TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 120-125<br />
<br />
NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA KHÁNG NGUYÊN<br />
BÁM DÍNH K88 TÁI TỔ HỢP PHÂN LẬP TỪ Escherichia coli MANG ĐỘC TỐ<br />
ĐƯỜNG RUỘT CỦA LỢN CON CAI SỮA<br />
Nguyễn Hoàng Lộc1*, Nguyễn Thị Khánh Quỳnh3, Hoàng Tấn Quảng2, Trần Thúy Lan2,<br />
Lê Mỹ Tiểu Ngọc2, Đinh Thị Bích Lân2, Phùng Thăng Long4<br />
1<br />
<br />
Trường đại học Khoa học, Đại học Huế, *nhloc@hueuni.edu.vn<br />
2<br />
Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế<br />
3<br />
Sở Khoa học và Công nghệ Thừa Thiên - Huế<br />
4<br />
Trường đại học Nông Lâm, Đại học Huế<br />
<br />
TÓM TẮT: Kháng nguyên bám dính là các yếu tố gây độc quan trọng của các chủng E. coli gây bệnh<br />
đường ruột (ETEC), từ đó mà vi khuẩn có khả năng xâm nhiễm vào ruột non của vật chủ. K88 (F4) là<br />
kháng nguyên bám dính đầu tiên được phát hiện trong các chủng ETEC phân lập từ lợn và là kháng<br />
nguyên bám dính phổ biến nhất ở các chủng E. coli gây bệnh tiêu chảy trên lợn con sau cai sữa. Chúng tôi<br />
đã tạo dòng và biểu hiện thành công gen faeG mã hóa kháng nguyên bám dính K88-1NT trong vi khuẩn<br />
E. coli BL21 (DE3). Kết quả tối ưu hóa các điều kiện sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp K88-1NT cho thấy<br />
chúng được sản xuất mạnh nhất sau 6 giờ cảm ứng bằng lactose 0,1%, mật độ tế bào (OD600) đạt 0,5 ở<br />
35oC. Môi trường cảm ứng bao gồm Na2HPO4.12H2O 1%, KH2PO4 0,3%, NaCl 0,05%, (NH4)2SO4 1%,<br />
MgSO4.7H2O 0,2%, glucose 1,5%, tryptone 1%, và dịch chiết nấm men 1%. Sản phẩm K88-1NT tinh sạch<br />
bằng sắc ký ái lực Ni2+ có khối lượng phân tử khoảng 31 kDa.<br />
Từ khóa: Escherichia coli, độc tố đường ruột, kháng nguyên bám dính, lợn con cai sữa.<br />
MỞ ĐẦU<br />
<br />
Kháng nguyên bám dính là các yếu tố gây<br />
độc quan trọng của các chủng E. coli gây bệnh<br />
đường ruột, nhờ các yếu tố bám dính có trên bề<br />
mặt như K88, K99, 987P, F17, F18 và F41, vi<br />
khuẩn E. coli mới có khả năng bám và xâm<br />
nhiễm vào ruột non của vật chủ để gây bệnh [13].<br />
Hầu hết các bộ phận bám dính đều được tìm thấy<br />
trên các vi khuẩn đường ruột và được gọi là<br />
fimbriae. Fimbriae là những cấu trúc liên kết có<br />
tính đa phân tử, khả năng miễn dịch cao và có<br />
khả năng liên kết với các thụ thể đặc hiệu [14].<br />
Sau khi phát hiện ra kháng nguyên K88 (F4)<br />
lần đầu tiên vào năm 1976, đã có nhiều công<br />
trình nghiên cứu đặc điểm và vai trò của yếu tố<br />
này trong quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn gây<br />
bệnh [12]. Thiry et al. (1989) [16] đã tạo dòng<br />
các trình tự DNA mã hóa kháng nguyên F4 và<br />
phân tích sự biểu hiện của pili này trong các<br />
plasmid pBR322, pACYC184. Nghiên cứu của<br />
Van den Broeck et al. (2000) [17] cho thấy, F4<br />
fimbriae được mã hóa bởi một nhóm 10 gen có<br />
