Nghiên cứu chẩn đoán nhanh Staphylococci và tính đề kháng Methicillin của chúng bằng kỹ thuật PCR đa mồi

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:4

Thêm vào BST

Báo xấu

29
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đê tài “Nghiên cứu chân đoán nhanh Staphylococci và tính đề kháng Methiciliin của chúng bằng kỹ thuật PCR đa mồi” nhằm mục tiêu xây dựng quy trình chẩn đoán nhanh staphylococci, xác định gen mã hóa FemA, yếu tố độc !ực Coagulase và tính đề kháng kháng sinh Methicillin của chúng bằng kỹ thuật PCR và so sánh với các phương pháp chẩn đoán Staphylococci phòng thí nghiệm truyền thống, phát hiện Coagulase và tính đề kháng kháng sinh Methicillin của chúng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu chẩn đoán nhanh Staphylococci và tính đề kháng Methicillin của chúng bằng kỹ thuật PCR đa mồi

NGHIÊN cứ u CHẨN ĐOÁN NHANH STAPHYLOCOCCI VÀ TÍNH ĐÈ KHÁNG METHICILLIN CỦA CHÚNG BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI Những người thực hiện: Trần Thanh Loan, Trương Đình An Sơn Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Kỹ thuật Y Dược Đà Nắng Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Trần Đình Bỉnh Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Y Dược Huế ĐẶT VÁN ĐỀ - Các loại môi trường nuôi cáy và thực hiện kháng stảphyỉococci ỉà một tác nhân gây nhiều nhiễm sinh đồ: Môi trường nuôi cấy: íhạch máu, thạch khuẩn thường gặp, chúng có thể gây nên nhiều bệnh thưởng, Chapman, BHI, Muelíer HỈnton Agar, môi lý khác nhau như nhiễm khuẩn tiêu hóa, nhiễm khuẩn ỉrường sinh vậí hóa học... da, nhiễm khuẳn đường tiết niệu, nhiêm khuẩn vết - Các loại vật iíệu khác: Thuốc nhuộm Gram, Huyết thương, vết bỏng, viêm nội tâm mạc, nhiễm khuẩn tương thỏ, H20 2 3%, Nước muối sinh lý vô khuẩn, các huyểt, viêm tủy xương.,.[2], [3], [4], [5]. Các nhiễm loại đĩa kháng sinh Oxacillin và Cefocitin. khuần do staphyiococci thương điều irị khó khăn do vi - Các loại hóa chất để thực hiện PCR: Agarose, khuển kháng íhuốc, rất nhiều cac staphylococci kháng duncj dịch điện di, Ethidium Bromide, thang DNA thuốc, đa kháng thuốc được phân lập từ bệnh nhân. chuan. Các vi khuẩn kháng Methiciliỉn íhường kháng với nhiều 2.2. Thiết bị, dụng cụ thuốc khác, nên nó được xem như là “siêu vi - Các loại thiết bị: Tu ấm 350C và 370C, máy iắc khuẩn”[2], [3], [6]. Việc chẩn đoản sớm sự nhiễm rung (Vortex), tủ lạnh, các loại máy ly tâm, tủ an íoàn khuẩn do staphylococci và tính kháng thuốc của sinh học, máy luân nhiệt, buồng điện di, bàn đèn đọc chúng có vai trò rất quan trọnp trong điều trị. Nhiều kết quả điện di... nghiên cứu ứng dụng các yểu to tạo nên độc lực mạnh - Các loại dụng cụ: Đèn cồn, kẹp đĩa kháng sinh, cua Staphylococci như các yếu tố xâm nhiêm, sinh độc thước đo đường kính vỏng ức chế, khuyên cấy, tăm íố, sinh các men phân huy