Nghiên cứu cấu trúc và sàng lọc dòng nấm men Pichia Pastoris tái tổ hợp đa bản sao biểu hiện nhân tố tăng trưởng từ tiểu cầu (BB-PDGF-BB) mức độ cao

TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 77-83<br /> <br /> <br /> <br /> NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC VÀ SÀNG LỌC DÒNG NẤM MEN Pichia pastoris<br /> TÁI TỔ HỢP ĐA BẢN SAO BIỂU HIỆN NHÂN TỐ TĂNG TRƯỞNG<br /> TỪ TIỂU CẦU (BB-PDGF-BB) MỨC ĐỘ CAO<br /> <br /> Vương Cát Khánh, Ngô Thị Huyền Trang, Nguyễn Phạm Phương Thanh,<br /> Đặng Thị Phương Thảo*, Trần Linh Thước<br /> Trường Đại học Khoa học tự nhiên tp Hồ Chí Minh, *thaodp@hcmus.edu.vn<br /> <br /> TÓM TẮT: Nhân tố tăng trưởng từ tiểu cầu PDGF-BB (Platelet derived growth factor) đã được tổ chức<br /> FDA-Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) phê chuẩn là sản phẩm sử dụng trong điều trị chứng loét<br /> chân do đái tháo đường. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tạo dòng thành công các chủng nấm men tái<br /> tổ hợp mang gen pdgf và sàng lọc được 2 dòng Pichia pastoris tái tổ hợp mang nhiều bản sao gen pdgf.<br /> Các dòng tái tổ hợp đa bản sao gen pdgf sau khi sàng lọc đã được kiểm tra và so sánh khả năng biểu hiện<br /> PDGF với dòng đơn bản sao. Kết quả cho thấy khả năng biểu hiện PDGF tăng theo số lượng bản sao gen<br /> mục tiêu sát nhập vào trong bộ gen. Chủng đa bản sao thu nhận được có khả năng sản xuất lượng PDGF<br /> chiếm trên 50% tổng lượng protein tiết ra môi trường.<br /> Từ khóa: Pichia pastoris, dòng đa bản sao, đái tháo đường, PDGF-BB tái tổ hợp.<br /> <br /> MỞ ĐẦU đổi sau dịch mã. Bên cạnh các ưu điểm trên, hệ<br /> PDGF (Platelet derived growth factor) là thống này có tính bền vững di truyền qua nhiều<br /> một yếu tố phân bào chủ yếu của nguyên bào thế hệ tế bào do vector tái tổ hợp mang gen mục<br /> sợi, tế bào cơ trơn và nhiều tế bào khác, được tiêu có thể được sát nhập vào bộ gen nấm men<br /> sản xuất từ tiểu cầu. PDGF giữ nhiều chức năng theo cơ chế tái tổ hợp tương đồng giữa DNA<br /> trong cơ thể, đặc biệt là chức năng tham gia plasmid và vùng trình tự tương đồng trên bộ gen<br /> điều hòa và thúc đẩy quá trình làm lành vết theo 2 cách: (1) gắn chèn vector vào bộ gen<br /> thương [6]. Protein này tác động đến nhiều tế nấm men hoặc (2) thay thế gen, loại bỏ hoàn<br /> bào liên quan đến quá trình hàn gắn vết thương toàn gen AOX1 trong bộ gen nấm men. Số<br /> như: kích thích sự phân bào và hướng hóa của lượng bản sao của gen mục tiêu sát nhập vào bộ<br /> nguyên bào sợi và tế bào cơ trơn, kích thích đại gen chủng chủ nấm men có thể là một trong các<br /> thực bào sản xuất và tiết những nhân tố tăng yếu tố giúp gia tăng mức độ biểu hiện protein<br /> trưởng quan trọng, kích thích sự sản sinh những mục tiêu. Hơn nữa, protein ngoại lai được tiết ra<br /> phân tử fibronectin, collagen, proteoglycan và ngoài môi trường ở dạng có hoạt tính, vì thế,<br /> hyaluronic acid. Trong giai đoạn tái tạo, PDGF quá trình thu nhận, tinh chế protein dễ dàng hơn<br /> có vai trò kích thích sản xuất và tiết collagenase so với protein được biểu hiện ở dạng nội bào.