tố, được biểu hiện bằng nhiều độc tố, hoặc các yếu tố độc lực, nó tạo ra và nhiều loại bệnh mà nó gây ra. P. aeruginosa là loài xâm nhập và gây độc. Nhiễm trùng xảy ra theo các giai
10 đoạn: tiếp cận vi khuẩn, xâm chiếm, xâm nhập và phổ biến, và bệnh toàn thân hoặc nhiễm độc. Yếu tố virus có thể góp phần vào một hoặc một số giai đoạn bệnh sinh. Các yếu tố bề mặt, bao gồm pili, lipopolysaccharide, và polysaccharide chất nhờn (alginate), có thể góp phần vào hai giai đoạn đầu tiên. Chất nhờn polysaccharide và lipopolysaccharide cũng có thể góp phần vào các quá trình khác sau này trong quá trình nhiễm trùng. Độc tố, bao gồm ETA và phospholipase C (hemolysin) và protease của P. aeruginosa có thể góp phần làm tổn thương và phổ biến mô. Chúng cũng có thể hỗ trợ việc thu mua các chất dinh dưỡng cần thiết cho vi khuẩn trong giai đoạn đầu của nhiễm trùng. Tầm quan trọng của các yếu tố độc lực khác nhau có thể phụ thuộc vào nhiễm trùng [46]. 1.3.2. Các yếu tố độc lực P. aeruginosa là loài vi khuẩn gây bệnh cơ hội. Độc tố của P. aeruginosa chỉ có tác động gây chết khi chúng được tạo ra với số lượng lớn. Tuy nhiên, loài vi khuẩn này có nhiều yếu tố độc lực tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập, lan truyền và gây bệnh. - Nội độc tố (endotoxin): là thành phần của vách tế bào vi khuẩn. Nội độc tố bao gồm chủ yếu là LPS và một lượng nhỏ protein. Hoạt tính sinh học của nội độc tố chủ yếu do phức hợp LPS đảm nhiệm. LPS có vai trò quan trọng trong bệnh sinh nhiễm khuẩn huyết và sốc nhiễm khuẩn huyết. - Ngoại độc tố (exotoxin A): bản chất là protein có trọng lượng phân tử 66,6 kDa. ETA hoạt động tượng tự như cơ chế hoạt động của độc tố vi khuẩn bạch hầu. Với khả năng khuếch tán và ức chế sự tổng hợp protein của tế bào, ETA là một độc tố mạnh nhất của P. aeruginosa. ETA gây rối loạn chức năng huyết động trung tâm, thay đổi chức năng đông máu, rối loạn chuyển hoá lipit, gây tổn thương nhiều cơ quan, nhưng biểu hiện rõ rệt nhất là tổn thương gan. 90% số chủng P. aeruginosa sản xuất ETA nhưng đặc tính của độc tố này rất khác nhau tuỳ từng chủng. - Các enzyme ngoại tiết: vi khuẩn có khả năng sinh nhiều enzyme ngoại tiết, các enzyme này đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập, gây bệnh tại chỗ:
11 + Protease: gần 90% các chủng P. aeruginosa có khả năng phân giải protein. P. aeruginosa tiết ra 2 loại protease quan trọng là alcaline và elastase. Nhiều chủng tiết ra collagenase. Các protease này thường có tác dụng hiệp đồng. Elastase có thể phá hủy lớp chun keo thành mạch máu gây tổn thương xuất huyết, tạo nên những ổ hoại tử trong thành mạch máu. Enzyme này còn gây ức chế hiện tượng opsonin hoá, làm giảm khả năng thực bào của bạch cầu đa nhân trung tính. Ngoài tác động trực tiếp, các protease còn có khả năng làm thay đổi sức đề kháng của vật chủ thông qua việc bất hoạt bổ thể, phá hủy cấu trúc của các globulin miễn dịch. + Hemolysine có 2 loại: o Glycolipide (hemolysine chịu nhiệt): không có tính enzyme, không có tính kháng nguyên và ít độc. Glycolipide đóng vai trò như một chất tẩy hoà tan các lipid là những chất cần cho hoạt động của phospholipase C. o Phospholipase C (hemolysine không