Mối liên quan giữa mức độ sao chép gen activation induced cytidine deaminase và tỷ lệ đột biến gen P53 ở mô ung thư gan

Chia sẻ: Nguyễn Thị Thanh Triều | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

41
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết trình bày nghiên cứu đánh giá mức độ sao chép của AID mô ung thư gan và xác định tỷ lệ đột biến gen p53 ở mô ung thư gan; so sánh mức độ sao chép của AID và tỷ lệ đột biến gen p53 ở mô ung thư gan.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Mối liên quan giữa mức độ sao chép gen activation induced cytidine deaminase và tỷ lệ đột biến gen P53 ở mô ung thư gan

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC MỐI LIÊN QUAN GIỮA MỨC ĐỘ SAO CHÉP GEN ACTIVATION INDUCED CYTIDINE DEAMINASE VÀ TỶ LỆ ĐỘT BIẾN GEN P53 Ở MÔ UNG THƯ GAN Lê Thị Thúy1, Trần Huy Thịnh1, Ôn Quang Phóng2, Trần Vân Khánh1, Tạ Thành Văn1 1 Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Xanh Pôn Activation Induced cytidine Deaminase (AID) là một trong những tác nhân gây đột biến nội sinh khi quá trình kiểm soát sự biểu hiện AID bị mất cân bằng. Các nghiên cứu gần đây cho thấy gen p53 liên quan đến sự ổn định của bộ gen tế bào kiểm soát sự phát sinh và phát triển của khối u. Nghiên cứu này tiến hành phân tích mối liên quan giữa mức độ phiên mã gen AID và tỷ lệ đột biến gen p53 trên mô ung thư gan. Kết quả nghiên cứu cho thấy: (1) Tỷ lệ mức độ sao chép gen AID/ß actin trên mô ung thư gan là 11,09 ± 4,7; trên mô xơ gan là 7,87 ± 1,97 và trên mô gan viêm là 2,18 ± 0,75. (2) Tỷ lệ đột biến gen p53 cao nhất tại mô ung thư gan (17,8%), tại xơ gan là 2,2% và không phát hiện đột biến gen p53 tại mô gan viêm. (3) Tỷ lệ mức độ sao chép gen AID/ß actin tại mô gan có đột biến gen p53 là 9,36 ± 3,13 và tại mô gan không có đột biến gen p53 là 9,39 ± 5,30. Kết quả trên cho thấy mức độ sao chép gen AID trên mô ung thư gan cao hơn trên mô xơ gan và cao hơn rõ rệt so với mô gan viêm. Tỷ lệ đột biến gen p53 trên mô gan ung thư cao hơn so với mô gan không ung thư. Tuy nhiên chưa thấy sự khác biệt về mức độ sao chép gen AID trên mô gan có và không có đột biến gen p53. Từ khóa: activation Induced cytidine deaminase (AID), gen p53, ung thư gan I. ĐẶT VẤN ĐỀ Quá trình phát sinh ung thư là quá trình liên quan đến sự tích lũy đột biến trên những gen chi phối sự tăng sinh và chết theo chương trình của tế bào (apoptosis). Mặc dù những bằng chứng phân tử liên quan trực tiếp đến quá trình phát sinh và phát triển ung thư tế miễn dịch, tăng IgM2 bẩm sinh ở người [8]. Mặt khác, ở tế bào không có thẩm quyền miễn dịch, sự tăng cường tổng hợp enzym AID gây nên hiện tượng chuyển đoạn nhiễm sắc thể, tích lũy đột biến khởi đầu cho quá trình ung thư hóa tế bào lành. Với vai trò quyết định trong quá trình siêu đột biến, AID được xem như một tác nhân gây đột biến nội sinh khi bào gan chưa được rõ ràng, nhưng các nhà khoa học cho rằng sự biến đổi liên tục của hệ quá trình kiểm soát sự biểu hiện AID bị mất cân bằng. Khi đó dưới tác động của các yếu gen là nguyên nhân của quá trình phát sinh tố hoạt hoá, AID sẽ tác động trực tiếp lên các gen kháng ung thư, từng bước làm bất hoạt ung thư gan. Theo nghiên cứu của dịch tể học thì hầu hết ung thư gan khởi phát trên bệnh lý viêm gan mạn tính và xơ gan. AID là enzym xúc tác sự loại bỏ gốc amin của cytidin (C) để tạo uracil (U). Gen AID là một gen then chốt quy định tính đa dạng của kháng thể thông qua hai quá trình: siêu đột biến (somatic hypermutation) và tái tổ hợp gen kháng thể (class switch