Nghiên cứu áp dụng mê lọ nước và thử nghiệm cưỡng bức trên mô hình xuất huyết não thực nghiệm

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ÁP DỤNG MÊ LỌ NƢỚC VÀ THỬ NGHIỆM CƢỠNG<br /> BỨC TRÊN MÔ HÌNH XUẤT HUYẾT NÃO THỰC NGHIỆM<br /> Hồ Anh Sơn*; Nguyễn Viết Trung**; Nguyễn Trọng Tài***<br /> TÓM TẮT<br /> Mê lộ nƣớc Morris (MWM) đƣợc sử dụng để đánh giá trí nhớ không gian, chỉ huy vận động<br /> và bản đồ nhận thức. So sánh với các bài tập không gian khác nhƣ mê lộ chữ T, động vật chỉ<br /> cần quyết định chọn rẽ phải hoặc trái. Trong bài tập MWM, động vật cần phải liên tục có quyết<br /> định về hƣớng chuyển động của mình. Thử nghiệm cƣỡng bức vận động trên trục quay cũng<br /> đƣợc nghiên cứu áp dụng cho mô hình động vật đột quỵ nhằm đánh giá thực chất khả năng<br /> vận động của chúng. Để có thể áp dụng các bài tập trên trong nghiên cứu tại Học viện Quân y,<br /> chúng tôi tiến hành áp dụng bài tập MWM và cƣỡng bức vận động trên trục quay ở đối tƣợng<br /> chuột nhắt bị đột quỵ cho chảy máu não. Kết quả cho thấy có thể sử dụng các bài tập này để<br /> phân tích bài học không gian và khả năng vận động trên mô hình chuột nhắt bị xuất huyết não.<br /> * Từ khóa: Morris water maze; Mô hình đột quỵ; Chuột nhắt.<br /> <br /> Applying Morris water maze and forced task on<br /> brain haemorrhage mice model<br /> Summary<br /> The Morris water maze task (MWM) is supposed to measure spatial memory, movement control,<br /> and cognitive mapping. Comparing to other spatial tasks such as the t-maze, only requires the<br /> mouse to choose left or right. In the Morris water navigation task, the animal needs to decide<br /> continually where to go. In order to perform the task, animal do not need to be motivated by<br /> food deprivation or electrical shock. Also, forced task was applied for stroke animal model run<br /> on rota-rod to evaluate basically mobility. To apply in current study in our university, we tested<br /> MWM on the brain haemorrhage mice model. The results showed the MWM could be used to<br /> analyze the spatial learning, re-learning and spatial memory on brain haemorrhage mice.<br /> * Key words: Morris water maze; Stroke animal model; Mice.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Sử dụng mê lộ để đánh giá khả năng<br /> học và ghi nhớ không gian của động vật<br /> gặm nhấm là nội dung thí nghiệm thƣờng<br /> dùng trong nghiên cứu sinh lý thần kinh.<br /> <br /> Trong số các mê lộ cạn và mê lộ nƣớc<br /> hiện đang đƣợc sử dụng trên thế giới,<br /> mê lộ nƣớc Morris (Morris water maze,<br /> MWM) đƣợc lựa chọn với nhiều ƣu điểm<br /> [1, 2]. Sử dụng trục quay rota-rod cũng là<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> ** Bệnh viện Qu©n y 103<br /> *** Đại học Y Vinh<br /> Người phản hồi (Corresponding): Hồ Anh Sơn (hoanhson@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 20/02/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 