<br /> bởi nguyên bào sợi cũng như sự co các sợi Ngoài ra so với Saccharomyces cerevisiae<br /> collagen [1]. Với sự gia tăng bệnh đái tháo protein được biểu hiện ở Pichia pastoris không<br /> đường như hiện nay, tỷ lệ bệnh nhân mắc chứng bị đường hóa quá mức và không hình thành liên<br /> loét chân ngày càng tăng. Tuy nhiên, tại Việt kết α-1,3 glycan, liên kết này được cho là gây ra<br /> Nam, nguồn cung cấp PDGF chủ yếu là từ nước đáp ứng miễn dịch khi dùng trong trị liệu [2, 4,<br /> ngoài với giá thành cao. Điều này đặt ra yêu cầu 5].<br /> cấp thiết trong việc nghiên cứu công nghệ sản VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> xuất PDGF nhằm phát triển sản phẩm thuốc<br /> Vật liệu plasmid pPICZαA (V195-20,<br /> điều trị có hiệu quả với giá thành hợp lý.<br /> Invitrogen); chủng E. coli DH5α [F-,<br /> Trong số các hệ thống biểu hiện protein 80lacZM15, recA1, endA1, hsdR17(rk-, mk+),<br /> người tái tổ hợp, Pichia pastoris được xem như phoA, supE44, -, thi-1, gyrA96, relA1]<br /> một hệ thống nổi bật với nhiều ưu điểm như dễ (Invitrogen) được cung cấp bởi Bộ môn Công<br /> nuôi cấy, tăng trưởng nhanh, protein được biến nghệ sinh học phân tử và Môi trường, Trường<br /> <br /> <br /> 77<br />  Vuong Cat Khanh et al.<br /> <br /> Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Bộ gen của các thể biến nạp sau khi pha<br /> thành phố Hồ Chí Minh; chủng Pichia pastoris loãng trong khoảng 6.255 ng - 800 ng được<br /> X33 (C180-00, Invitrogen). dùng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi<br /> Tạo dòng tế bào E. coli DH5α mang plasmid 5’AOX1 và 3’AOX1 trong 20 chu kỳ. Kết quả<br /> biểu hiện PDGF-BB (PDGF) khuếch đại được điện di trên gel agarose 1% và<br /> phân tích bằng phần mềm ImageJ nhằm xác<br /> Gen pdgf được thu nhận bằng phương pháp<br /> định số bản sao gen pdgf trong bộ gen nấm men.<br /> PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu FXhoI và RnotI.<br /> Số bản sao gen pdgf trong bộ gen nấm men<br /> Sản phẩm PCR (357 bp, mã hóa cho chuỗi<br /> được tính thông qua tỷ lệ sản phẩm khuếch đại<br /> polypeptide dài 119 acid amin với khối lượng<br /> chứa gen pdgf so với sản phẩm khuếch đại gen<br /> phân tử là 17 KDa) sau khi tinh sạch được xử lý<br /> AOX1, một gen nội sinh của nấm men. Các kết<br /> với enzyme XhoI và NotI, sau đó nối vào vector<br /> quả phân tích được xử lý bằng phầm mềm<br /> pPICZαA cũng đã được cắt mở vòng bằng 2<br /> ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/download.html)<br /> enzyme trên. Plasmid tái tổ hợp pPICZαA/pdgf<br /> được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α bằng Đánh giá khả năng tăng trưởng và biểu hiện<br /> phương pháp hóa biến nạp, sử dụng yếu tố chọn của các thể biến nạp chứa nhiều bản sao<br /> lọc là khả năng kháng kháng sinh zeocine. Một khuẩn lạc đơn X33, X33 chứa<br /> pPICZαA và các thể biến nạp mang gen pdgf<br /> Plasmid tái tổ hợp pPICZαA/pdgf được<br /> được hoạt hóa trong môi trường BMGY lỏng<br /> kiểm tra sự chèn gen pdgf bằng kỹ thuật PCR<br /> (có thành phần gồm cao nấm men 1%, peptone<br /> với cặp mồi FXhoI và 3’AOX, enzyme cắt giới<br /> 2%, YNB 1,34%, 10% citrate buffer 1 M pH<br /> hạn XhoI và NotI, giải trình tự.<br /> 4,0; biotin 4×10-5%, glycerol 1% [7]), nuôi cấy<br /> Tạo dòng tế bào Pichia pastoris X33 mang gen lắc qua đêm 250 vòng/phút, ở 300C đến khi<br /> mã hóa PDGF OD600 của dịch nuôi cấy đạt 2-6. Sau đó sinh<br /> Plasmid tái tổ hợp pPICZαA/pdgf được thu khối được chuyển vào môi trường BMMY (có<br /> nhận từ chủng E. coli DH5α bằng phương pháp thành phần như môi trường BMGY nhưng<br /> SDS kiềm, sau đó xử lý bằng enzyme SacI để glycerol được thay thế bằng methanol có nồng<br /> cắt mở vòng, điện biến nạp vào tế bào Pichia độ cuối là 0,5% (v/v)) và tiếp tục nuôi cấy lắc.