Luận văn : THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli part 5
lượt xem 27
download
Dựa vào nguyên tắc này các nhà sản xuất tạo ra các bộ kít chẩn đoán phát hiện vi sinh vật gây bệnh để ngƣời chăn nuôi có thể tự mình kiểm tra xem vật nuôi có mang mầm bệnh hay không nhƣ bộ kit chẩn đoán bệnh đốm trắng cho tôm...
Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!
Nội dung Text: Luận văn : THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli part 5
- Bảng 3.2 Gây miễn dịch thu kháng thể theo qui trình dài ngày (qui trình viện Pasteur Tp. HCM) Mũi mẫn cảm Mũi nhắc lại 1 Mũi nhắc lại 2 Mũi nhắc lại 3 Mũi nhắc lại 4 Mũi nhắc lại 5 0 1 14 28 42 56 70 84 98 112 126 140 154 Ngày L.máu Tiêm L.máu Tiêm L.máu Tiêm L.máu Tiêm L.máu Tiêm L.máu Tiêm L.máu Thỏ (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) 6 2 2 2 1,5 1,5 1,5 5 2 2 2 1,5 1,5 1,5 Lấy hết 1 1 1 1 50 50 4 1,5 1,5 1,5 1 1 1 3 1 1 1 0,75 0,75 0,75 L. máu = lấy máu Lấy máu kiểm tra kháng thể vào các ngày: 0, 14, 42, 70, 98, 126, 154. 24
- 25 3.4.2. Thu nhận kháng huyết thanh Kháng huyết thanh thu vào các ngày 25, 30, 35 ở qui trình 1 (bảng 3.1) và ở các ngày 98, 126, 154 ở qui trình 2 (bảng 3.2) Trƣớc khi lấy máu tráng ống bằng nƣớc muối sinh lí 0,85% Vnƣớc muối sinh lí = 0,1 % thể tích máu Lấy máu ở tĩnh mạch tai Sau khi lấy máu xong dùng que cấy khử trùng vét xung quanh ống Cho NaN3 vào VNaN3 = 0,05% Vmáu Để qua đêm ở 4oC Tách lấy huyết thanh, sau đó li tâm bỏ phần cặn. Kháng huyết thanh đƣợc chia làm 2 phần: Phần 1: để nguyên kháng huyết thanh, bổ sung glycerol (Vglycerol = 10% VKHT). Bảo quản ở 4oC. Phần 2: kháng huyết thanh đƣợc tủa trong amonium sulfate bão hòa. KHT nguyên đƣợc sử dụng trực tiếp trong phản ứng ngƣng kết hoặc cho gắn với protein A của Staphylococcus aureus hoặc xử lí hấp phụ với kháng nguyên vi khuẩn E. coli E68 và sau đó dùng cho phản ứng ngƣng kết đánh giá hiệu giá kháng thể. Việc xử lí KHT đƣợc tiến hành theo sơ đồ 3.2 KHT KHT nguyên KHT kết tủa, thẩm tích (bổ sung glycerol) Gắn protein A Hấp phụ Định tính Định lƣợng Sơ đồ 3.2 Qui trình chung về xử lí kháng huyết thanh
- 26 3.4.2.1. Tách kháng thể bằng amonium sulfate bão hoà Máu sau khi để ở 4oC qua đêm, đem li tâm tách kháng huyết thanh Cho vào mỗi chai đựng huyết thanh lƣợng PBS 1X (VPBS = 3Vhuyết thanh) Tủa huyết thanh thỏ bằng dung dịch amonium sulfate 100%S V (NH4)2SO4 = Vhuyết thanh + VPBS Huyết thanh thỏ / PBS 1X đƣợc để trong nƣớc đá bào trên máy khuấy từ Nhỏ từng giọt (NH4)2SO4 100%S. Sau khi cho hết lƣợng (NH4)2SO4 vào tiếp tục khuấy 45 – 60 phút Để 4oC qua đêm Li tâm tách kết tủa Rửa tủa 3 lần bằng dung dịch (NH4)2SO4 45% Cho vào ống 50 ml, giữ tủa / amonium sulfate 45% ở 4oC Đối với trƣờng hợp lấy 1 ml máu: sau khi lấy máu cho 0,01 ml NaN3 để ở 4oC qua đêm. Sau đó đem li tâm tách huyết thanh và cho glycerol vào (Vglycerol = 10 % Vh. thanh). Hình 3.1 Tủa kháng huyết thanh 3.4.2.2. Phục hồi kháng thể Kháng thể tủa trong amonium sulfate 45% đƣợc phục hồi bằng phƣơng pháp thẩm tích. Chuẩn bị bao thẩm tích Bao thẩm tích đƣợc cắt ra và rửa qua nƣớc cất, sau đó cho vào cốc nƣớc cất chứa 2 mM EDTA. Đun 3 giờ rồi rửa lại bằng nƣớc cất cho sạch EDTA. Cho vào bình chứa cồn 30o, bảo quản ở 4oC.