chức năng riêng biệt, được ký hiệu tương ứng từ<br />
faeA-faeJ; trong đó, faeG là tiểu đơn vị chính.<br />
<br />
120<br />
<br />
Verdonck (2004) [18] đã phân lập gen mã hóa<br />
faeG, tạo dòng trong vector pET30Ek-LIC và<br />
biểu hiện với đuôi tận cùng His- và<br />
S-tag trong tế bào chất của E. coli BL21(DE3).<br />
FaeG tái tổ hợp có hoạt tính sinh học giúp lợn<br />
con chống lại sự xâm nhiễm của ETEC.<br />
Chúng tôi đã tạo dòng và biểu hiện thành<br />
công các kháng nguyên bám dính F4 (K881NT) tái tổ hợp trong tế bào E. coli BL21 (DE3)<br />
[8]. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết<br />
quả tối ưu biểu hiện của kháng nguyên này ở<br />
quy mô phòng thí nghiệm.<br />
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br />
<br />
Vật liệu sử dụng là chủng E. coli<br />
BL21(DE3) tái tổ hợp mang gen faeG-1NT [8].<br />
Nuôi cấy vi khuẩn<br />
Nuôi cấy vi khuẩn E. coli tái tổ hợp trong<br />
bình tam giác loại 250 mL chứa 50 mL môi<br />
trường dinh dưỡng (pH 7) ở 37oC, tốc độ lắc<br />
200 vòng/phút và tỷ lệ cấy giống là 0,1%. Cảm<br />
ứng biểu hiện kháng nguyên K88-1NT được<br />
thăm dò khi quá trình nuôi cấy đạt OD600 = 0,54,0, nhiệt độ cảm ứng từ 20-37oC với IPTG 0,5<br />
<br />
Nguyen Hoang Loc et al.<br />
<br />
Nuôi cấy vi khuẩn<br />
5<br />
<br />
Mật độ tế bào (OD600)<br />
<br />
mM. Thăm dò sử dụng lactose thay thế IPTG<br />
làm chất cảm ứng với các nồng độ từ 0,1-2%.<br />
Các môi trường được sử dụng để sản xuất kháng<br />
nguyên K88-1NT là LB [8], TB [15], YJ [9], cải<br />
tiến M9ZB [5] và HSG [11].<br />
Điện di SDS-PAGE<br />
Thu hồi sinh khối tế bào E. coli tái tổ hợp<br />
sau khi cảm ứng bằng ly tâm, phá vỡ tế bào<br />
bằng phương pháp sốc nhiệt và tách chiết<br />
protein hòa tan tổng số theo Champion™<br />
pET200 Directional TOPO® Expression Kit<br />
(Invitrogen, Hoa Kỳ).<br />
Biểu hiện của kháng nguyên bám dính được<br />
kiểm tra bằng điện di polyacrylamide gel 12%<br />
có SDS ở 60 V. Sau đó, gel được nhuộm với<br />
Coomassie Blue R250 và hình ảnh được phân<br />
tích bằng phần mềm Quality One (ver 4.1, BioRad).<br />
Tinh sạch kháng nguyên K88-1NT<br />
Sử dụng kit ProBondTM Purification System<br />
(Invitrogen, USA) theo nguyên lý sắc ký ái lực<br />
giữa đuôi 6×His trên protein dung hợp và phối<br />
tử Ni2+ trên cột sắc ký.<br />
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br />
45 kDa<br />
<br />
M<br />
<br />
NC1 NC2 20oC<br />
<br />
4<br />
<br />
3<br />
<br />
2<br />
<br />
1<br />
<br />
Thời gian (giờ)<br />
0<br />
2<br />
<br />
4<br />
<br />
6<br />
<br />
8<br />
<br />
10<br />
<br />
12<br />
<br />
14<br />
<br />
16<br />
<br />
18<br />
<br />
20<br />
<br />
Hình 1. Đường cong sinh trưởng của chủng<br />
E. coli BL21 (DE3) mang gen mã hóa kháng<br />
nguyên K88-1NT<br />
Đường cong sinh trưởng của tế bào được<br />
trình bày ở hình 1 với pha lag kéo dài khoảng 2<br />
giờ, pha sinh trưởng kéo dài từ 2-10 giờ, pha<br />