chịu nhiệt): là một enzyme tan máu nằm trong một polypeptid đơn. Phospholipase C thường tác động hiệp đồng với glycolipide và protease alcaline gây xuất huyết, hoại tử tại chỗ tổn thương. + Cytotoxine (leucocidin): là một protein rất độc với bạch cầu đa nhân trung tính và các tế bào lympho. + Exoenzyme S: là một protein, có thể có 2 dạng: dạng không hoạt động và không có tính enzyme và dạng hoạt động, có tính enzyme. + Enterotoxin và yếu tố thấm qua thành mạch: các độc tố này còn ít được biết đến. Một số nghiên cứu đã chứng minh, trong thực nghiệm enterotoxin gây nên tình trạng ứ dịch trong đường ruột; độc tố này có thể là một trong những nguyên nhân gây viêm ruột non. Khi gây nhiễm qua da, yếu tố này có thể thấm vào trong lòng mạch, gây ban đỏ kèm theo xuất huyết ra ngoài lòng mạch. - Glycocalyx - capsule: ngoài chức năng bảo vệ vi khuẩn chống các yếu tố có hại cho chúng từ vật chủ như thực bào, kháng thể, bổ thể, kháng sinh, giúp cho quá trình nhân lên của vi khuẩn trong các mô còn thực hiện chức năng bám vào tế bào.
12 - Lông (flagella): vai trò của flagella trong sinh bệnh học nhiễm P. aeruginosa còn chưa rõ ràng. - Pili: giúp cho vi khuẩn bám vào tế bào biểu mô của vật chủ [1]. 1.3.3. Sức đề kháng Trực khuẩn mủ xanh có sức đề kháng cao so với các vi khuẩn không có khả năng sinh nha bào. Có thể sống hàng tuần trong môi trường ẩm, thoáng, không có ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp. Trong môi trường tối thiểu, ở 50C có thể sống tới nửa năm. Trực khuẩn mủ xanh bị tiêu diệt ở nhiệt độ 1000C và các thuốc sát khuẩn thông thường. Trực khuẩn sống ở trong đất, nước. Ở nơi có không khí, đủ độ ẩm và không có ánh sáng mặt trời, vi khuẩn sống được hàng tuần. Trong môi trường có chất dinh dưỡng tối thiểu để trong tủ lạnh, chúng có thể sống được 6 tháng. Chuyển sang lối sống không lành mạnh cùng với độc lực thấp hơn là một lợi thế sống còn nhờ nhiều loại vi khuẩn gây bệnh như P. aeruginosa trốn tránh căng thẳng và các điều kiện bất lợi. Chúng mất khả năng vận động và bám vào các bề mặt và hình thành các tập hợp tế bào hoặc vi khuẩn được nhúng trong các chất đa bào ngoại bào (EPS) để bảo vệ vi khuẩn khỏi môi trường xung quanh. Những cấu trúc này được gọi là màng sinh học tạo ra khả năng bền bỉ chống lại thực bào, stress oxy hóa, hạn chế chất dinh dưỡng / oxy, tích lũy chất thải trao đổi chất, cạnh tranh giữa các sinh vật và các chất chống vi trùng thông thường [17], [7], [2]. 1.3.4. Dịch tễ học Mô tả đầu tiên về P. aeruginosa như một loài vi khuẩn khác biệt được đưa ra vào cuối thế kỷ 19, sau khi Pasteur phát triển môi trường nuôi cấy vô trùng. Việc sàng lọc thuốc nhuộm đã cung cấp kích thích cho nghiên cứu khoa học đầu tiên về P. aeruginosa do dược sĩ Carle Gessard xuất bản năm 1882 với tựa đề “On the blue and green coloration of bandages”. Mặc dù khả năng gây nhiễm trùng của P. aeruginosa đã được chú ý vào năm 1889, khả năng gây bệnh của nó đã bị nghi ngờ, và P. aeruginosa chủ yếu được coi là nguồn cung cấp các chất kháng khuẩn mạnh. Trước năm 1947, chỉ có 91 trường hợp nhiễm trùng huyết do P. aeruginosa được báo cáo trong y văn [32]. Một nghiên cứu năm 2018 đã chỉ ra rằng, tỷ lệ