luận văn:Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC

Chia sẻ: Nguyễn Thị Bích Ngọc | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:42

Thêm vào BST

Báo xấu

183
lượt xem 62
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tobramycin là một kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác dụng trên nhiều vi khuẩn Gr (-) hiếu khí và một số vi khuẩn Gr (+) hiếu khí. Thuốc không có tác dụng với Chlamydia, nấm, virus và đa số các vi khuẩn yếm khí

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: luận văn:Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC

----- ----- ÁN T T NGHI P tài: “Xây d ng quy trình k thu t nh lư ng tobramycin b ng phương pháp HPLC.” -3-
M CL C PH N 1: T NG QUAN ...........................................................................- 3 - 1.1. T NG QUAN V TOBRAMYCIN .................................................- 7 - 1.1.1. Công th c c u t o ...........................................................................- 7 - 1.1.2. Tính ch t lý hóa ..............................................................................- 7 - 1.1.3. Ngu n g c........................................................................................- 7 - 1.1.4. Dư c ng h c ................................................................................- 7 - 1.1.5. Tác d ng và cơ ch tác d ng ..........................................................- 8 - 1.1.6. Ch nh...........................................................................................- 8 - 1.1.7. Ch ng ch nh ................................................................................- 9 - 1.1.8. D ng bào ch và li u lư ng ............................................................- 9 - 1.2. M T S PHƯƠNG PHÁP NH LƯ NG TOBRAMYCIN ........- 9 - 1.2.1. nh lư ng tobramycin b ng phương pháp vi sinh ......................- 9 - 1.2.1.1. Phương pháp 1 [15] .......................................................................- 9 - 1.2.1.2. Phương pháp 2 [3] .......................................................................- 10 - 1.2.1.3. Phương pháp 3:[14], [20] ............................................................- 10 - 1.2.2. nh lư ng tobramycin b ng phương pháp o quang ph h p th UV-VIS....................................................................................................- 11 - 1.2.2.1. Phương pháp 1: [4]......................................................................- 11 - 1.2.2.2. Phương pháp 2: [19] ....................................................................- 11 - 1.2.3 nh lư ng tobramycin b ng phương pháp HPLC .....................- 12 - 1.2.2.1 Phương pháp 1 [14] ......................................................................- 12 - 1.2.2.2 Phương pháp 2 [20], [23] ............................................................- 12 - 1.2.2.3 Phương pháp 3 [15] ......................................................................- 13 - 1.2.2.4 Phương pháp 4 [16] .....................................................................- 13 - 1.2.2.5 Phương pháp 5 [15] ......................................................................- 14 - 1.2.2.6. Phương pháp 6 [5] .......................................................................- 14 - 1.2.2.7. Phương pháp 7 [9] .......................................................................- 15 - 1.3. T NG QUAN V PHƯƠNG PHÁP S C KÍ L NG HI U NĂNG CAO (HPLC) ..........................................................................................