cân bằng duy trì từ 10-18 giờ và cuối cùng là<br />
pha chết. Mật độ tế bào tăng liên tục từ 2-10 giờ<br />
và đạt giá trị OD600 cao nhất là 4,45. Các thí<br />
nghiệm đánh giá sự biểu hiện của K88-1NT<br />
được thiết kế dựa trên đường cong sinh trưởng<br />
của E. coli tái tổ hợp.<br />
Ảnh hưởng của nhiệt độ cảm ứng<br />
<br />
25oC<br />
<br />
30 kDa<br />
<br />
30oC 35oC 37oC<br />
<br />
K88-1NT<br />
<br />
20,1 kDa<br />
<br />
Hình 2. Ảnh hưởng của nhiệt độ cảm ứng (20-37oC) lên sản xuất kháng nguyên K88-1NT. M: thang<br />
chuẩn khối lượng phân tử protein, NC1: E. coli không mang gen faeG-1NT, NC2: E. coli tái tổ hợp<br />
không được cảm ứng sinh trưởng ở 37oC.<br />
Nhiệt độ nuôi cấy là yếu tố ảnh hưởng rất<br />
lớn đến sự phát triển và biểu hiện protein tái tổ<br />
hợp của vi sinh vật. Hầu hết các công trình<br />
nghiên cứu đều rút ra kết luận về nhiệt độ tối ưu<br />
cho sự sinh trưởng của E. coli là 37oC [2, 3, 11].<br />
Tuy nhiên, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh<br />
trưởng của vi sinh vật chưa hẳn là nhiệt độ tốt<br />
cho sinh tổng hợp enzyme. Kết quả nghiên cứu<br />
<br />
của chúng tôi cho thấy, nhiệt độ thích hợp nhất<br />
để sản xuất K88-1NT dao động từ 30-37oC,<br />
trong đó, sự biểu hiện ở 35oC là ổn định nhất<br />
qua nhiều lần lặp lại thí nghiệm (hình 2), vì vậy<br />
chúng tôi sử dụng mức nhiệt độ này cho các<br />
nghiên cứu tiếp theo.<br />
Nhiều nghiên cứu cho thấy, nhiệt độ nuôi<br />
cấy ảnh hưởng rõ rệt lên quá trình biểu hiện của<br />
121<br />
<br />
TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 120-125<br />
<br />
các protein tái tổ hợp khác nhau, cụ thể, nhiệt<br />
độ tối ưu cho sản xuất protein dung hợp hBD4<br />
(human beta-defensin-4) trong tế bào E. coli là<br />
34oC [19], trong khi đối với enzyme GDP-LM<br />
<br />
NC<br />
<br />
0,5<br />
<br />
0,8<br />
<br />
1<br />
<br />
fucose synthase của E. coli K12 và protein<br />
YLR301W của Saccharomyces cerevisiae nhiệt<br />
độ tối ưu lại là 25oC [1, 2], thấp hơn nghiên cứu<br />
của chúng tôi.<br />
1,5<br />
<br />
2<br />
<br />
2,5<br />
<br />
3<br />
<br />
4<br />
<br />
45 kDa<br />
<br />
30 kDa<br />
<br />
K88-1NT<br />
<br />
20,1 kDa<br />
<br />
Hình 3. Ảnh hưởng của mật độ tế bào (OD600 = 0,5-4) trước khi cảm ứng lên sản xuất<br />
kháng nguyên K88-1NT. NC: E. coli tái tổ hợp không được cảm ứng sinh trưởng ở 35oC<br />
Ảnh hưởng của mật độ tế bào<br />
Nhiều tác giả đã chứng minh giai đoạn sinh<br />
trưởng của tế bào mà tại đó protein được cảm<br />
ứng biểu hiện có ảnh hưởng lớn đến sự tổng<br />
hợp và khả năng hoạt động của protein, vì vậy,<br />
cần thiết phải tối ưu mật độ tế bào trước khi bổ<br />
sung chất cảm ứng để biểu hiện mạnh protein<br />
tái tổ hợp [2].<br />
Ảnh hưởng của mật độ tế bào được khảo sát<br />
tại các giai đoạn sinh trưởng khác nhau (OD600<br />
từ 0,5-4), chạy điện di SDS sau 6 giờ cảm ứng<br />