- 27 Thực hiện thẩm tích Cho kháng thể tủa trong amonium sulfate 45% vào bao thẩm tích dùng kẹp kẹp 2 đầu bao thẩm tích lại đặt bao thẩm tích vào dung dịch buffer PBS để 5-6 giờ ở 4oC. Thực hiện 3 lần thẩm tích nhƣ trên sau đó thu kháng thể để xác định hiệu giá. trƣớc thẩm tích sau thẩm tích Hình 3.2 Dịch kháng huyết thanh tủa trong amonium sulfate trƣớc và sau thẩm tích 3.4.3. Xử lí kháng huyết thanh Kháng huyết thanh nguyên và kháng huyết thanh tủa trong amonium sulfate, thẩm tích đƣợc xử lí để loại bỏ các kháng thể không đặc hiệu hoặc gắn với protein A của S. aureus.
- 28 3.4.3.1. Hấp phụ kháng thể không đặc hiệu Kháng thể không đặc hiệu trong kháng huyết thanh đƣợc xử lí hấp phụ theo qui trình minh họa qua sơ đồ 3.3 Nuôi E. coli chủng gốc (K88+) trong môi trƣờng canh TSB 5-6h ở 37oC Lấy 0,5 ml canh khuẩn cấy trên đĩa thạch TSA đƣờng kính 15 cm Ủ 37oC qua đêm Rửa vi khuẩn bằng 3 ml nƣớc muối sinh lí 0,85% thu dịch huyền phù vi khuẩn Pha với 1 ml kháng huyết thanh (hoặc kháng thể đã thẩm tích) + 6 ml dung dịch phenol 0,25% Ủ 50oC trong 2h Li tâm 4000 vòng/phút trong 1h Thu dịch kháng thể trong Sơ đồ 3.3 Qui trình hấp phụ các kháng thể không đặc hiệu
- 29 3.4.3.2. Gắn kháng thể với protein A của Staphylococcus aureus Kháng thể có trong kháng huyết thanh đƣợc xử lí gắn với protein A của Staphylococcus aureus theo qui trình minh họa qua sơ đồ 3.4 Nuôi Staphylococcus aureus trong môi trƣờng canh TSB ủ 5-6h ở 37oC Lấy 0,5 ml canh khuẩn cấy trên đĩa petri môi trƣờng TSA ủ 37oC qua đêm Rửa vi khuẩn bằng 10 ml nƣớc muối sinh lí 0,85% thu dịch huyền phù vi khuẩn Li tâm (4000 vòng/phút trong 30 phút) bỏ dịch nổi Rửa trong 10 ml nƣớc muối sinh lí Li tâm bỏ dịch nổi Hòa tan trong nƣớc muối chứa 0,3 % (v/v) formalin ủ 4oC qua đêm Li tâm bỏ dịch nổi Pha loãng trong nƣớc muối sinh lí để đạt nồng độ thử nghiệm Cho kháng huyết thanh vào với tỉ lệ KHT : dịch VK là 1:4 hoặc 1:9 Ủ 50oC trong 2h Dịch kháng thể gắn với protein A của S. aureus Sơ đồ 3.4 Qui trình gắn kháng thể với protein A của Staphylococcus aureus