protein, chất diệt bạch bông vô khuẩn, các loại vật iỉệu đề thực hiện PCR... cầu...Trong đó, FemA, Coagulase là những chỉ thị 3. Phương pháp nghiên cứu thường dùng để phát hiện các staphylococci có độc 3.1. Kỹ thuật nuôĩ cắy và định danh vi khuẩn lực ờ các phòng thí nghiệm. Staphylococci Tại Việt Nam, các nghiên cửu liên quan đến chần Các bệnh phẩm được cấy trên các môi trường đặc, đoán, phát hiện độc lực của các staphylococci và tính lỏng tùy theo yêu cầu kỹ thuật của từng loại mẫu kháng Methỉciliin bằng các phương pháp truyền thống, ngNệm. Khi có khuẩn lạc nghi ngờ (màu vàng trên tuy nhiên các nghiên cứu ve kỹ thuạt sinh học phân tư Chapman, tan máu B trên thạch máu...), làm phiến đe phát hiện gen mã hóa FemA, yếu tố độc iực của phếí nhuộm Gram kiểm tra hình thải. Tiến hành phân các Staphylococci như Coagulase hoặc gen mecA đề lập và định danh theo quy trình truỵền thống chẩn kháng Methicillin của các staphylococci chưa có nhiều đoán các Staphylococci là: cầu khuan Gram dương t2]. ~ đứng đám, catalase dương tính, xác định Đê tài: “Nghiên cứu chân đoán nhanh Staphylococci khi có các tiêu chuẩn sau: sắc íố vàng, Staphylococci và tính đề kháng Methiciliin của chúng lên men đường mannit, có coagulase dương tính. Các bằng kỹ thuật PCR đa mồi” nham mục tiêu xây dựng Síaphyiococci coagulase âm tính khi có hay không lên quy trỉnh chẩn đoán nhanh staphylococci, xác định men đường mannit, coaguỉase âm [2J,[33- gen mã hóa FemA, yếu íố độc !ực Coagulase và tinh 3.2. Kỹ thuật phát hiện vi khuẩn staphylococci đề kháng kháng sinh Methicillin của chúng bằng kỹ kháng Methicillin qua trung gian mecA bằng kỹ thuật PCR và so sánh với các phương pháp chẩn thuật sử dụng đĩa Cefoxitin (Theo CLSl 2011): Với đoán Staphylococci phòng thí nghiệm truyền thống, khoanh giấy cefoxitin 30ụg tren môi trường Mueiler phát hiện Coagulase và tính đe kháng kháng sinh Hinton Agar, trong Điều kiện nuôi cấy: 33-35 °c/16 - Methicilỉin của chúng. 18 giờ. Đọc kết quả: ắ 21 mm = mecA diPơng tính; ằ ĐÓI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 22 mm = mecA âm tính. [1] 1 . Đối tượng nghiên cứu 3.3. S ử dụng kỹ thuật PCR tìm gen mã hóa - 80 chủng VI khuẩn của các staphylococci gồm 45 FemA, Coagulase và gen mecA chủng S.aureus và 35 chủng staphyococci coaguỉase - Tách chiết DNA từ khuẩn lạc staphylococci: âm tính được phân iập bằng phương pháp ntioi cấy Tách chiết DNA bằng phương pháp nhiệt. DNA thường quy. của vi khuẩn sẽ được chuẩn b ĩ bằng cách lấy 1 - Cac chủng vi khuẩn làm chứng gồm 01 chủng s. khuẩn lạc cho vào ống eppendorf có chứa 250 MÍ aureus có Coagulase (+), mecA (+), FemA (+), 01 nước cẩt. Huyền dịch vi khuẩn này sẽ được chưng chủng vi khuẩn Streptococcus pyogenes (chứng âm cách thủy ở nhiệt độ 990C trong 10 phút. Sau đo Coagulase (-), mecA (-), FemA (-). quay ly íam 10.000 vổng/phút trorìg 10 phút. Bỏ phần 2. Vậỉ liệu nghiên cứu cặn lắng, lấy phần dịch noi đề sử dụng cho phản ứng 2.1. Hóâ Chat, sinh phẩm PCR [2], ự ], [8]. 514