<br /> pastoris (P. pastoris) X33 và được nuôi cấy trên Sau mỗi 24 giờ, bổ sung methanol đạt nồng độ<br /> môi trường YPD (có thành phần gồm cao nấm cuối 0,5%, đồng thời dịch nuôi cấy được thu<br /> men 1%, peptone 2%, dextrose 2%, agar 2% nhận, đo OD600 để đánh giá khả năng tăng<br /> [7]) có nhân tố chọn lọc là zeocine 100 g/ml, ở trưởng. Quá trình cảm ứng biểu hiện các thể<br /> 25oC, 3-5 ngày. biến nạp trên môi trường BMMY pH 4,0 được<br /> Kiểm tra kiểu hình, kiểu gen của các thể biến thực hiện tương tự như trên, 72 giờ sau cảm<br /> nạp ứng, dịch nuôi cấy được ly tâm 13000<br /> vòng/phút, trong 5 phút, sau đó loại sinh khối,<br /> Kiểm tra kiểu hình: các thể biến nạp được cấy<br /> thu nhận dịch môi trường. Sự biểu hiện protein<br /> đồng thời lên hai môi trường MM (môi trường tối<br /> PDGF được kiểm tra bằng phương pháp điện di<br /> thiểu chứa methanol có thành phần YNB 1,34%,<br /> trên gel SDS-PAGE, phân tích bằng phần mềm<br /> biotin 4.10-5%, methanol 0,5%) và MD (môi<br /> Quantity One ((Biorad, http://www.bio-<br /> trường tối thiểu có chứa dextrose có thành phần<br /> rad.com/en-us/product/quantity-one-1-d-<br /> YNB 1,34%, biotin 4×10-5%, glucose 2%), sau đó<br /> analysis-software) và lai Western<br /> đem ủ ở 25oC trong 3-4 ngày và quan sát.<br /> Kiểm tra kiểu gen: bộ gen của các thể biến KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> nạp được tách chiết và kiểm tra kiểu gen bằng<br /> phản ứng PCR với cặp mồi 5’AOX1 và Tạo dòng tế bào E. coli DH5α mang plasmid<br /> 3’AOX1. biểu hiện PDGF<br /> Xác định số bản sao của vector mang gen Plasmid tái tổ hợp pPICZαA/pdgf sau khi tạo<br /> trong bộ gen của P. pastoris bằng phương thành được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α.<br /> pháp PCR bán định lượng Các thể biến nạp sau khi sàng lọc trên môi<br /> <br /> <br /> 78<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 77-83<br /> <br /> trường kháng sinh zeocine được tiếp tục kiểm tra vạch có kích thước vào khoảng 870 bp trên bản<br /> bằng phương pháp PCR khuẩn lạc sử dụng cặp điện di) được tiếp tục tách chiết thu nhận plasmid<br /> mồi 5’AOX1 và 3’AOX1. Các thể biến nạp cho tái tổ hợp bằng phương pháp SDS-kiềm (kết quả<br /> kết quả PCR khuẩn lạc dương tính (xuất hiện 1 không được trình bày ở đây).<br /> <br /> a b<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Sàng lọc vector tái tổ hợp mang gen pdgf<br /> a. Sàng lọc vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR; a1. Vị trí mồi AOX1 trên bộ gen nấm men tái tổ<br /> hợp; a2. Kiểm tra vector tái tổ hợp bằng PCR; b. Kiểm tra vector tái tổ hợp mang gen pdgf bằng<br /> phương pháp cắt giới hạn; b1. Vị trí enzyme cắt giới hạn trong vector; b2. Xử lý vector tái tổ hợp<br /> bằng enzyme cắt giới hạn.<br /> <br /> Nhằm phát hiện gen pdgf trên plasmid Điều này cho phép kết luận chúng tôi đã tạo<br /> pPICZαA/pdgf, plasmid tái tổ hợp được phân dòng hóa thành công gen pdgf vào vector biểu<br /> tích bằng phương pháp sử dụng cặp mồi đặc hiện pPICZαA trong tế bào E. coli DH5α.