- 16 - 1.3.1. Nguyên t c.....................................................................................- 16 - 1.3.2. Cơ s lý thuy t ..............................................................................- 17 - 1.3.3. Nguyên t c c u t o h th ng HPLC ............................................- 17 - 1.3.3.1. H th ng bơm ..............................................................................- 17 - 1.3.3.2. Bình ch a dung môi và h th ng x lý dung môi .........................- 17 - 1.3.3.3. H tiêm m u ................................................................................- 17 - 1.3.3.4. C t s c ký l ng HPLC .................................................................- 18 - 1.3.3.5. Detector trong HPLC ..................................................................- 18 - 1.3.3.6. Thi t b hi n th k t qu ...............................................................- 18 - -4-
1.3.4. Các thông s c trưng c a quá trình s c ký ..............................- 19 - 1.3.5. Cơ s lý thuy t c a vi c l a ch n i u ki n s c ký .....................- 21 - 1.3.5.1. L a ch n c t (pha tĩnh) [12], [18]...............................................- 21 - 1.3.5.2. L a ch n pha ng cho HPLC [12], [18]....................................- 22 - 1.3.5.3. Ch n m pH ...............................................................................- 23 - 1.3.5.4. T c dòng ................................................................................- 23 - 1.3.6. Cách ánh giá pic .........................................................................- 23 - 1.3.7. ng d ng c a HPLC ....................................................................- 24 - 1.3.7.1. nh tính và th tinh khi t: .....................................................- 24 - 1.3.7.2. S c ký i u ch : ..........................................................................- 24 - 1.3.7.1. nh lư ng: ................................................................................- 24 - PH N 2: TH C NGHI M VÀ K T QU ..........................................- 26 - 2.1. NGUYÊN V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP TH C NGHI M ...- 26 - 2.1.1. Nguyên v t li u : ...........................................................................- 26 - 2.1.1.1. Nguyên li u và hoá ch t: .............................................................- 26 - 2.1.1.2. D ng c : ......................................................................................- 26 - 2.1.2. N i dung và phương pháp nghiên c u ........................................- 26 - 2.1.2.1. Phương pháp nghiên c u .............................................................- 26 - 2.1.2.2. N i dung nghiên c u ...................................................................- 27 - 2.2. TH C NGHI M VÀ K T QU ....................................................- 28 - 2.2.1. Xây d ng quy trình k thu t nh lư ng tobramycin b ng phương pháp HPLC ...............................................................................- 28 - 2.2.1.1. Nguyên t c l a ch n i u ki n s c ký .......................................- 28 - 2.2.1.2. Kh o sát l a ch n i u ki n s c kí: ..........................................- 28 - a. Kh o sát ch n bư c sóng thích h p ......................................................- 28 - Hình 1: Ph h p th c a dung d ch tobramycin 0,02% .............................- 29 - b. L a ch n c t:........................................................................................