recombination). Khi gen AID bị đột biến gây ra hội chứng suy giảm TCNCYH 80 (3) - 2012 và mất chức năng kháng ung thư của các gen đó và tích lũy đột biến [7; 9; 10]. Gen ức chế ung thư p53 là một gen tiêu biểu cho sự áp chế khối u và là gen cần thiết cho quá trình ngăn chặn sự phát triển tế bào bất thường nhằm duy trì sự ổn định của bộ gen sau những tổn thương di truyền của tế bào. Nghiên cứu gần đây đã cho thấy sự biểu hiện bất thường AID ở tế bào gan có thể tạo 1 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ra đột biến DNA, dẫn đến sự tích lũy đột biến đoán mô bệnh học tại bệnh viện Đại học Y làm biến đổi gen p53 góp phần vào quá trình phát sinh khối u [7, 9]. Dược thành phố Hồ Chí Minh. Để chứng minh vai trò của AID trong quá trình phát sinh và phát triển ung thư tế bào gan ở người, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu: (1) Đánh giá mức độ sao chép của AID ở mô ung thư gan, (2) Xác định tỷ lệ đột biến gen p53 ở mô ung thư gan, (3) So sánh mức độ sao chép của AID và tỷ lệ đột biến gen p53 ở mô ung thư gan. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Đối tượng - Mẫu nghiên cứu: 5 mẫu mô gan viêm, 10 mẫu mô xơ gan và 30 mẫu mô ung thư gan - Mẫu chứng: các mẫu mô lành được lấy tại vị trí cách khối u, tổ chức xơ hoặc viêm 5cm với số lượng tương đương với mẫu nghiên cứu. Toàn bộ các mẫu nghiên cứu được chẩn Tên 2. Phương pháp 2.1. Xác định mức độ sao chép gen AID ở mô gan - Real time- PCR khuếch đại gen mã hóa AID và ß actin ở mô gan: RNA tổng số được tách chiết, mức độ sao chép của gen AID ở mô gan được định lượng đối chiếu với gen nội chuẩn ß actin. Real time - PCR xác định chu kỳ ngưỡng của gen AID và chu kỳ ngưỡng của gen ß actin. Sử dụng phương pháp 2-ΔΔCt của Livak để định lượng tương đối mức độ sao chép các gen tại mô bệnh (mô tại vị trí khối u) và mô lành (mô cách vị trí khối u 5cm) [4]. Tỷ lệ sao chép gen AID ở mô ung thư dạ dày so với mô lành cách vị trí khối u là R = 2-ΔΔCt. Kỹ thuật Real time - PCR định lượng với cặp mồi và đầu dò đặc hiệu như sau: Trình tự AID forward primer 5'-AAA TGT CCG CTG GGC TAA GG-3' AID reverse primer 5'-GGA GGA AGA GCA ATT CCA CGT-3' AID TaqMan Probe 5'-TCG GCG TGA GAC CTA CCT GTG CTA C-3' β-actin forward primer 5’-GATGGCCACGGCTGCTT-3’ β-actin reverse primer 5’-ACCCTCATTGCCAATGGT-3’ β-actin TaqMan Probe 5’-CTACGAGCTGCCTGACGGCCAGG-3’ Thành phần của phản ứng PCR: 1 x Ex-Taq buffer: 2µl; 2,5 mM dNTP: 2µl; Ex Taq polymerase: 0,2µl; 10 pmol Primer: 1µl; 10 pmol Taqman probe: 1µl; cDNA 150 ng/ml: 2µl; nước cất: 11,8µl.Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 940C - 5 phút 94 0 C - 50 giây 58 0 C - 50 giây 72 0 C - 50 giây 25 chu kỳ 15 0 C - 5 phút Thí nghiệm được tiến hành 3 lần cho mỗi mẫu 2 TCNCYH 80 (3) - 2012 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Quy trình được thực hiện trên hệ thống 2.3. Xử lý số liệu: Xử lý số liệu theo phần mềm SPSS 16.0. Realtime PCR của hãng Eppendorf. 2.2. Xác định đột biến gen p53 III. KẾT QUẢ - Tách chiết DNA và xác định đột biến: exon 7 của gen p53 được khuếch đại bằng 1. Đặc điểm bệnh nhân phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu có trình tự như sau: - Tuổi: tuổi trung bình của nhóm nghiên cứu là 54,3 ± 13,0. Tuổi ít nhất là 23, tuổi cao P53-F: 5’- CTTGCCACAGGTCTCCCCAA - 3’; P53-R: 5’- AGGGGTCAGCGGCAAGCAGA - 3’ nhất là 80. Tuổi trung bình của nhóm viêm gan là 50,4 ± 8,3, của nhóm xơ gan là 58,7 ± 12,2 Sản phẩm PCR của exon 7 được cắt bằng enzym HaeIII. Những trường hợp phát hiện có và của nhóm ung thư gan là 58,7 ± 12,2. Tuổi ở các nhóm không có sự khác biệt (p > 0,05). đột biến bằng kỹ thuật cắt enzym giới hạn sẽ - Giới tính: nam chiếm 71,1% và nữ chiếm được kiểm tra kết quả bằng kỹ thuật giải trình tự gen trên hệ thống máy ABI của Hoa Kỳ. 28,9%. 