<br /> hiệu FXhoI (mồi xuôi) trên gen và 3’AOX1 (mồi Tạo dòng tế bào P. pastoris X33 mang gen mã<br /> ngược) trên plasmid. Những plasmid pPICZαA hóa PDGF<br /> có chèn gen pdgf sẽ cho vạch DNA với kích<br /> thước khoảng 540 bp, tương ứng với với kích Plasmid pPICZα/pdgf được đưa về dạng<br /> thước vạch gen pdgf cộng với một đoạn DNA thẳng bằng cách xử lý với enzyme SacI và điện<br /> trên plasmid pPICZαA. Trong khi đó, với khuôn biến nạp vào tế bào chủ P. pastoris X33. Các<br /> là plasmid pPICZαA không mang gen pdgf nên thể biến nạp sau khi sàng lọc dựa trên khả năng<br /> không có sản phẩm PCR (hình 1a). kháng kháng sinh zeocine được kiểm tra kiểu<br /> hình và kiểu gen.<br /> Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp<br /> pPICZαA/pdgf bằng enzyme XhoI và NotI cho 2 MM MD<br /> vạch đúng như dự kiến: một vạch có kích thước<br /> tương ứng với kích thước của plasmid<br /> pPICZαA, và một vạch có kích thước tương ứng<br /> với gen pdgf (hình 1b).<br /> Đồng thời, kết quả giải trình tự gen pdgf trên<br /> plasmid pPICZαA/pdgf bằng cặp mồi 5’AOX1<br /> và 3’AOX1 sau khi so sánh với trình tự lý<br /> thuyết do chúng tôi thiết kế và cải biên cho gen<br /> pdgf biểu hiện trong nấm men bằng phần mềm<br /> Jellyfish (http://www.cbcb.umd.edu/ Hình 2. Kết quả kiểm tra kiểu hình nấm men<br /> software/jellyfish/) cho độ tương đồng 100%. mang gen pdgf<br /> <br /> <br /> 79<br />  Vuong Cat Khanh et al.<br /> <br /> Khi DNA plasmid được sát nhập vào bộ gen được tách chiết và thực hiện phản ứng PCR<br /> của tế bào chủ P. pastoris trong quá trình tái tổ kiểm tra kiểu gen bằng cặp mồi 5’AOX1 và<br /> hợp tương đồng, gen AOX1 (mã hóa cho 3’AOX1. Sản phẩm PCR từ các chủng Mut+ khi<br /> enzyme alcohol oxidase, enzyme chính quy điện di sẽ thu được 2 vạch. Một vạch có kích<br /> định khả năng sử dụng methanol của P. thước 875 bp tương đương kích thước tổng của<br /> pastoris) có thể giữ lại hoặc bị loại bỏ, vì vậy gen pdgf và vùng gen AOX1 nằm trên plasmid.<br /> kiểu hình của thể biến nạp sẽ thay đổi. Nếu gen Vạch còn lại có kích thước khoảng 2,2 kb,<br /> AOX1 không bị mất đi, kiểu hình các thể biến tương ứng với gen AOX1 có sẵn trong bộ gen<br /> nạp thu được là Mut+, có khả năng tăng trưởng của X33. Ở các chủng MutS thì không có vạch<br /> tốt trên môi trường methanol. Nếu gen AOX1 bị 2,2 kb này.<br /> loại bỏ, thể biến nạp sẽ có kiểu hình MutS sinh Kết quả PCR cho thấy ở tất các các dòng<br /> trưởng kém trên môi trường có methanol. đều xuất hiện 2 vạch trên bản điện di (hình 3),<br /> Kết quả so sánh sự phát triển của thể biến điều này chứng tỏ tất cả các thể biến nạp đều có<br /> nạp trên hai môi trường MD và MM, cho thấy kiểu hình Mut+, phù hợp với kết quả kiểm tra<br /> tất cả các thể biến nạp đều tăng trưởng tốt trên kiểu hình. Các dòng này tiếp tục được phân tích<br /> cả hai môi trường (hình 2). Do đó, tất cả các thể nhằm xác định số lượng pPICZα/pdgf được sát<br /> biến nạp đều có kiểu hình Mut+ (còn giữ lại gen nhập vào bộ gen bằng phương pháp PCR bán<br /> AOX1 trong bộ gen). định lượng.<br /> Để xác nhận kết quả kiểm tra kiểu hình Xác định số lượng bản sao của gen pdgf trong<br /> (hình 2), DNA bộ gen của các thể biến nạp bộ gen các thể biến nạp<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3. PCR kiểm tra kiểu gen các thể biến nạp. (a) Vị trí bám của mồi AOX1<br /> và các kết quả PCR dự kiến tương ứng với kiểu hình Mut+ và Muts;<br /> (b) Kết quả PCR kiểm tra kiểu gen các thể nấm men mang gen pdgf<br /> <br /> Đối với các thể biến nạp nấm men kiểu hình nhiều bản sao của gen pdgf thì tỷ lệ sản phẩm<br /> Mut+, khi thực hiện phản ứng với mồi AOX1 khuếch đại càng tăng so với gen AOX1 nội sinh.