- 29 - c. L a ch n m: ......................................................................................- 29 - d. L a ch n pha ng: ..............................................................................- 30 - e. L a ch n t c dòng ...........................................................................- 30 - . i u ki n s c ký l a ch n.....................................................................- 31 - 2.2.2. Qui trình nh lư ng ....................................................................- 31 - 2.2.2.1. Kh o sát tính thích h p c a h th ng ...........................................- 32 - 2.2.2.2. Xây d ng phương pháp nh lư ng .............................................- 32 - 2.2.2.3. i u ki n s c ký ..........................................................................- 33 - 2.2.2.4. Tính k t qu .................................................................................- 33 - 2.2.3. nh lư ng tobramycin nguyên li u b ng phương pháp m i xây d ng ........................................................................................................- 34 - 2.2.4. ánh giá phương pháp nh lư ng ..............................................- 35 - 2.2.4.1. Tính tuy n tính ..........................................................................- 35 - -5-
2.2.4.2. Tính chính xác ...........................................................................- 37 - 2.2.4.3. Tính úng ...................................................................................- 37 - B ng 6: K t qu ánh giá tính úng c a phương pháp.............................- 38 - 2.2.4.4. Tính c hi u .............................................................................- 39 - 2.3. BÀN LU N VÀ K T QU .............................................................- 40 - K T LU N VÀ XU T ....................................................................- 43 - 3.1 K T LU N .......................................................................................- 43 - 3.2 XU T ..........................................................................................- 43 - -6-
PH N 1: T NG QUAN 1.1. T NG QUAN V TOBRAMYCIN 1.1.1. Công th c c u t o C18H37N5O9 PTL: 467.5 Tên khoa h c: 4-O-(3-Amino-deoxy-α-D-glucopyranosyl)-2-deoxy-6-O-(2,6- diamino-2,3,6-trideoxy-α-D-ribo-hexopyranosyl)-L-streptamine [21]. 1.1.2. Tính ch t lý hóa B t màu tr ng ho c tr ng ngà. D tan trong nư c, r t khó tan trong ethanol, th c t không tan trong cloroform và ether. Góc quay c c riêng [α]D20 : +1380 n +1480[7] 1.1.3. Ngu n g c Chi t xu t t môi trư ng nuôi c y Streptomyces tenebrarius, có th bán t ng h p t kanamycin B [7]. 1.1.4. Dư c ng h c Tobramycin h u như không h p thu qua ư ng tiêu hoá nhưng h p thu t t qua ư ng tiêm b p, tiêm tĩnh m ch. Thu c ít liên k t v i protein huy t -7-
tương. Do phân t phân c c m nh nên khó i vào các mô k c não. Thu c t n ng cao trong v th n. Khi s d ng cho ph n mang thai, thu c tích lũy trong thai gây c cho c m và con. Tobramycin ào th i ch y u qua th n nên ph i gi m li u khi suy th n, thư ng d a vào creatinin huy t thanh tránh c tính. Hi n nay, tobramycin ư c dùng v i ch m t li u cao và duy nh t trong ngày. Cách dùng này cho th y hi u qu i u tr cao hơn và ít c tính hơn so v i dùng li u nh và nhi u l n trong ngày như trư c ây. i v i các ca n ng (nhi m Pseu. aeruginosa ngư i gi m neutrophile và các ca suy th n) c n kho ng cách li u dài hơn 24 gi . Th i gian bán th i c a tobramycin: 2 - 5 gi [6] 1.1.5. Tác d ng và cơ ch tác d ng Tobramycin là m t kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác d ng trên nhi u vi khu n Gr (-) hi u khí và m t s vi khu n Gr (+) hi u khí. Thu c không có tác d ng v i Chlamydia, n m, virus và a s các vi khu n y m khí. Tobramycin r t gi ng gentamycin v tính ch t sinh h c và c tính: chúng có cùng n a i th i tr , n ng nh trong huy t thanh, ít liên k t v i protein, th tích phân b và s bài ti t ch y u qua l c c u th n. i m quan tr ng nh t c a tobramycin là có ho t tính i v i ph n l n các ch ng Pseudomonas aeruginose, m nh hơn c gentamycin. Cơ ch tác d ng: Tobramycin c ch s t ng h p protein các vi khu n nh y c m b ng cách g n không thu n ngh ch v i các ti u phân 30S c a ribosom [2], [11]. 1.1.6. Ch nh ư c ch nh trong các b nh nhi m khu n n ng e d a t i tính m ng, c bi t v i các b nh mà nguyên nhân chưa rõ ràng ho c b nhi m khu n huy t do vi khu n Gr (-). -8-
Trong i u tr các b nh nhi m khu n n ng, ho c trong các b nh nhi m khu n n ng toàn thân do Pseudomonas sp. gây ra, tobramycin có th dùng ph i h p v i m t kháng sinh nhóm beta-lactam. Trong b nh viêm n i tâm m c do Streptococcus faecalis ho c alpha - Streptococcus gây ra, có th dùng tobramycin ph i h p v i ampicilin ho c benzylpenicilin nhưng ph i tiêm riêng r . [2] 1.1.7. Ch ng ch nh Ngư i có ti n s d ng v i các kháng sinh lo i aminoglycosid, ngư i nghe kém và ngư i có b nh th n. [2] 1.1.8. D ng bào ch và li u lư ng Tobramycin sulphat: Dung d ch tiêm b p, tiêm tĩnh m ch 40 mg/ml (ngư i l n), 10 mg/ml (tr em). B t pha tiêm 30 - 40 mg/l . L 5 ml 0,3 % nh m t. Tuýp 3,5 g m tra m t 0,3 %. D ng thu c hít qua ư ng mi ng b ng máy khi dùng i u tr nhi m P. aeruginosa ư ng hô h p b nh nhân b xơ nang hóa. [11] 1.2. M T S PHƯƠNG PHÁP NH LƯ NG TOBRAMYCIN 1.2.1. nh lư ng tobramycin b ng phương pháp vi sinh 1.2.1.1. Phương pháp 1 [15] - Ch ng vi khu n: Bacillus subtilis CMCC(B)63501. - Dung d ch m phosphat pH 7,8 ± 0,1 Dikali hydrophosphat : 5,59 g Kali dihydrophosphat : 0,41 g - Môi trư ng nh lư ng: Pepton : 5,0 g Cao th t : 3,0 g Dikali hydrophosphat : 3,0 g Th ch : 15,0 - 20,0 g -9-
Nư c c t : 1000 ml pH sau khi ti t trùng : 7,8 ± 0,2 - Chu n b dung d ch chu n và th sau ó ti n hành th và tính k t qu theo [15] 1.2.1.2. Phương pháp 2 [3] - Ch ng vi khu n: Bacillus pumilus NCTC 8241. - Dung d ch m phosphat pH 8,0 ± 0,1 Dikali hydrophosphat : 16,75 g Kali dihydrophosphat : 0,523g - Môi trư ng nh lư ng: Cao men bia : 3,0 g Pepton : 6,0 g Casein pancreatic : 4,0 g Glucose : 1,0 g Cao th t : 1,5 g Th ch : 15,0 g Nư c c t : 100 ml pH sau khi ti t trùng : 8,2 ± 0,2 - Chu n b dung d ch chu n và th Cân chính xác kho ng 25,0 mg tobramycin hòa tan trong dung d ch m phosphat pH 8,0 có n ng tobramycin chính xác kho ng 10 IU/ml; 20 IU/ml và 40 IU/ml. - Ti n hành th và tính toán k t qu theo phương pháp ho t l c kháng sinh - D VN III. 1.2.1.3. Phương pháp 3:[14], [20] - Xác nh ho t l c kháng sinh c a tobramycin b ng phương pháp vi sinh v t theo BP 2000 hay JP14 - 10 -
- Ch ng vi khu n : Bacillus subtilis ATCC 6633 - Môi trư ng nuôi c y : Môi trư ng c - Dung d ch chu n Cân chính xác m t lư ng tobramycin chu n, tương ương kho ng 25 mg (hi u l c), hoà tan trong dung d ch m phosphat 0,1 mol/l, pH 8 thành chính xác 25 ml và ó chính là dung d ch chu n g c. Gi dung d ch chu n g c nhi t t 5οC n 15οC và s d ng trong vòng 30 ngày. Pha loãng dung d ch b ng dung d ch chu n m phosphat 0,1M, pH 8 ư c các dung d ch có n ng 8µg/ml và 2µg/ml (theo hi u l c). - Dung dich th : Cân chính xác m t lư ng tobramycin, tương ương kho ng 25 mg (hi u l c), hoà tan trong dung d ch m phosphat 0,1 mol/l, pH 8 thành chính xác 25ml. Pha loãng dung d ch b ng dung d ch chu n m phosphat 0,1M, pH 8 ư c các dung d ch có n ng 8µg/ml và 2µg/ml (theo hi u l c). 