bằng IPTG 0,5 mM. Kết quả trình bày ở hình 3<br />
cho thấy, mật độ tế bào ảnh hưởng rõ rệt đến<br />
khả năng sinh tổng hợp K88-1NT. Kháng<br />
nguyên K88-1NT chỉ được bắt đầu tổng hợp khi<br />
mật độ tế bào đạt OD600 từ 0,5-1, cao nhất khi<br />
OD600=0,5, sau đó, gần như không được tổng<br />
hợp nữa. Theo Liu et al. (2009) [6], mật độ tế<br />
M<br />
<br />
bào đạt OD600 bằng 0,5 là thời điểm thích hợp<br />
nhất để bổ sung IPTG, cảm ứng sự biểu hiện<br />
aminopeptidase N của lợn trong E. coli BL21<br />
(DE3), kết quả này cũng tương tự với kết quả<br />
của chúng tôi.<br />
Đối với biểu hiện các loại protein tái tổ hợp<br />
khác nhau trên E. coli BL21 (DE3) thì thời điểm<br />
thích hợp để cảm ứng là khác nhau. Xu et al.<br />
(2006) [19] khi nghiên cứu biểu hiện của betadefensin-4 của người nhận thấy protein tái tổ<br />
hợp được sản xuất mạnh khi cảm ứng ở OD600 =<br />
15. Thời điểm thích hợp nhất cho cảm ứng biểu<br />
hiện endoglucanase chịu nhiệt từ Clostridium<br />
thermocellum là OD600 từ 0,8-1 [4], của cystein<br />
protease từ Porphyromonas gingivalis là<br />
OD600=0,6 [10].<br />
Ảnh hưởng của lactose<br />
<br />
PC NC 0,1% 0,5% 1%<br />
<br />
1,5% 2%<br />
<br />
45 kDa<br />
<br />
30 kDa<br />
<br />
K88-1NT<br />
<br />
20,1 kDa<br />
<br />
Hình 4. Ảnh hưởng của nồng độ lactose (0,1-2%) lên sản xuất kháng nguyên K88-1NT.<br />
PC: E. coli tái tổ hợp cảm ứng bằng IPTG 0,5 mM ở 35oC;<br />
NC: E. coli tái tổ hợp không được cảm ứng sinh trưởng ở 35oC.<br />
<br />
122<br />
<br />
Nguyen Hoang Loc et al.<br />
<br />
Isopropyl<br />
β-D-1-thiogalactopyranoside<br />
thường được sử dụng để cảm ứng biểu hiện<br />
protein tái tổ hợp trong E. coli, tuy nhiên, chúng<br />
cần phải được loại bỏ trong sản phẩm thu được<br />
vì có nhiều độc tính. Hơn nữa, đây là hợp chất<br />
có giá đắt hơn hàng trăm lần so với lactose (tính<br />
theo liều lượng cho hiệu quả cảm ứng tương<br />
đương). Vì vậy, sử dụng lactose để thay thế<br />
IPTG đã được nhiều tác giả nghiên cứu và thu<br />
được kết quả khả quan [5, 7, 20]. Sử dụng<br />
lactose để cảm ứng cũng có khi cho hiệu quả<br />
cao hơn IPTG [5].<br />
Kết quả trình bày ở hình 4 cho thấy, các<br />
nồng độ khác nhau của lactose không ảnh<br />
hưởng nhiều đến lượng K88-1NT thu được, so<br />
với IPTG, lượng K88-1NT thu được cũng tương<br />
đương. Do đó, chúng tôi chọn nồng độ lactose<br />
thấp nhất (0,1%) để sử dụng cho các nghiên cứu<br />
tiếp theo.<br />
Nồng độ lactose thích hợp cho sự biểu hiện<br />
protein tái tổ hợp ở E. coli BL21 cũng tùy thuộc<br />
vào từng loại protein cần tổng hợp, chẳng hạn<br />
sản xuất alkaline lipase từ Proteus vulgaris K80<br />
là 1,88% [5], rLTB và rLTKA63 từ<br />
M<br />
<br />
NC1 NC2<br />
<br />
LB<br />
<br />
Helicobacter pylori là 0,08% [20] hay protease<br />
NPRC10 từ E. coli BL21 là 0,5% [7]. Như vậy,<br />
kết quả nghiên cứu của chúng tôi có hiệu quả rất<br />