<br /> (hình 3) bên cạnh sản phẩm PCR là gen AOX1 có Bằng cách tính tỉ lệ sản phẩm khuếch đại, chúng<br /> kích thước 2,2 kb, phản ứng còn cho sản phẩm tôi xác định tương đối số lượng bản sao pdgf<br /> DNA dung hợp chứa gen mục tiêu pdgf dài trong thể nấm men biến nạp (hình 4). Kết quả<br /> khoảng 875 bp có nguồn gốc từ plasmid tái tổ cho thấy, trong 20 thể nấm men mang gen pdgf<br /> hợp và được sát nhập vào bộ gen của tế bào nấm thu được, có 2 chủng mang nhiều bản sao gen<br /> men trong quá trình biến nạp. Số lượng các bản pdgf hơn so với các chủng còn lại (1 chủng mang<br /> sao DNA chèn vào bộ gen là hoàn toàn ngẫu 16 bản sao và 1 chủng mang 4 bản sao gen pdgf<br /> nhiên. Nếu bộ gen thể nấm men biến nạp chứa 1 so với các chủng còn lại chỉ mang 1 bản sao của<br /> bản sao DNA dung hợp, lượng sản phẩm DNA gen pdgf). Chúng tôi tiến hành ghi nhận kết quả<br /> 875 bp chứa gen pdgf sẽ tương tương với lượng và khảo sát khả năng tăng trưởng cũng như khả<br /> sản phẩm khuếch đại từ gen AOX1 nội sinh (2,2 năng sinh tổng hợp PDGF của các chủng nấm<br /> kb). Bộ gen thể biến nạp nấm men chứa càng men này.<br /> <br /> <br /> <br /> 80<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 77-83<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 4. PCR bán định lượng xác định số lượng bản sao của các thể biến nạp<br /> a. Vị trí mồi AOX1 trên bộ gen Mut+; b. Kết quả điện di sản phẩm PCR bán định lượng; c. Số lượng bản sao<br /> tương đối của các thể biến nạp<br /> <br /> thể biến nạp. Kết quả khảo sát tăng trưởng cho<br /> thấy khả năng tăng trưởng của các thể biến nạp<br /> không khác biệt nhiều so với chủng X33 hoang<br /> dại, giá trị OD600 cao nhất đều đạt khoảng 10-15<br /> sau 48 giờ cảm ứng (hình 5). Điều này chứng tỏ<br /> các thể biến nạp đa bản sao thu nhận được<br /> không bị giảm sức sống do hiện tượng sát nhập<br /> gen gây ra.<br /> Hình 5. Đường cong tăng trưởng của chủng Kiểm tra khả năng biểu hiện PDGF của các<br /> X33 hoang dại và các thể biến nạp thể biến nạp<br /> Đánh giá khả năng tăng trưởng của các thể Để đánh giá sự ảnh hưởng của số lượng bản sao<br /> biến nạp nấm men đa bản sao pdgf gen sát nhập đến khả năng biểu hiện protein<br /> mục tiêu, chúng tôi tiến hành cảm ứng biểu hiện<br /> Việc chứa nhiều bản sao của vector trong bộ PDGF từ các thể biến nạp thu nhận được.<br /> gen có thể sẽ ảnh hưởng tới sức sống của các<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 6. Khả năng biểu hiện PDGF của các thể biến nạp<br /> a. SDS-PAGE điều kiện biến tính; b. PAGEđiều kiện không biến tính; c. %PDGF/tổng protein tiết.<br /> <br /> Kết quả kiểm tra protein bằng SDS-PAGE men P. pastoris không chèn gen pdgf không<br /> cho thấy, dịch nuôi cấy của các thể biến nạp sản xuất được protein này. Phân tích bằng phần<br /> (hình 6) xuất hiện 1 vạch protein có kích thước mềm Quantity One chúng tôi nhận thấy vạch<br /> trong khoảng 17 kDa trong điều kiện biến tính protein này đậm và nhiều hơn hẳn ở thể biến<br /> tương ứng với kích thước PDGF monomer và nạp đa bản sao (thể 1 và 4) và nhiều nhất ở thể<br /> 31 kDa trong điều kiện không biến tính tương biến nạp 1, chiếm 44,5% so với tổng lượng<br /> ứng với PDGF cấu hình dimer, trong khi nấm protein tiết của tế bào (hình 6c). Kết quả này<br /> <br /> <br /> 81<br />  Vuong Cat Khanh et al.