1.2.2. nh lư ng tobramycin b ng phương pháp o quang ph h p th UV-VIS 1.2.2.1. Phương pháp 1: [4] Cân m t lư ng tobramycin sulfat tương ng v i kho ng 0,3 g tobramycin nguyên li u , cho vào bình nh m c có dung tích 100 ml, b sung nư c c t 2 l n v a n v ch, tr n u. L y 1 ml dung d ch này cho vào bình nh m c có dung tích 20 ml, thêm 5 ml dung d ch NaOH 0,01N, 2 ml dung d ch KMnO4. Dung d ch v a pha em un cách thu 400C trong 60 phút. Song song ti n hành i u ch dung d ch chu n b ng cách dùng ch t i chi u tobramycin. M u tr ng ti n hành như m u th nhưng không có tobramycin. Sau khi un cách thu 400C, th i gian 60 phút, em o m t quang c a các dung d ch này bư c sóng 425 nm, cuvet dày 1cm. 1.2.2.2. Phương pháp 2: [19] - 11 -
D a trên cơ s t o ra s n ph m m u xanh v i 3-methyl-2 benzothiazolinon hydrazon hydrochlorid và FeCl3. S n ph m có h p th l n nh t 645 nm. nh lu t Lambert-Beer ư c áp d ng trong kho ng n ng t 50-500 mUI/ml. 1.2.3 nh lư ng tobramycin b ng phương pháp HPLC 1.2.2.1 Phương pháp 1 [14] - C t styren - divinylbenzen copolymer (4,6 x 250 mm, 8µm). - Nhi t c t: 55 0C. - Pha ng: H n h p pha trong 1l nư c ã lo i CO2 g m: 52 g natri sulfat khan; 1,5 g natri octansulfonat; 3 ml tetrahydrofuran và 50 ml dung d ch kali dihydrophosphat 0,2 M ã ư c ch nh pH v 3,0 b ng acid phosphoric. -T c dòng: 1 ml/phút. - Dung d ch thêm vào sau c t: Dung d ch natri hydroxyd 2% pha trong nư c ã lo i CO2. T c 0,3 ml/phút. - Detector: Detector ampe k ho c các thi t b tương t . - Th tích tiêm: 20 µl. - N ng dung d ch chu n và th : 0,1 mg/ml. 1.2.2.2 Phương pháp 2 [20], [23] - C t RP 18 (3,9 mm x 30 cm). - Pha ng: Hòa tan 2,0 g tris (hydroxymethyl) aminomethan trong kho ng 800 ml nư c, thêm vào dung d ch này 20 ml dung d ch acid sulfuric 1N, sau ó pha loãng b ng acetonitril t i 2000 ml, l c u. - Thu c th 2,4-dinitrofluorobenzen: Dung d ch 2,4dinitrofluorobenzen 1% trong ethanol 96%. -T c dòng: 1,2 ml/phút. - Detector UV: 365 nm. - 12 -
- Th tích tiêm: 20 µl. - N ng dung d ch chu n và th : Kho ng 0,22 mg/ml trong dung d ch acid sulfuric 0,004 N. - Các dung d ch chu n và th ư c t o d n xu t v i các thu c th 2,4- dinitrofluorobenzen và tris (hydroxymethyl) aminomethan trư c khi tiêm s c ký. 1.2.2.3 Phương pháp 3 [15] - C t Purospher® STARRP-18e (4 x 55 mm, 3 µm, Merck). - Pha ng: Acetonitril - nư c (50:50). -T c dòng: 1,3 ml/phút. - Detector UV: 230 nm. - N ng dung d ch chu n và th : Kho ng 5 µg/ml trong nư c. - Dung d ch chu n và dung d ch th ư c t o d n xu t v i dung d ch thu c th 1-naphthyl isothiocyanat trong pyridin 700C. 1.2.2.4 Phương pháp 4 [16] - C t Xterra® RP - 18 (2,1 x 250 mm, 5 µm). - Nhi t c t: 30 0C. - Pha ng A: Thêm 0,7 ml dung d ch amoni hydroxyd 28 - 30 % vào 1 lít nư c Milli - Q®. S d ng dung d ch natri hydroxyd 2,5 N ch nh pH pha ng A n 11,0. - Pha ng B: Acetonitril. - Ti n hành s c ký theo chương trình gradient dung môi như sau: Th i gian Pha ng A Pha ng B (phút) (%) (%) 0 100 0 10 0 100 - 13 -