- Cặp mồi (Primers): Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu Tt Primers sân phấm Chức nănq Tham khảo từ Coagulase 5'-ATAGAGATGCTGGTACAGG-3’ 5'-GCTTCCGAĨTGTTCGATGC-3 603-872 Coaguíase Hookey eí ai. (1998) [3] 2 mecA 5-CCTAGTAAATGCTCCGGAA-3’ 5’-CTAGTCCATTCGGTCCA-3 314 MRSA Nizami Duran (2012) [6] 3 FemA 5'-AAAAAAGCACATAACAAGCG-3‘ 5’-GATAAAGAAGAAACCAGCAG-3' 132 S.aureus Nizami Duran (2012) [6] * Thực hiện phẫn ứng PCR Một phản ứng PCR y=25|il gồm: 1.5mM MgC!2, Điện di để phát hiện sản phẩm PCR: sản phẩm tạo 200 ịjM mỗi loại dNTP, 0,625 unit Taq DNA thành được điện di ờ điện thế 80V, trên thạch agarose polymerase, 0,5ụM mỗi mồi, Taq buffer, nưởc cất 2 1 % nhuộm với chất màu huỳnh quang tự nhiên và đọc iần* kết quả ở buồng đọc huỳnh quang. Sự hiện diện cua Các bước tiến hành: Đối với mỗi mẫu, thực hiện sản phẩm sẽ được so sánh với thang mẫu ĐNA ladder như sau: 20|il mix PCR pha ở trên + 5ịi\ dịch DNA tách 100bp. chiết, cho vao eppendorf 0,2mi. Đặt chường trình cho 4. X ử lý số liệu: Xử lý các số liệu thu thập đưực máy iuân nhiệt hoạt động:________________________ bằng phương pháp thống kê y học. Độ nhạy và độ đạc Bước 1: 95°c 5 phút 1 chu kỳ hiệu của các thử nghiệm tính theo công thức của bảng 95°c 30 giây 2x2 ià: Độ nhạy = a/a+c; Độ đặc hiệu = d/b+d [9]. Bước 2: 51°c 30 giâv 40 chu kỳ 72°c 30 giây Bước 3: 72°c 6 phút 1 chu kỳ KẾT QUẢ NGHIỀN cứu 1. Tính chất sỉnh vật học của các staphylococci phân lập được Bảng 1. Tính chất sinh vật học của các staphylococci Tính chất Câu khuấn Gram (+) Catalase (+) Mannit (+) Coagulase (+) Tan máu {+) sẳc íố vànq Vi khuẩn ' n % n % n % n % n % n % S. aureus 45 100,0 45 100,0 45 100,0 45 100,0 39 86,7 45 100,0 Staphylococci coagulase âm tính 35 100,0 35 100,0 14 40,0 0 0 28 80,0 29 82,9 Các Staphylococci được định danh và xác định độc Bảng 3. Kiểu gen mã hóa chủng vi khuẩn, độc lực lực bằng phướng pháp truyền thống dựa vào tiêu bẩn và kháng Methiucillin cùa các chủng staphylococci nhuộm Gram, tính chất Caíalase dương tính, làm đông khảo sát huyết tương, lên men đường Mannit, tính chất tan máu Các chủng FemA mecA Coagulase Số chủng thử và khuẩn íạc có sắc tố màu vàng. vi khuẩn í+ì í-ì (+) {-) í+ì (-) 2. Đặc điểm kiểu hình và kĩểu gen về độc iực và S.aureus 45 45 0 •40 5 45 0 kháng Methiciliin của hai nhóm staphylococci sta coa (-) 35 3 32 15 10 3 32 khảo sát Tổng cộng 80 48 32 55 25 48 32 Bảng 2. Tính kháng thuốc Methiucillin của các 100,0% chủng có S.aureus có Coagulase dương tính với thử nghiệm Coagulase trên phiến kính đều có Tính kháng Methiciilin bằng test gen mã hóa Coagulase, các staphylococci Coaguiase Số Các chùng vi Cefoxitin qua trung gian mecA âm tỉnh (thử nghiệm