05/05/2014<br /> Ngày bài báo được đăng: 26/05/2014<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014<br /> <br /> phƣơng pháp đánh giá vận động cƣỡng<br /> bức thƣờng dùng trên động vật. Cùng với<br /> MWM có thể đánh giá khả năng vận động<br /> của động vật do bị cƣỡng ép bơi (môi<br /> trƣờng nƣớc lạnh), trục quay buộc động<br /> vật phải vận động để có thể đứng trên<br /> trục mà không bị rơi. Do vậy, ứng dụng<br /> của MWM và phƣơng pháp cƣỡng bức<br /> vận động khá phổ biến trong nghiên cứu<br /> thần kinh nói chung, trí nhớ và vận động<br /> nói riêng. Trong nghiên cứu này, chúng<br /> tôi tiến hành xây dựng và thử nghiệm<br /> MWM và vận động cƣỡng bức trên trục<br /> quay với động vật bị gây tổn thƣơng não<br /> thực nghiệm do xuất huyết.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIấN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> Chuột nhắt trắng do Ban Cung cÊp<br /> ®ộng vật thÝ nghiÖm, Học viện Quân y cung<br /> cấp, không phân biệt giống, khoẻ mạnh,<br /> đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, cân nặng 20,0 <br /> 2,0 g. Chuột đƣợc nuôi trong điều kiện nhiệt<br /> độ 24 ± 20C, ánh sáng tự nhiên, nƣớc và<br /> thức ăn đƣợc nấu chín, bảo đảm theo nhu<br /> cầu. Quá trình nuôi đƣợc bắt đầu trƣớc khi<br /> tiến hành thí nghiệm ít nhất 3 ngày.<br /> 2. Ph-¬ng ph¸p nghiên cứu.<br /> - Tổng số chuột 30 con, chia đều thành<br /> các nhóm:<br /> + Nhóm chứng: chuột đƣợc phẫu thuật,<br /> nhƣng không đƣa hóa chất vào não (xem<br /> phẫu thuật gây xuất huyết não).<br /> + Nhóm nghiên cứu: chuột đƣợc gây<br /> đột quỵ chảy máu, sử dụng nƣớc cất.<br /> + Nhóm Não thông lạc: chuột đƣợc gây<br /> đột quỵ chảy máu, điều trị bằng viên nang<br /> Não thông lạc (bài thuốc do Viện Y học<br /> Cổ truyền Quân đội điều chế và sản xuất).<br /> - Phẫu thuật gây xuất huyết não:<br /> <br /> Chuột đƣợc gây mê bằng nembutal<br /> đƣờng phúc mạc với liều 40 mg/kg thể<br /> trọng. Cố định chuột trên hệ thống định vị<br /> M2009S, một lỗ nhỏ 0,5 mm trên xƣơng<br /> sọ bên phải, tại vị trí dự định đƣa hóa<br /> chất vào não, khoan với mũi khoan đƣờng<br /> kính 0,2 mm. Kim tiêm 31G nối với bơm<br /> tiêm siêu nhỏ (1 µl) gắn trên hệ thống<br /> thƣớc không gian ba chiều, đƣa chậm<br /> vào não tới đích là nhân bèo, theo tọa độ<br /> trƣớc-sau 1,0; bên 2,0; sâu 3,5 mm (tính<br /> từ điểm Bregma). Sau đó, bơm chậm 0,5<br /> µl dung dịch chứa 0,075 đơn vị collagen<br /> vào não. Đóng da đầu lại. Nhỏ kháng sinh<br /> gentamicine 80 mg/ml tại bề mặt xƣơng<br /> sọ bộc lộ trong quá trình phẫu thuật. Lô<br /> chứng đƣợc tiến hành các bƣớc nhƣ<br /> trên, nhƣng không đƣa kim tiêm và hóa<br /> chất vào não [2, 5].<br /> Cho chuột uống thuốc Não thông lạc<br /> kéo dài 10 ngày sau phẫu thuật với liều<br /> 0,1 ml/10 gr thể trọng (thuốc viên pha nƣớc<br /> cất thành dung dịch 10%). Thuốc uống qua<br /> sonde dạ dày 18G, nhóm chứng và nhóm<br /> nghiên cứu uống nƣớc cất với thể tích<br /> tƣơng đƣơng 0,1 ml/10 gr thể trọng.