-T c dòng: 0,2 ml/phút. - Detector: Kh i ph . - Th tích tiêm: 4µl. - N ng dung d ch chu n và th : Kho ng 0,35 mg/ml trong dung d ch NaCl 0,9 %. 1.2.2.5 Phương pháp 5 [15] - C t Ultrasphera RP 8 (4,6 x 250 mm, 5µm). - Pha ng: Acetonitril - m phosphat 0,05 M pH 3,5 [62:38] -T c dòng: 2,5 ml/phút. - Thu c th t o d n ch t: Acid 2,4,6-trinitrobenzen sulfomic. - Detector UV: 340 nm. - Th tích tiêm: 20 µl. - N ng dung d ch chu n và th : Kho ng 0,02 mg/ml trong m phosphat pH 7,4. - Dung d ch chu n và th ư c t o d n xu t v i thu c th acid 2,4,6-trinitrobenzen sulfomic 70 0C. 1.2.2.6. Phương pháp 6 [5] - C t : RP -18 brava ODS (150 x 4,6 mm,5µm) - Detector huỳnh quang : Ex/Em= 338 nm/ 455 nm -T c dòng: 1ml/phút -T c thu c th : 0,7ml/phút - Th tích tiêm: 20 µm - Pha ng: Hoà tan 17,75 g natri sulfat khan ; 3,05g natri pentansulfonat và 1ml acid acetic băng trong 1000 ml nư c, l c u, l c qua màng l c 0,45µm. - Thu c th t o d n xu t sau c t: Hoà tan 0,5g o-phthalaldehyd trong 100 ml methanol, thêm 1,0 ml 2-mercaptoethanol, l c 3 phút. Thêm 1,5 ml - 14 -
dung d ch polyoxyethylen lauryl ether 12% và 350 ml dung d ch m borat pH 10,4 l c u. - Dung d ch m borat pH 10,4: Hoà tan 24,64 g acid boric trong 900 ml nư c. i u ch nh pH n 10,4 b ng dung d ch NaOH 40%, thêm nư c t i v a 1000 ml, l c u, l c qua màng l c 0,45 µm (pha theo BP 2005). 1.2.2.7. Phương pháp 7 [9]  Dung d ch th Cân chính xác kho ng 20,0 mg tobramycin nguyên li u cho vào bình nh m c 20,0 ml. Hòa tan và pha loãng b ng nư c v a n v ch. L y chính xác 5,0 ml dung d ch trên cho vào bình nh m c 20,0 ml. Thêm 0,5 ml thu c th X, em un cách th y 80 0C trong 60 phút. Thêm dung môi v a n v ch, l c u. L c qua màng l c 0,45 µm.  Dung d ch chu n ( i chi u) Ti n hành tương t như dung d ch th nhưng thay tobramycin nguyên li u b ng tobramycin chu n ( i chi u). - C t s c ký Nucleosil C18 (250 x 4 mm, 5µm). - Detector UV : = 215 nm. - Pha ng: Methanol : m phosphat 0,01 M pH 3 = 20 : 80 - Th tích tiêm: 10 µl. -T c dòng: 0,6 ml/phút. - Nhi t phân tích: Nhi t phòng thí nghi m. * Nh n xét: Qua các phương pháp nh lư ng nêu trên, chúng tôi nh n th y: - nh lư ng b ng phương pháp vi sinh: R , ơn gi n, không c n trang thi t b ph c t p nhưng có như c i m l n là m t nhi u th i gian và kém d c hi u do s có m t c a các ch t kháng vi sinh v t khác, tính chính xác không cao. - 15 -
- nh lư ng b ng phương pháp o h p th UV-VIS: Có chính xác cao, ti n hành ơn gi n, không yêu c u máy móc quá ph c t p, hoá ch t thông d ng và có th áp d ng nh lư ng các cơ s ki m nghi m trong c nư c. Tuy nhiên, như c i m c a phương pháp là: Tính c hi u chưa cao (s có m t c a ch t khác có kh năng h p th t ngo i kh ki n như benzalkonium clorid, m t ch t b o qu n hay dùng, s nh hư ng k t qu nh lư ng), ho c ph i dùng thu c th nh p ngo i t o d n ch t. - nh lư ng b ng phương pháp HPLC :  Ưu i m: Nói chung có tính c hi u cao, tách riêng ư c ho t ch t.  Như c i m: Ti n hành ph c t p, òi h i có trang thi t b và thu c th t ti n vì detector UV thư ng không dùng ư c mà thư ng ph i t o d n ch t. Phương pháp HPLC pha o v i detector UV r t hay s d ng phân tích các h p ch t phân c c và h p th UV. Nhưng v i các h p ch t h p th UV y u như tobramycin thì thư ng ph i t o d n ch t, ho c ph i s d ng detector lo i c bi t t ti n. Vì v y, v i các trang thi t b s n có phòng thí nghi m, chúng tôi t v n nghiên c u xây d ng m t quy trình nh lư ng tobramycin b ng phương pháp HPLC ơn gi n, d th c hi n và kinh phí th p hơn, không s d ng thu c th t o d n xu t như các phương pháp hi n nay v i hi v ng có th ưa vào s d ng trong công tác ki m nghi m - góp ph n qu n lý ch t lư ng các s n ph m ch a tobramycin. 1.3. T NG QUAN V PHƯƠNG PHÁP S C KÍ L NG HI U NĂNG CAO (HPLC) 1.3.1. Nguyên t c Phương pháp HPLC là 1 phương pháp phân tích hóa lý, dùng tách và nh lư ng các thành ph n trong h n h p d a trên ái l c khác nhau gi a các ch t v i 2 pha luôn ti p xúc nhưng không hòa l n vào nhau: Pha tĩnh - 16 -