- 30 3.4.4. Đánh giá 3.4.4.1. Định tính (bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính) Phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính là phản ứng có tính chất định tính, thƣờng sử dụng KN đã biết và đƣợc nhuộm màu để phát hiện KT tƣơng ứng trong huyết thanh, thƣờng dùng trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm. a. Cách thực hiện Nhỏ tách riêng trên phiến kính 1 giọt kháng huyết thanh (nguyên hoặc gắn S. aureus) thu đƣợc sau khi tiêm kháng nguyên gây miễn dịch và 1 giọt kháng huyết thanh thu đƣợc trƣớc khi tiêm kháng nguyên để làm đối chứng âm. Sau đó nhỏ thêm 1 giọt dịch vi khuẩn (vi khuẩn O139:K82 đƣợc cấy trên môi trƣờng canh TSB và ủ 37 oC qua đêm) và lắc nhẹ để trộn đều vi khuẩn với KHT, kết quả đƣợc đọc sau đó k hoảng 30 giây đến 1 phút . b. Đọc kết quả Nếu trong huyết thanh có kháng thể đặc hiệu với vi khuẩn thì trong huyễn dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh sẽ hình thành nên rất nhiều hạt ngƣng kết lớn màu trắng đục và đều khắp giọt huyễn dịch, nhìn thấy rõ bằng mắt thƣờng, phản ứng đƣợc đọc là dƣơng tính (+). Tùy theo kích thƣớc hạt ngƣng kết lớn hay nhỏ mà ta đánh giá phản ứng dƣơng tính là: + nếu hạt ngƣng kết nhỏ, ít nhƣng vẫn thấy đƣợc bằng mắt thƣờng +++ nếu hạt ngƣng kết rất lớn, nhiều màu trắng đục và thấ y rất rõ bằng mắt thƣờng ++ nếu hạt ngƣng kết ở dạng trung gian giữa + và +++ Nếu huyễn dịch vi khuẩn vẫn đồng nhất, không thấy có sự xuất hiện các hạt ngƣng kết, phản ứng đƣợc đọc là âm tính (-). (+++) (-) Hình 3.3 Phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính
- 31 3.4.4.2. Định lƣợng (định hiệu giá bằng phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm) Phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm là phản ứng vừa có tính định tính, vừa có tính định lƣợng hàm lƣợng kháng thể (bán định lƣợng). Phản ứng này thƣờng đƣợc sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán y học, thú y học nhƣ chẩn đoán giang mai, thƣơng hàn, bạch lị gà, sẩy thai truyền nhiễm gia súc… a. Chuẩn bị dịch kháng nguyên Cấy E. coli chủng gốc O139:K82 vào môi trƣờng canh TSB ủ 37oC qua đêm Cho formalin vào (Vformalin = 0,3% Vdịch VK ) Để 4oC qua đêm Li tâm bỏ dịch nổi (4000 vòng / phút trong 30 phút) Hòa tan phần rắn trong PBS 1X (VPBS = Vdịch VK) Dịch kháng nguyên Sơ đồ 3.5 Qui trình chuẩn bị dịch kháng nguyên thực hiện phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm b. Cách thực hiện Dùng một loạt ống nghiệm, cho vào mỗi ống 0,3 ml dịch KHT (nguyên, kết tủa và thẩm tích có hoặc không có hấp phụ E68) pha loãng trong PBS 1X theo cơ số 2. Sau đó cho vào mỗi ống 0,3 ml dịch kháng nguyên ủ 37oC trong 2 giờ và để 4oC qua đêm. Ngoài ra cần phải có ống đối chứng chứa 0,3 ml dịch kháng nguyên và 0,3 ml PBS 1X.