<br /> - Thử nghiệm tại MWM: bài tập này<br /> tiến hành liên tục trong 9 ngày, bắt đầu<br /> vào ngày thứ 7 đến ngày thứ 15 sau tổn<br /> thƣơng. Nội dung này thực hiện tại MWM.<br /> Mê lộ là bể hình tròn có đƣờng kính 80<br /> cm, cao 30 cm, sơn đen. Duy trì lƣợng<br /> nƣớc trong mê lộ ở mức 20 cm, nhiệt độ<br /> 18 - 200C trong suốt quá trình thí nghiệm.<br /> Một bến đỗ kích thƣớc 8 x 8 cm, làm<br /> bằng nhựa trong suốt, đặt tại một góc<br /> phần tƣ của mê lộ. Toàn bộ chƣơng trình<br /> bao gồm bài tập không gian (giai đoạn<br /> học, invisible task) kéo dài 7 ngày, bài tập<br /> Probe (trí nhớ không gian, Probe task)<br /> vào ngày thứ 8 và bài tập học lại (visible<br /> task) vào ngày thứ 9.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014<br /> <br /> + Bài tập không gian (Place task):<br /> trong suốt bài tập, bến đỗ luôn đƣợc đặt<br /> cố định tại chính giữa góc phần tƣ của<br /> mê lộ nƣớc hƣớng đông nam (phần tƣ<br /> đích), 1,5 cm dƣới mặt nƣớc. Mỗi ngày<br /> tập bao gồm 3 lƣợt, mỗi lƣợt tập kéo dài<br /> tối đa 90 giây, bắt đầu từ một trong ba<br /> góc phần tƣ còn lại của mê lộ. Nếu sau<br /> 90 giây, chuột không đến đƣợc đích (bến<br /> <br /> đỗ), chúng đƣợc hƣớng dẫn đến bến đỗ.<br /> Khi đến đƣợc đích, cho chuột ở đó 30<br /> giây. Khoảng cách giữa các lƣợt tập 1<br /> phút, trong thời gian này nhanh chóng lau<br /> khô và sƣởi ấm chuột. Toàn bộ quá trình<br /> chuột tập bài đƣợc ghi lại bằng camera,<br /> xử lý dữ liệu bằng phần mềm máy tính<br /> theo các tham số: thời gian tập bài, quãng<br /> đƣờng và vận tốc của chuột (hình 1).<br /> <br /> H×nh 1: Mª lé n-íc - bµi tËp Invislble.<br /> + Bài tập trí nhớ không gian (Probe task): trong bài tập này, bỏ bến đỗ ra ngoài, cho<br /> chuột bơi trong mê lộ 90 giây một lần duy nhất. Chuột nhớ lại vị trí của bến đỗ và có xu<br /> hƣớng bơi lâu hơn tại góc phần tƣ đích (góc có bến đỗ trong những ngày tập trƣớc).<br /> Camera và máy tính tự động ghi lại và phân tích thời gian chuột bơi tại mỗi góc phần<br /> tƣ của mê lộ theo các mức thời gian 30, 60 và 90 giây (hình 2).<br /> <br /> H×nh 2: Mª lé n-íc - bµi tËp Probe.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014<br /> <br /> + Bài tập học lại (Visible task): trong bài<br /> tập này, một bến đỗ dễ nhận thấy (cao hơn<br /> mặt nƣớc 1 cm) đƣợc đặt tại góc phần tƣ<br /> đối diện (góc tây bắc) với góc phần tƣ đích<br /> trong những ngày tập trƣớc (góc đông<br /> nam). Chuột tập bài 3 lần, mỗi lần 90 giây,<br /> khoảng cách giữa các lần tập đều 1 phút.<br /> Các lần tập xuất phát từ các góc phần tƣ<br /> khác nhau. Camera và máy tính tự động<br /> ghi lại và phân tích thời gian, vận tốc và<br /> quãng đƣờng bơi của mỗi chuột.