<br /> <br /> cũng phù hợp với dự đoán từ kết quả kiểm tra Wang (2008) [9] đây có thể là trạng thái dimer<br /> số lượng bản sao pPICZαA/pdgf trước đó. Dòng của protein PDGF. Điều này cho thấy khả năng<br /> tái tổ hợp 1 với số lượng bản sao pdgf sát nhập thu nhận protein PDGF ở trạng thái dimer<br /> nhiều nhất (16 bản sao) có khả năng biểu hiện (là trạng thái có hoạt tính sinh học) từ các chủng<br /> protein mục tiêu mức độ cao nhất. Thú vị hơn nẩm men tái tổ hợp. Dòng tái tổ hợp 1 được<br /> nữa, khi chúng tôi tiến hành điện di protein thu tiếp tục sử dụng để phân tích khả năng biểu hiện<br /> được từ nấm men trên gel polyacrylamide protein PDGF theo thời gian. Dịch cảm ứng<br /> không bổ sung tác nhân biến tính (hình 6b), được thu nhận sau 24, 48 và 72 giờ, sau đó<br /> chúng tôi nhận thấy protein tiết thu được ở các điện di SDS-PAGE và lai western với kháng thể<br /> chủng nấm men có kích thước khoảng 31 kDa. đặc hiệu kháng PDGF (AB20NA, R&D)<br /> Theo các nghiên cứu của Raines (1982) [8] và (hình 7).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 7. Khả năng biểu hiện PDGF theo thời gian của thể biến nạp 1<br /> a. SDS-PAGE; b. lai Western với kháng thể kháng PDGF; c. % PDGF trên tổng protein tiết.<br /> <br /> Kết quả trên bản phim cho thấy, dịch nuôi tiết PDGF cao, chiếm 55,6% tổng lượng protein<br /> cấy của các thể biến nạp 1 sau 24 giờ, 48 giờ và tiết. Các kết quả này là tiền đề cho các nghiên<br /> 72 giờ cảm ứng đều xuất hiện một băng sáng cứu phát triển sản phẩm protein PDGF tái tổ<br /> duy nhất tương ứng với vị trí của băng protein hợp tiếp theo.<br /> kích thước khoảng 31 kDa trên hình PAGE.<br /> Điều này giúp khẳng định vạch 31 kDa quan sát TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> trên bản điện di chính là protein PDGF dạng<br /> dimer. 1. Berlanga-Acosta J., Gavilondo-Cowley J.,<br /> Barco-Herrera D. G., Martín Machado J.,<br /> Phân tích các vạch protein mục tiêu bằng<br /> Guillen-Nieto G., 2011. Epidermal growth<br /> phần mềm Quantity One, chúng tôi nhận thấy<br /> factor (EGF) and platelet-derived growth<br /> trong 72 giờ nuôi cấy, hiệu quả biểu hiện và tiết<br /> factor (PDGF) as tissue healing agents:<br /> PDGF của thể biến nạp 1 ngày càng tăng. Tại<br /> clarifying concerns about their possible role<br /> thời điểm 72 giờ, protein PDGF được tiết ra<br /> in malignant transformation and tumor<br /> chiếm tới 55,6% so với tổng protein tiết của tế<br /> progression. Journal of Carcinogenesis &<br /> bào.<br /> Mutagenesis, 1:115. doi:10.4172/2157-<br /> KẾT LUẬN 2518.1000115<br /> Với các kết quả thu được, chúng tôi kết luận 2. Darby R. A., Cartwright S. P., Dilworth M.<br /> đã thu nhận được 2 dòng nấm men tái tổ hợp đa V., Bill R. M., 2012. Which yeast species<br /> bản sao gen pdgf. Các dòng nấm men mang shall I choose? Saccharomyces cerevisiae<br /> nhiều gen chèn này có khả năng sinh trưởng versus Pichia pastoris (review). Springer,<br /> bình thường như chủng chủ nấm men X33 ban 866: 11-23.