Coagulase trôn phiến kính và khuẩn chủng thừ Khánq Nhạy trong ống nghiệm) có 8,6% (3 chủng) có gen mã hóa N % n % Coagulase. S.aureus 45 40 88,9 5 11,1 100,0% chủng có s.aureus có Coaguiase dương sta coa (-) 35 15 42,9 20 57,1 tính với thử nghiệm Coagulase trên phien kính đều có Tống cộng 80 55 68,8 25 31,2 gen mã hóa FemA, các staphylococci Coagulase âm tính (thử nghiệm Coagulase tren phiến kính và trong trung gian mecA qua test Cefoxitin kết quà cho thấy ống nghiệm) có 8,6% (3 chùng) có gen mã hóa FemA. các chùng S.aureus kháng Cefoxitin đếrì 88,9%, các 88,9% chủng có S.aureus có gen mã hóa mecA, chùng staphylococci coaguiase âm tính kháng các Staphylococci Coagulase âm tính có 42,9% (15 Cefoxitin chi CO 42,9%. Tỳ !ẹ đề kháng chung của các chủng) có gen mã hóa mecA. chủng Staphylococci là 68,8%. 515
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 1314 15 Lane 7: DNA ladder. Độ nhạy của kỹ thuật dùng dĩa Cefoxitin phát hiện Lane 14 chủng s.aureus kháng Methiciilin (chứng tính kháng Methicillín ờ s.aureus !à 100,0%, độ đặc dương có Coagulase (+), mecA (+), FemA (+). hiệu là 100,0%. Lane 15: Chung V! khuẩn Streptococcus pyogenes Bảng 6. So sánh các kỹ thuật xác định íính kháng (chứng âm có Coagulase (-), mecA (-), FemA (-), Methicillỉn của staphylococci coagulase âm tính Lanes 2, 3, 9: chủng vi khuẩn có Coagulase (+), mecA (+), FemA (+). PCR Kỹ thuật Tồng Lanes 1,2, 3, 5, 6, 8, 9 ,1 1 ,1 2 , 13: chùng vi khuẩn MecA (+) MecA (-) có FemA (+). Cefoxitin (+) 15 0 15 Lanes 4, 10: chủng vi khuẩn chứng Ps. Cefoxitin (-) 0 20 20 aeruginosa, E.coli CÓ FemA (-). Tống 15 20 35 Bảng 4. Đánh giá giá trị của các kỹ thuật xác định Coaguíase của các chủng S.aureus Độ nhạy của kỹ thuật dùng dĩa Cefoxitin phát hiện tính kháng Methiciilin ở staphylococci coagulase âm "■\i$ếí quả PCR Có gen mã Không có gen tính là 100,0%, độ đặc hiệu là 100 ,0%. Tổng BÀN LUẬN hóa mã hóa cộng Test Coaguìầse^, Coagulase Coagulase Nghiên cứu 80 chùng của các staphylococci S.aureus được định danh và xác định độc lực bằng phương Coagulase (+) 45 0 45 pháp truyền thống dựa vào tiêu bản nhuộm Gram, Staphylococci tính chất Catalase dương tính, làm đông huyết 3 32 35 Coágúlase (-) tương, lên men đường Manrtit, tính chất tan máu và Tổng cộng 48 32 80 khuẩn lạc có sắc tố màu vàng. Dựa vào các tính chất này, chúng ta đã có thể định danh khá chính xác Độ nhạy của kỹ thuật truyền thống xác định S.aureus và các staphylococci coagulase âm tính. Coagulase cùa staphylococci là 93,8%, kỹ thuật Thời gian để định danh hết 40-48 giờ. truyền thống cũng đã bỏ sót 3 chủng staphylococci Sử dụng kỹ thuật PCR đa mồi để xác định gen mã có gen mã hóa Coagulase. Độ đặc hiẹu cua kỹ thuật hóa FemA, òoaguiase và gen mecA đề kháng truyen thống xác định Coagulase của các chủng Meíhicĩllin của các chủng vi khuẩn cùa hai nhóm