<br /> - Đánh giá khả năng vận động chủ động:<br /> ®o tổng chiều dài quãng đƣờng vận động<br /> trong 5 phút (tiến hành vào ngày 1, 3 sau<br /> phẫu thuật gây đột quỵ). Đặt mỗi chuột<br /> trong hộp nhựa, kích thƣớc 20 x 30 cm và<br /> ghi quá trình vận động trong 5 phút bằng<br /> camera nối với máy tính. Phần mềm máy<br /> tính sẽ tự động phân tích tổng quãng đƣờng<br /> di chuyển và vận tốc trung bình của chuột.<br /> - Đánh giá khả năng vận động thụ<br /> động: đặt chuột lên trục quay vào ngày<br /> thứ 5 để làm quen với vận tốc khoảng 4<br /> <br /> vòng/phút. Ngày tiếp theo (ngày thứ 6),<br /> đặt chuột lên trục quay với vận tốc tăng<br /> dần từ 0 - 40 vòng/phút. Thời gian chuột<br /> ở trên trục quay đến khi bị rơi xuống<br /> đƣợc tự động ghi lại. Mỗi chuột thử<br /> nghiệm 3 lần. Ghi lại thời gian ở trên trục<br /> quay lâu nhất để lấy số liệu đánh giá.<br /> - Đánh giá tổn thƣơng não bằng giải<br /> phẫu bệnh: sau khi thực hiện toàn bộ các<br /> bài tập và uống thuốc, gây mê sâu chuột<br /> bằng nembutal, tiêm phúc mạc 80 mg/kg<br /> thể trọng sau 4 tuần sau khi phẫu thuật.<br /> Sau đó, phẫu tích lấy não chuột rồi ngâm<br /> vào dung dịch formalin 10% trong 24 giờ.<br /> Tiến hành đúc parafin và cắt lát, nhuộm<br /> tiêu bản bằng cresyl violet, chụp hình tiêu<br /> bản dƣới kính hiển vi. §o diện tích tổn<br /> thƣơng bằng phần mềm máy tính.<br /> * Phương pháp xử lý số liệu:<br /> Các số liệu thu thập đƣợc xử lý bằng<br /> thuật toán one-way ANOVA, phần mềm<br /> SPSS (12.0).<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Bài tập không gian (Invisible task).<br /> 25<br /> <br /> 600<br /> <br /> 500<br /> <br /> Chứng<br /> <br /> 15<br /> <br /> NTL<br /> NC<br /> 10<br /> <br /> L<br /> <br /> 5<br /> <br /> quãng đường (cm)<br /> <br /> vận tốc (cm/s)<br /> <br /> 20<br /> <br /> 400<br /> Chứng<br /> 300<br /> <br /> NTL<br /> NC<br /> <br /> 200<br /> 100<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> 7<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> 7<br /> <br /> ngày<br /> <br /> ngày<br /> <br /> Hình 3: Vận tốc và quãng đƣờng bơi của chuột trong bài tập không gian.<br /> Về tốc độ bơi và quãng đƣờng bơi, khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm chứng<br /> với hai nhóm bị gây đột quỵ. Không có sự khác biệt đáng kể về các tiêu chí này giữa<br /> nhóm chuột bị xuất huyết Não thông lạc và nhóm nghiªn cứu trong từng ngày bơi kế<br /> tiếp nhau.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014<br /> <br /> 2. Bài tập trí nhớ không gian (Probe task).<br /> <br /> Hình 4: Thời gian phân bố tại phần tƣ của MWM trong bài tập Probe.<br /> Trong bài tập trí nhớ không gian, chuột ở các lô đều sử dụng thời gian lâu hơn tại<br /> phần tƣ đích và không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các lô. Thời gian sử dụng tại<br /> phần tƣ đích giảm dần sau 30, 60, 90 giây bơi trong mê lộ nƣớc. Không có sự khác<br /> biệt đáng kể về thời gian bơi giữa các nhóm tại phần tƣ đích trong khoảng thời điểm<br /> 0 - 30; 30 - 60; 60 - 90 giây.<br /> <br />