<br /> đầu và có khả năng biểu hiện protein PDGF. 3. Embil J. M., Papp K., Sibbald G.,<br /> Trong đó, dòng Pichia pastoris X33: pdgf mang Tousignant J., Smiell J. M., Wong B., Lau<br /> 16 bản sao gen pdgf có khả năng biểu hiện và C. Y., 2000. Recombinant human platelet-<br /> <br /> <br /> 82<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 77-83<br /> <br /> derived growth factor-BB (becaplermin) for terminally sialylated glycoproteins. Science,<br /> healing chronic lower extremity diabetic 313: 1441-1443.<br /> ulcers: an open-label clinical evaluation of 6. Heldin C. H., Westermark B., 1999.<br /> efficacy. Wound Repair and Regeneration: Mechanism of action and in vivo role of<br /> Official Publication of the Wound Healing platelet-derived growth factor. Physiol.<br /> Society [and] the European Tissue Repair Rev., 79(4): 1283-316.<br /> Society, 8(3): 162-8<br /> 7. Pichia expression kit, Invitrogen, 2010,<br /> 4. Grinna L. S., Tschopp J. F., 1989. Size Catalog no. K1710-01.<br /> distribution and general structural features<br /> of N-linked oligosaccharides from the 8. Raines E. W., Ross R., 1982. Platelet-<br /> methylotrophic yeast, Pichia pastoris. derived growth factor. J. Bio. Chem.,<br /> Yeast, 5: 107-115. 257(9): 5154-5160.<br /> 5. Hamilton S. R., Davidson R. C., 9. Wang Y., Xue, L., Li Y., Zhu Y., Yang B.,<br /> Sethuraman N., Nett J. H., Jiang Y., Rios S., Wang X., 2009. High-level secretory<br /> Bobrowicz P., Stadheim T. A., Li H., Choi production of recombinant human platelet-<br /> B-K., Hopkins D., Wischnewski H., Roser derived growth factor-BB by<br /> J., Mitchel T., Strawbridge R. R., Hoopes J., Saccharomyces cerevisiae under the non-<br /> Wildt S., Gerngross T. U., 2006. selective conditions. Appl. Biochem.<br /> Humanization of yeast to produce complex Microbiol., 45(2): 154-161.<br /> <br /> A STUDY ON CONSTRUCTING AND SCREENING OF MULTI-COPY<br /> pdgf RECOMBINANT Pichia pastoris CLONES PRODUCING HIGH YIELD OF<br /> PDGF-BB (Platelet derived growth factor BB)<br /> <br /> Vuong Cat Khanh, Ngo Thi Huyen Trang, Nguyen Pham Phuong Thanh,<br /> Dang Thi Phuong Thao, Tran Linh Thuoc<br /> Vietnam National University, Ho Chi Minh city, University of Science<br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> Platelet-derived growth factor-BB has been approved by US Food and Drug Administration-<br /> FDA for the treatment of neuropathic ulcers. Since the number of diabetic patients has increased<br /> rapidly, it is necessary to study the production of PDGF-BB with low cost for treatment. Among the<br /> expression systems used for human recombinant protein expression, Pichia pastoris is the<br /> remarkable one with many advantages. Multiple integrated copies of target gene may give advance<br /> in driving up expression level of target protein. In this study, we succeeded in constructing and<br /> screening two yeast clones, which carry multi-copy of pdgf target gene. The two multi-copy yeast<br /> clones were subjected indetermination of PDGF expression level and compared to single-copy yeast<br /> clones. Our results showed that multi-copy pdgf yeast clones have higher level expression of target<br /> protein. PDGF produced by the multi-copy pdgf yeast clones accounted for over 50% of total<br /> secretory protein, and was folded in dimer form, which is necessary for performing biofunction in<br /> wound healing.<br /> Keywords: Pichia pastoris, multi-copy clone, platelet-derived growth factor BB, yeast.<br /> <br /> <br /> Ngày nhận bài: 15-7-2013<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 83<br />