- 32 Hình 3.4 Phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm c. Đọc kết quả Phản ứng ngƣng kết trong ống nghiệm đƣợc đọc là: (+) khi các hạt ngƣng kết tạo thành mạng lƣới lắng đều khắp đáy ống nghiệm. (-) khi vi khuẩn lắng tập trung giữa đáy ống nghiệm. Kháng thể đƣợc định hiệu giá ở nồng độ kháng huyết thanh pha loãng cao nhất có xảy ra phản ứng ngƣng kết và ống đối chứng thì không ngƣng kết. 3.5. CHỈ TIÊU THEO DÕI Thời điểm xuất hiện kháng thể. Hiệu giá kháng thể. 3.6. XỬ LÍ KẾT QUẢ So sánh hiệu giá kháng thể thu đƣợc từ 2 qui trình trên.
CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD
-
Luận văn: nghiên cứu sản xuất thử nghiệm phân bón vi sinh vật đa chủng, phân bón chức năng phục vụ chăm sóc cây trồng cho một số vùng sinh thái
105 p | 383 | 160
-
́Luận văn nghiên cứu thử nghiệm sản phẩm nước linh chi đóng chai
78 p | 329 | 123
-
Luận văn Thạc sĩ: Nghiên cứu thử nghiệm sản xuất gạch không nung từ nguồn phế liệu của nhà máy xi măng Trung Sơn, Lương Sơn, Hòa Bình
30 p | 246 | 42
-
Luận văn chế biến thủy sản: Thử nghiệm sản xuất sản phẩm đậu hủ cá rô phi (Oreochromis niloticus)
65 p | 166 | 41
-
Luận văn : THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli part 6
9 p | 170 | 34
-
Luận văn nuôi trồng thủy sản: Thử nghiệm ương ếch Thái Lan từ ấu trùng đến 30 ngày tuổi với các loại thức ăn khác nhau
38 p | 233 | 31
-
Luận văn : THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli part 7
9 p | 130 | 28
-
LUẬN VĂN: THỬ NGHIỆM ƯƠNG CÁ LĂNG (Mystus wyckii Bleeker, 1858) VỚI CÁC MẬT ĐỘ KHÁC NHAU
40 p | 166 | 24
-
LUẬN VĂN: Thử nghiệm ương nuôi cá lóc bông(Channa micropeltes) từ bột lên hương với các mật độ khác nhau
55 p | 135 | 24
-
Luận văn: Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm sản phẩm giá trị gia tăng từ nguồn nguyên liệu cá Rô phi tạp và thịt tôm vụn – Sản phẩm là “Chạo tôm, cá"
83 p | 173 | 23
-
Luận văn nuôi trồng thủy sản: Tiếp tục thử nghiệm kích thích cá rô đồng sinh sản bằng kích thích tố
45 p | 125 | 22
-
Luận văn nuôi trồng thủy sản: Thử nghiệm ương cá rô đầu vuông (anabas sp.) giai đoạn bột lên hương với mật độ và thức ăn khác nhau
43 p | 140 | 21
-
Luận văn nuôi trồng thủy sản: Thử nghiệm ương cá rô phi đỏ giai đoạn bột lên hương với các mật độ và độ mặn khác nhau
19 p | 121 | 18
-
LUẬN VĂN: THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT GIỐNG CÁ MÈ VINH BẰNG KÍCH THÍCH TỐ KHÁC NHAU Ở CẦN THƠ
41 p | 105 | 14
-
Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật: Nghiên cứu thử nghiệm sản xuất gạch không nung từ nguồn phế liệu của nhà máy xi măng Trung Sơn, Lương Sơn, Hòa Bình
72 p | 52 | 10
-
Luận văn Thạc sĩ Kinh tế: Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quyết định lựa chọn nhà cung cấp dịch vụ thử nghiệm sản phẩm của các doanh nghiệp dệt may, da giày tại Việt Nam
151 p | 42 | 8
-
Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm huyết thanh kháng nọc rắn Cạp nia Bắc (Bungarus multicinctus) tinh chế
134 p | 14 | 7
Chịu trách nhiệm nội dung:
Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA
LIÊN HỆ
Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM
Hotline: 093 303 0098
Email: support@tailieu.vn