(trong c t hi u năng cao) và pha ng (dung môi r a gi i). Khi dung d ch c a h n h p các ch t c n phân tích ưa vào c t, chúng s ư c h p ph ho c phân b vào pha tĩnh tùy thu c vào b n ch t c a c t và c a ch t c n phân tích. Khi ta bơm dung môi pha ng vào c t thì tùy thu c vào ái l c c a các ch t v i hai pha, chúng s di chuy n qua c t v i v n t c khác nhau d n n s phân tách. Các ch t sau khi ra kh i c t s ư c phát hi n b i b ph n phát hi n g i là detector và ư c chuy n qua b x lý k t qu . K t qu cu i cùng ư c hi n th trên màn hình ho c ưa ra máy in [8]. 1.3.2. Cơ s lý thuy t Quá trình phân tách trong k thu t HPLC là do quá trình v n chuy n và phân b c a các ch t tan gi a 2 pha khác nhau. Khi pha ng di chuy n v i m tt c nh t nh qua c t s c ký s y các ch t tan b pha tĩnh lưu gi ra kh i c t. Tùy theo b n ch t pha tĩnh, ch t tan và pha ng mà quá trình r a gi i tách ư c các ch t khi ra kh i c t s c ký. N u ghi quá trình tách s c ký, chúng ta có s c [8], [11]. 1.3.3. Nguyên t c c u t o h th ng HPLC H th ng HPLC ơn gi n và làm vi c theo k thu t HPLC bao g m 6 b ph n chính sau: 1.3.3.1. H th ng bơm bơm pha ng vào c t tách. Bơm này ph i i u ch nh ư c áp su t (0 - 400 bar) 1.3.3.2. Bình ch a dung môi và h th ng x lý dung môi Bình ch a dung môi thư ng b ng th y tinh ho c thép không g . Dung môi ch y s c ký ư c l c qua màng l c (thư ng màng l c c l 0,45 µm ) và u i khí hòa tan. 1.3.3.3. H tiêm m u ưa m u phân tích vào c t. - 17 -
Có nhi u phương pháp tiêm m u khác nhau, ơn gi n nh t là s d ng m t van tiêm. Trong các h th ng s c ký hi n i là h tiêm m u t ng. M u th (d ng l ng hay d ng r n) u ph i hoà tan trong dung môi thích h p r i l c qua màng l c 0,45µm trư c khi tiêm. 1.3.3.4. C t s c ký l ng HPLC C t ư c ch t o b ng thép c bi t trơ v i hóa ch t, ch u ư c v i áp su t cao n vài trăm bar. - Chi u dài c t: 10, 15, ho c 25 cm; thích h p v i các ti u phân pha tĩnh có ư ng kính r t nh (3, 5, 10 µm). - ư ng kính c t: 4 ho c 4,6 mm. Nói chung, c t HPLC có tu i th khá dài n u ta s d ng úng cách. N u s d ng không úng cách tu i th c a c t s gi m. Ví d dung môi có tính ch t acid m nh ho c base m nh ho c tiêm liên ti p các m u sinh h c hay nguyên li u b n thì tu i th c a c t s b gi m. 1.3.3.5. Detector trong HPLC Là b ph n phát hi n ch t phân tích, tùy theo b n ch t c a ch t c n phân tích mà s d ng detector thích h p. Detector hay s d ng là detector h p th UV - VIS. Nguyên lý ho t ng c a detector UV - VIS d a trên nguyên lý ho t ng c a phương pháp o quang ph h p th . Ngoài ra còn có detector khúc x , huỳnh quang, i n hóa. 1.3.3.6. Thi t b hi n th k t qu Có nhi u lo i, nhưng ơn gi n và ph bi n nh t là máy t ghi các tín hi u dư i d ng pic [8], [14]. Sơ kh i h th ng HPLC ư c t ng quát hình 1.1 Van tiêm Bơm mẫu Binh chứa pha động Cột - 18 - Detector Bộ phận tự ghi
Hình 1.1: Sơ kh i t ng quát h th ng HPLC 1.3.4. Các thông s c trưng c a quá trình s c ký t R2 t R1 to W 0.5-1 W 0.5-2 t' R1 W b1 W b2 t' R2 Hình 1.2: S c ký c a 2 ch t và các thông s c trưng K t qu c a quá trình tách các ch t ư c detector phát hi n, phóng i và ghi thành s c ký v i các thông s : * tR (Th i gian lưu): th i gian k t khi ch t phân tích ư c bơm vào c t cho n khi ư c phát hi n n ng c u i c a nó. * t0 (Th i gian ch t): th i gian c n thi t pha ng ch y qua h th ng s c ký. * tR’ (Th i gian lưu th c): tR’ = tR - t0 * W0.5 : r ng c a pic n a chi u cao. * Wb : r ng áy pic. - 19 -