2. Mức độ sao chép của gen AID ở mô gan Bảng 1. Sao chép gen AID ở mô gan viêm, xơ gan và ung thư gan n 2-ΔΔCt Gan viêm 5 2,18 ± 0,75 Xơ gan 10 7,87 ± 1,97 Ung thư gan 30 11,09 ± 4,73 Mẫu mô p1-3: gan viêm – ung thư gan p2-3: xơ gan – ung thư gan p1-3 < 0,05 p2-3 < 0,05 p1-2 < 0,05 p1-2: gan viêm – xơ gan - Tỷ lệ sao chép gen AID/ß actin ở mô ung thư gan so với mô lành (cách khối u 5cm) là 11,09 ± 4,73, trên mô gan viêm so với mô lành (cách khối viêm 5cm) là 2,18 ± 0,75 và trên mô xơ gan so với mô lành (cách khối xơ 5cm) là 7,87 ± 1,97. - Tỷ lệ sao chép gen AID/ß actin ở mô ung thư gan, mô xơ gan cao hơn rõ so với mô gan viêm (p < 0,05). 3. Tỷ lệ đột biến gen p53 trên mô gan Bảng 2. Tỷ lệ gen p53 đột biến trên mô gan Gan viêm (n = 5) Xơ gan (n = 10) Ung thư gan (n = 30) Đột biến 0 1 8 Không đột biến 5 9 22 Tổng cộng 5 10 30 Gen p53 TCNCYH 80 (3) - 2012 p > 0,05 3 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bảng 3. Tỷ lệ đột biến gen p53 trên mô ung thư gan và không ung thư gan Không ung thư (n1 = 15) Ung thư gan (n2 = 30) Đột biến 1 8 Không đột biến 14 22 Tổng cộng 15 30 Gen p53 p < 0,05 - Không phát hiện được đột biến gen p53 ở 5 mô gan viêm; một trường hợp đột biến gen p53 ở nhóm mô xơ gan, nhiều nhất là 8 trường hợp đột biến gen p53 ở nhóm mô ung thư gan (p > 0,05). - Khi so sánh giữa 2 nhóm ung thư gan và không ung thư (bao gồm gan viêm và xơ gan) cho thấy tỷ lệ đột biến gen p53 trên mô ung thư cao hơn so với mô không ung thư. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. 4. Mức độ sao chép AID tại mô gan có đột biến gen p53 so với mô gan không có đột biến gen p53 Bảng 4. Mức độ sao chép gen AID ở mô gan có và không có đột biến gen p53 n 2-ΔΔCt Đột biến 9 9,36 ± 3,13 Không đột biến 36 9,39 ± 5,30 Gen p53 p > 0,05 Tỷ lệ sao chép gen AID/ß actin trên mô gan có đột biến gen p53 là 9,36 ± 3,13, trên mô gan không có đột biến gen p53 là 9,39 ± 5,3. Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05. IV. BÀN LUẬN Ung thư gan nguyên phát là một trong 5 loại ung thư thường gặp. Việt Nam là quốc gia có tỉ lệ người mắc bệnh ung thư gan đứng hàng thứ 3 trên thế giới [1]. Đặc biệt, tỷ lệ nam mắc bệnh nhiều hơn nữ. Theo “ghi nhận ung thư quần thể” tại thành phố Hồ Chí Minh 2006, trở thành quốc gia có tỉ lệ người mắc bệnh ung thư gan hàng đầu thế giới [1]. Nghiên cứu này cho thấy tỷ lệ mắc ung thư gan ở nam giới là 71,1% và ở nữ giới là 28,9%, tỷ lệ mắc bệnh ở nam gấp khoảng 2.5 lần ở nữ với p > 0,05. Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê có thể là do số lượng bệnh nhân nghiên cứu ít nên chưa thể kết luận ung thư gan đứng hàng thứ 1 ở nam giới với tần suất là 24,2/100.000 dân và đứng hàng được mối liên quan giữa giới tính và ung thư gan. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của thứ 5 ở nữ giới với tần suất là 6,2/100.000 Chen C.J và cộng sự phát hiện tỷ lệ mắc ung thư gan của nam gấp 2,4 lần của nữ [2]. dân. Tại Bệnh viện Ung Bướu Tp.HCM, mỗi năm tiếp nhận khoảng 500 ca ung thư gan mới. Trong những năm gần đây, mỗi năm, Việt Nam có đến 10.000 ca mắc bệnh mới, và 4 Tuổi trung bình của nhóm nghiên cứu là 54,3 ± 13,0, tuổi thấp nhất là 23 và cao nhất là 80. Tuổi trung bình của nhóm viêm gan là 50,4 TCNCYH 80 (3) - 2012 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ± 