Staphylococci là 100 ,0%. Staphylococci, kết quả có 48 chủng vi khuẩn của các Bảng 5. So sánh các kỹ thuật xác định tính kháng Staphylococci có gen mã hóa Coaguiase, chiếm Methiciliin của S.aureus 60,0%, trong đó 100 ,0% chủng s.aureus có PCR Kỹ thuật Tồng Coagulase dương tính với thử nghiệm Coaguiase MecA (+) MecA {-) trên phiến kính đều có gen mã hóa FemA, Cefoxitin (+) 40 0 40 Coaguiase, tuy nhiên với các chủng staphylococci Cefoxitin (-) 0 5 5 Tống 40 5 45 Coagulase âm tính (cả với thử nghiệm òoagulase 516
trên phiến kính và trong ống nghiệm) lại có đến 8,6% tôi, kết quả hoàn toàn đáng tin cậy, kỹ thuật thực hiện (3 chủng) có gen ma hóa ồoagúlase đồng thời không quá phức tạp, các phòng thí nghiệm ở các chúng cũng có gen mã hóa FemA. Qua so sánh íhẩy bệnh viện tuyến tỉnh đều có thể tiến hành được nhằm độ nhạy của kỹ thuật truyền thống xác định chẩn đoán sởm, chính xác các nhiễm staphyiococci Coagulase cho thấy với cả 2 nhóm staphylococci là và tính kháng thuốc của chúng để có hướng điều trị 93,8%, trong đó đối với S.aureus thì độ nhạy đến kịp thời. 100,0% và độ đặc hiệu thì với nhóm staphylococci KẾT LUẬN coagulase âm tính là 100,0%, tuy nhiên, kỹ thuật này Qua nghiên cứu 80 chủng staphylococci bằng các không xác định được gen coagulase nên khi dùng phương pháp xét nghiệm vi sinh truyền thống và sử PCR thi có 3 chùng có gen Coaguỉase. dụng kỹ thuật PCR, chúng tôi đã xây dựng được quy Sử dụng kỹ thuật kháng sinh đồ khuếch tán trên trỉnh PCR 3 cặp mồi (tripiex PCR) để xác định gen thạch theo phương phập Kirby-Bauer để xác định FemA, gen mã hóa độc lực Coagulase và gen mecA. tính kháng Methicillin bằng đĩa kháng sinh Cefoxitin Quy trình có thể thực hiện được ở các bệnh viện 1qua ỉrung gian MecA, kết quả là các chủng s.aureus tuyến tỉnh để chần đoán sớm, chính xác cấc nhiễm có 88,9% kháng Ceíoxiỉin, còn các chủng khuẩn do staphyiococci và tính kháng thuốc của Staphylococci coaguíase âm tính kháng Cefoxitin !ai chúng để điều trị hiệu quả. đến 42,9%. TA! LIỆU THAM KHẢO Kết quà PCR xác định gen mecA, chúng tôi nhận 1. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSi) thấy 88,9% các chủng s.aureus có gen mecA và (2011), Performance Standards for Antimicrobial 42,9% các Staphylococci coaguiase âm tính có gen Susceptibility Testing; Twenty-First Informational mecA. Qua so sánh thấy độ nhạy cùa kỹ thuật dùng Supplement, M 100-S21.JISSBN 1-56238-742-1) dĩa Cefoxitin phát hiện tính kháng Methicillin ở 2. Trần Thu Hoa, Đỗ Thị Lan Hương, Nguyễn Thị S.aureus và staphylococci coagulase âm tính là Ngọc Loan, Hoàng Hiếu Ngọc, Phạm Hùng Vân (2009), 100,0%, độ đặc hiệu íà 100,0%. Tác giả "Nghiên cứu chế tạo bộ thử nghiệm multiplex PCR phái Venkatakrỉshna Rao (2011) đã đánh giá hiệu quả của hiện Staphylococci đề kháng Methỉciilin”, Y học TP Hồ phương pháp khoanh giấy khuếch tán