Th i gian lưu là thông tin v m t nh tính c a s c , nó là m t h ng s i v i m t ch t nh t nh khi ti n hành s c ký trong i u ki n không i. 1.3.4.1. H s dung lư ng k’ t' t −t t [8],[14] k' = R = R 0 = R −1 t 0 t 0 t 0 N u k' nh thì tR cũng nh và s tách kém. Trong th c t k' n m trong kho ng 2 - 5 là t t nh t. Hai ch t ch ư c tách ra kh i nhau n u chúng có giá tr khác nhau. Trong phân tích thư ng ch n c t, pha ng và các i u ki n phân tích sao cho: 1 < k' < 8 1.3.4.2. ch n l c α (selectivity - factor) α= k '2 = t R2 − t0 (k2' > k1' ) [8], [14] k' t 1 R1 − t0 α khác 1 càng nhi u thì kh năng tách càng rõ ràng, t i ưu t 1,5 n 2. 1.3.4.3. phân gi i (resolution) c trưng cho m c tách hai ch t ra kh i nhau trên m t i u ki n s c ký. phân gi i c a 2 pic c nh nhau ư c tính theo công th c: 2 (t − t R ,A ) = 1,18 (t − t R ,A )= N  α − 1  k 'B  [8], [14]   R ,B R ,B R =  wB + wA w 1/ 2B + w 1/ 2A 4  α  1+ k 'B    phân gi i cơ b n t ư c khi R = 1,5 1.3.4.4. H s b t i AF Cho bi t m c cân i c a pic s c ký, nó ư c tính theo công th c: AF = w 1 / 20 [8], [14] 2a Trong ó: W1/20: là chi u r ng c a pic ư c o 1/20 chi u cao c a pic a: kho ng cách t ư ng vuông góc h t nh pic n mép ư ng cong phía trư c t i v trí 1/20 chi u cao c a pic. Trong phép nh lư ng, yêu c u: 0,9 ≤ AF ≤ 2 [1], [18], [22]. - 20 -
1.3.4.5. S ĩa lý thuy t N c trưng cho hi u l c c t. 2 2 t   tR  N = 16 R hay N=5,54 [8], [12], [22]     wB  w 1 / 2B  N u g i L là chi u cao c t s c ký, thì chi u cao c a ĩa lý thuy t H L ư c tính b ng công th c: H= N 1.3.5. Cơ s lý thuy t c a vi c l a ch n i u ki n s c ký 1.3.5.1. L a ch n c t (pha tĩnh) [12], [18] Pha tĩnh trong HPLC là ch t nh i c t có nhi m v tách m t h n h p có nhi u thành ph n. Nó là m t ch t r n x p có kích thư c h t r t nh , ư ng kính c h t t 3 - 10 µm, di n tích b m t riêng t 50 - 500 m2/g. Yêu c u pha tĩnh trong HPLC:  Ph i trơ và b n v ng trong môi trư ng HPLC.  Có kh năng tách m t h n h p ch t tan nh t nh.  Tính ch t b m t n nh.  Cân b ng ng h c c a s tách di n ra nhanh và l p l i t t.  C h t ph i ng nh t. Pha tĩnh thư ng ư c ch t o trên n n silica (SiO2), n n oxyd nhôm (Al2O3), n n h p ch t cao phân t (cellulose) hay trên n n m ch carbon. Trong s c ký h p ph , pha tĩnh trên n n silica có nhi u ưu i m và s d ng nhi u nh t. Có th phân lo i ch t nh i c t theo g c siloxan: | 0 CH3 | |  Si  0  Si  R | | - 21 -
0 CH3 | * R là nhóm phân c c (ưa nư c): nhóm hydroxyl (-0H) ho c các alkylamin (-CH2NH2), alkylnitril (-CH2CN). Lo i này s d ng làm pha tĩnh trong s c ký pha thu n phân tích các ch t ít ho c không phân c c. * R là các nhóm ít phân c c: các nhóm octyl, octadecyl, phenyl ư c ch b ng cách alkyl hóa các nhóm OH trên b m t silica trung tính b ng các g c alkyl - R c a m ch carbon (C2, C8, C18) hay các g c carbon vòng (phenyl). Do các nhóm OH thân nư c ư c thay b ng các g c R k nư c nên b m t tr nên ít phân c c. Silica ã alkyl hóa ư c s d ng trong s c ký pha o phân tích các ch t phân c c, ít phân c c hay s c ký c p ion. 1.3.5.2. L a ch n pha ng cho HPLC [12], [18] Pha ng là dung môi r a gi i ch t phân tích ra kh i c t s c ký, là y u t th hai quy t nh hi u su t tách c a m t h n h p. Pha ng có th là nư c, dung môi h u cơ hay h n h p dung môi theo t l nh t nh. Pha ng trong HPLC nh hư ng t i r t nhi u thông s c a quá trình s c ký như ch n l c α, th i gian lưu tR, hi u l c tách c a c t, phân gi i RS , r ng c a pic s c ký ... Chính vì v y vi c l a ch n pha ng thích h p là r t quan tr ng. Yêu c u c a pha ng:  Ph i trơ v i pha tĩnh.  Hòa tan ư c ch t c n phân tích.  B n v ng theo th i gian.  Có tinh khi t cao.  Nhanh t cân b ng trong quá trình s c ký.  Phù h p v i detector.  Có tính kinh t và m b o môi trư ng. - 22 -