8,3, nhóm xơ gan là 58,7 ± 12,2 và nhóm Kết quả nghiên cứu cho thấy: mức độ sao ung thư gan là 58,7 ± 12,2. Tuổi ở các nhóm không có sự khác biệt (p > 0,05), kết quả chép gen AID trên mô ung thư gan so với mô lành (cách khối u 5cm) là 11,09 ± 4,73 và trên nghiên cứu phù hợp với các nghiên cứu khác (tuổi thường gặp của ung thư gan là từ 40 ÷ mô gan viêm so với mô lành (cách khối viêm 5cm) là 2,18 ± 0,75 (p < 0,05). Trong khi đó 60) [2]. Gen p53 là một gen có kích thước lớn và mức độ sao chép gen AID trên mô xơ gan so với mô lành (cách khối xơ 5cm) là 7,87 ± 1,97 các nghiên cứu trên thế giới cho thấy đột biến (p > 0,05). Tadayuki Kou và cộng sự nghiên hay gặp nhất của gen p53 ở exon 7, vị trí 249 [8]. Do vậy, nghiên cứu này chỉ khảo sát đột cứu in vitro sử dụng dòng tế bào gan người nuôi cấy cũng cho thấy sự gia tăng biểu hiện biến gen p53 tại exon 7, đặc biệt là đột biến điểm tại vị trí 249 (AGG → AGT,), đột biến này AID ở mức độ mRNA ở tế bào gan viêm mạn là 38,7 ± 10,0 và tế bào ung thư gan là 78,1 ± gây ra biến đổi acid amin serin thành arginin (249ser). Kết quả nghiên cứu cho thấy: không 21,0 [10]. Nghiên cứu này cũng cho thấy không có có đột biến gen p53 được phát hiện ở nhóm sự khác biệt giữa mức độ sao chép gen AID/ß mô viêm gan; ở nhóm mô xơ gan phát hiện được một trường hợp đột biến (2,2%) và ở actin ở mô gan có đột biến gen p53 là 9,36 ± 3,13, ở mô gan không có đột biến gen p53 là nhóm mô ung thư gan phát hiện được 8 trường hợp đột biến gen p53 (17,8%). Khi so 9,39 ± 5,3. Kết quả này khác với các kết quả thu được từ nghiên cứu in vitro sử dụng dòng sánh giữa 2 nhóm mô ung thư gan và nhóm mô không ung thư gan (mô viêm gan và mô tế bào nuôi cấy của các tác giả khác. Điều này có thể được lý giải do sự không đồng nhất của xơ gan) cho thấy tỷ lệ đột biến gen p53 trên các mô nghiên cứu và mức độ phong phú của mô gan ung thư cao hơn so với mô gan không ung thư, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê các dòng tế bào và tỷ lệ khác nhau về số lượng các tế bào ung thư/các tế bào lành. (p < 0,05). Theo Kirk và cộng sự, tần suất xuất hiện đột biến gen p53 là 26,7% và tương Thêm vào đó, sự khác biệt nàycũng có thể do nghiên cứu này chỉ khảo sát đột biến gen p53 đương với kết quả thu được trong nghiên cứu này là 26,0%). Như vậy, từ các kết quả nghiên tại điểm hospot (điểm 249 của exon 7). Thành công của can thiệp điều trị ung thư cứu thấy rằng đột biến gen p53 có thể đóng gan nguyên phát phụ thuộc rất nhiều vào thời vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của ung thư gan [3]. gian phát hiện bệnh sớm hay muộn. Tại Việt Nam, các kỹ thuật sinh học phân tử đang Hiện nay việc chẩn đoán sớm ung thư gan vẫn đang là một thách thức đối với ngành y tế. được áp dụng ngày càng nhiều vào chẩn đoán và theo dõi điều trị các bệnh lý gây ra do Chẩn đoán ung thư gan hầu hết được thực hiện trên những bệnh nhân đã ở giai đoạn vi sinh vật, tổn thương di truyền... đặc biệt là các bệnh lý do HBV, HCV, HIV. Tuy nhiên, muộn làm hạn chế khả năng điều trị. Do vậy, trong lĩnh vực ung thư, chưa có nghiên cứu việc tìm ra các dấu ấn phân tử nhằm chẩn đoán sớm và chẩn đoán xác định đang là áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để chẩn đoán sớm và tiên lượng bệnh được hướng đi được các nhà khoa học quan tâm. Trong đó AID được coi là một trong những công bố. Bởi vậy, nghiên cứu này bước đầu cung cấp những bằng chứng khoa học giá trị dấu ấn nhiều triển vọng. nhằm góp phần làm sáng tỏ cơ chế bệnh sinh TCNCYH 80 (3) - 2012 5