với đĩa Chí Minh, Tập 13, Phụ bản số 2, tr. 176-180. Cefoxitin 30 jjg, kết quả ghi nhận độ nhạy và độ đặc 3. Hookey J.v, Richardson J.F and Cookson B.D (1998), “Molecular typing of staphylococci Based on hiệu của đĩa Cefoxitin phát hiện tính kháng Methicillin PCR Restriction Fragment Length Poiymorphis and DNA qua trung gian mecA cỏ cả độ nhạy và độ đặc hiệu íà Sequence Analysis of the Coagulase gene”. J. of Clin. 100% [7]. Microbiol, Voi 36 (4), pp 1083-1089. Chúng tôi đã xây dựng được quy trình PCR đa 4. Kalhor H, Shariati L, Validi M et al (2012), mồi để xác định gen mã hóa FemA, Coagulase và “Comparison of Agar screen and duplex PCR methods gen mecA của các staphylococci bằng kỹ thuật đa in determination of MRSA strains isolated from nasal mồi. Chúng tôi lựa chọn thiết kế 3 cặp mồi để xác carriage”. African J of Microbiology Research, Vol 6(16), định gen mã hóa FemA, Coaguiase và mecA có kích pp 3722-3726. thước sản phẩm khá khác biệt, chúng sẽ tách xa 5. Motiagh Mohammad Reza Safari, Maesumeh nhau trong quá trinh điện di, tạo ra những băng cách Anvari (2010), “Rapid detection of meỉhicillỉn-resistaní biệt nên dễ dàng nhận xét kết quả, tăng cao độ tin Staphylococci by multiplex PCR", African Journal of cậy khi đánh giá kết quả. Các tác giả khác cũng có Biotechnology, Vol. 9(45), pp 7629-7631. gợi ý tương tự [2],[3],[43,C5],[8]. Quy trình tương đối 6. Nizami D, Burcin o , Gu!ay G.D et al. (2012), đơn giản, dễ thực hiện ờ tất cả các phòng thí nghiệm Antibiotic resistance genes & susceptibility patterns in hay phòng xét nghiệm có phương tiện cho PCR. Kết Staphylococci, Indian J Med Res, 135, pp 389-396. quả nhanh chóng và chính xác, rát hữu ích cho lâm 7. Rao Venkatakrishna, Bhat Kishore, Kugaji sàng để kịp thời điều trị các nhiễm khuẩn do Manohar, Pai Vidya, Shantaram Manjula (2011), Staphylococci. Nếu so sánh với quy trình chẩn đoán “Detection of Methiciliin Resistance in staphylococci: Comparison of Disc diffusion and MIC with mecA gene Staphylococci và xác định tính kháng Methiciiiin theo detection by PCR”, international Journal of Pharmacy phương pháp truyền thống, chúng tôi nhận thấy: and Biological Sciences, Voi. 1, Issue 4, pp 518-521. - Phương pháp truyền thống: cho kết quả sớm 8. Thean Y Tan (2002), “A Comparison of PCR nhất là 40-48 giờ kể từ khi lấy mẫu nghiệm (nhuộm, detection of mecA with two standard methods of oxacillin nuôi cấy, xác định coagulase, kỹ thuật đĩa kháng disk susceptibility testing for coagulase- negative sinh). Staphylococci”, Journal of Medical Microbiology, Vol(51), - Kỹ thuật PCR: cho kết quả sớm nhất là 20“24 pp 83-85. giờ (nhuộm, nuôi cấy, PCR). 9. Phạm Hùng Vân (2006), Kỹ thuật xét nghiêm vi Với kỹ thuật 3 cặp mồi (triplex PCR) xác định gen sinh lâm sàng. Nhà xuất bản Y học. mã hóa FemA, Coaguiase và gen mecA cùa chúng 517