lớn, hàm lượng lactose sử dụng thấp trong khi<br />
lượng protein tái tổ hợp thu được không thua<br />
kém khi cảm ứng bằng IPTG.<br />
Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy<br />
Các loại môi trường tổng hợp thường được<br />
sử dụng trong nuôi cấy sản xuất protein tái tổ<br />
hợp. Trong đó, môi trường có bổ sung dịch<br />
chiết nấm men thích hợp cho nuôi cấy tế bào<br />
mật độ cao, vì nó chứa một số khoáng chất,<br />
vitamin và amino acid. Cung cấp đầy đủ dịch<br />
chiết nấm men sẽ ngăn cản được sự phân cắt<br />
các protein tái tổ hợp [3]. Vì thế, chúng tôi đã<br />
thăm dò một số môi trường cơ bản để sản xuất<br />
protein K88-1NT, kết quả được trình bày trong<br />
hình 5. Trong các môi trường được nghiên cứu,<br />
môi trường YJ hoặc M9ZB cải tiến thích hợp<br />
nhất cho sản xuất protein K88-1NT, trong đó<br />
môi trường M9ZB cải tiến có hiệu quả kinh tế<br />
hơn. Môi trường LB không tốt cho sản xuất<br />
K88-1NT, thể hiện trên hình ảnh điện di<br />
(hình 5).<br />
TB<br />
<br />
YJ M9ZB HSG<br />
<br />
45 kDa<br />
K88-1NT<br />
<br />
30 kDa<br />
<br />
20,1 kDa<br />
<br />
Hình 5. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sản xuất kháng nguyên K88-1NT<br />
NC1: E. coli không mang gen faeG-1NT, NC: E. coli tái tổ hợp không được cảm ứng<br />
sinh trưởng trong môi trường LB ở 35oC<br />
M<br />
<br />
1<br />
<br />
2<br />
<br />
45 kDa<br />
<br />
30 kDa<br />
<br />
K88-1NT<br />
<br />
Hình 6. Protein kháng nguyên<br />
K88-1NT sau khi tinh sạch bằng<br />
sắc ký ái lực<br />
1. đệm rửa giải có pH 6,0;<br />
2. đệm rửa giải có pH 5,3.<br />
<br />
20,1 kDa<br />
<br />
123<br />
<br />
TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 120-125<br />
<br />
Tinh sạch kháng nguyên K88-1NT<br />
Kết quả tinh sạch kháng nguyên K88-1NT<br />
bằng ProBondTM Purification System kit<br />
(Invitrogen, USA) cho thấy xuất hiện 1 băng<br />
đậm ở vị trí khoảng 31 kDa, đúng bằng kích<br />
thước của protein dung hợp K88-1NT (hình 6).<br />
Vì vậy, có thể khẳng định gen faeG-1NT đã<br />
được biểu hiện thành công và đặc hiệu. Vì vậy,<br />
có thể sử dụng kháng nguyên K88-1NT trong<br />
nghiên cứu sản xuất kháng thể kháng K88 làm<br />
nguyên liệu cho sản xuất kit chẩn đoán bệnh<br />
tiêu chảy do E. coli gây ra sau này.<br />
KẾT LUẬN<br />
<br />
Kết quả tối ưu hóa các điều kiện sản xuất<br />
kháng nguyên tái tổ hợp K88-1NT cho thấy,<br />
chúng được sản xuất mạnh nhất sau 6 giờ cảm<br />
ứng bằng 0,1% lactose, mật độ tế bào (OD600)<br />
đạt 0,5 ở 35oC trên môi trường M9ZB cải tiến.<br />
Sản phẩm K88-1NT tinh sạch bằng sắc ký ái lực<br />
Ni2+ có khối lượng phân tử khoảng 31 kDa.<br />
TÀI LIỆU THAM KHẢO<br />
<br />
1. Ahn W. S., Ahn J. Y., Jung C. H., Wang K.<br />
Y., Kim E. E., Kim J., Im H., Kim J. O., Yu<br />
M. H., Lee C., 2007. Optimization of<br />
expression conditions for soluble protein by<br />
using a robotic system of multi-culture<br />
vessels. J. Microbiol. Biotechnol., 17: 18681874.<br />
2. Byun S. G., Kim M. D., Lee W. H., Lee K.<br />
J., Han N. S., Seo J. H., 2007. Production of<br />
GDP-L-fucose,<br />
L-fucose<br />
donor<br />
for<br />
fucosyloligosaccharide<br />
synthesis,<br />
in<br />
recombinant Escherichia coli. Appl.<br />
Microbiol. Biotechnol., 74: 768-775.<br />
3. Goyal D., Sahni G., Sahoo D. K., 2009.<br />
Enhanced production of recombinant<br />
streptokinase in Escherichia coli using fedbatch culture. Biores. Technol., 100: 44684474.<br />
4. Juhasz T., Szekely E., Simandi B., Szengyel<br />
Z. S., Reczey K., 2003. Recovery of a<br />
recombinant thermostable endoglucanase<br />
from E. coli using supercritical carbon<br />
dioxide cell disruption. Chem. Biochem.<br />
Eng. Q., 17(2): 131-134.<br />
124<br />
<br />
5. Lee H. W., Yoon S. J., Kim H. K., Park K.<br />
M., Oh T. K., Jung J. K., 2000.<br />
Overexpression of an alkaline lipase gene<br />
from Proteus vulgaris K80 in Escherichia<br />
coli BL21/pKLE. Biotechnol. Lett., 22:<br />
1543-1547.<br />
6. Liu B., Li G., Sui X., Yin J., Wang H., X.<br />
R., 2009. Expression and functional analysis<br />
of porcine aminopeptidase N produced in<br />
prokaryotic<br />
expression<br />
system.<br />
J.<br />
Biotechnol., 10: 95-101.<br />
7. Loc N. H., Giap D. V., Quang H. T., 2011.<br />
Production of NPRC10 protease by<br />
recombinant Escherichia coli through<br />
submerged culture in 40-L fermenter. Ann.<br />
Biol. Res., 2(6): 62-68.<br />
8. Loc N. H., Ngoc L. M. T., Lan T. T., Viet L.<br />
Q., Thao L. D., Quang H. T., Lan D. T. B.,<br />
Long P. T., 2013. Cloning and expression of<br />
genes encoding F107-C and K88-1NT<br />
fimbrial proteins of enterotoxigenic<br />
Escherichia coli from piglets. Indian J.<br />
Microbiol., 53(4): 488-491.<br />
9. Loc N. H., Quang H. T., Lam B. T. H.,<br />
Trang D. T. T., 2011. The effects of culture<br />
conditions on neutral protease (NPRC10) in<br />
a recombinant Escherichia coli BL21<br />
(DE3). Ann. Biol. Res., 2(3): 474-485.<br />
10. Margetts M. B., Barr I. G., Webb E. A.,<br />
2000. Overexpression, purification, and<br />
refolding of a Porphyromonas gingivalis<br />
cysteine protease from Escherichia coli.<br />
Protein Expr. Purif., 18: 262-268.<br />
11. Miksch G., Ryu S., Risse J. M., 2008.<br />
Factors that influence the extracellular<br />
expression of streptavidin in Escherichia<br />
coli using a bacteriocinrelease protein.<br />
Appl. Gene Mol. Biotechnol., 10: 124-129.<br />
12. Mooi F. R., Claassen I., Baker D., Kuipers<br />
H., De Graaf F. K., 1986. Regulation and<br />
structure of an Esciherichia coli gene<br />
coding for an outer membrane protein<br />
involved in export of K88ab fimbrial<br />
subunits. Nucleic Acids Res., 14: 24432457.<br />
13. Mulvey M. A., 2002. Adhesion and entry of<br />
<br />