Nghiên cứu chuyển gen GmDRE vào giống đậu tương ĐT12

Phạm Thị Thanh Nhàn và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 180(04): 81 - 86<br /> <br /> NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN GmDREB2 VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT12<br /> Phạm Thị Thanh Nhàn*, Phạm Minh Hảo, Nguyễn Thị Ngọc Lan, Chu Hoàng Mậu<br /> Trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Nguyên<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây trồng có giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên, đây là cây mẫn<br /> cảm với điều kiện ngoại cảnh và chịu hạn kém. Đặc tính chịu hạn ở cây đậu tương là tính trạng đa<br /> gen, sản phẩm của các gen này liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện của đặc tính chịu hạn hoặc có<br /> chức năng điều hòa nhóm gen chịu hạn. Gen mã hóa nhân tố phiên mã DREB ở cây đậu tương có<br /> chức năng kích hoạt sự phiên mã của nhóm gen chịu hạn, lạnh và mặn. Bài báo này trình bày kết quả<br /> chuyển cấu trúc mang gen GmDREB2 vào giống đậu tương ĐT12 phục vụ tạo dòng cây đậu tương<br /> chuyển gen chịu hạn. Cấu trúc pBI121-GmDREB2 đã được biến nạp thành công vào giống đậu<br /> tương ĐT12 qua mô nách lá mầm thông qua chủng A. tumefaciens. Các mẫu biến nạp được tái sinh<br /> in vitro, chọn lọc bằng kháng sinh và tạo cây đậu tương chuyển gen. Kết quả có 203/300 mẫu biến<br /> nạp tạo đa chồi, 197 chồi chọn lọc trong môi trường kéo dài chồi và số chồi được cho ra rễ là 60.<br /> Số cây chuyển gen trồng trên giá thể là 20 cây và có 5 cây sống sót ở điều kiện nhà lưới, hiệu suất<br /> chuyển gen ở giai đoạn này là 1,67% (5/300). Trong số 5 dòng cây chuyển gen ở thế hệ T0, 4 cây<br /> chuyển gen dương tính với PCR, hiệu suất chuyển gen đạt 1,33% (4/300).<br /> Keywords: Hạn, Glycine max (L.) Merrill, GmDREB2, A. tumefaciens, hiệu suất chuyển gen<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ*<br /> Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là một<br /> cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị kinh tế cao.<br /> Ở Việt Nam, việc trồng đậu tương có ba mục<br /> đích là giải quyết vấn đề thiếu protein cho con<br /> người và gia súc, xuất khẩu và cải tạo đất.<br /> Tuy nhiên, đây là cây mẫn cảm với điều kiện<br /> ngoại cảnh và chịu hạn kém nên sản lượng<br /> còn thấp, chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu<br /> dùng. Đặc tính chịu hạn ở cây đậu tương là<br /> tính trạng đa gen, sản phẩm của các gen này<br /> liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện của đặc<br /> tính chịu hạn hoặc có chức năng điều hòa<br /> nhóm gen chịu hạn. Để chống lại điều kiện<br /> bất lợi của ngoại cảnh, đặc biệt là hạn hán, cơ<br /> thể thực vật đã sản xuất ra nhiều loại protein,<br /> trong đó có DREB (Dehydration- Responsive<br /> Element Binding). DREB có vai trò kích hoạt<br /> nhóm gen chịu hạn phiên mã. Họ protein này<br /> có chứa vùng bảo thủ duy nhất để gắn với<br /> trình<br /> tự<br /> DNA<br /> đặc<br /> hiệu<br /> là<br /> APETALA2/Ethylene Responsive Factor<br /> (AP2/ERF), cho phép chúng tương tác với<br /> một loạt các gen phía sau theo hình thức<br /> không phụ thuộc axit abscisic. Các miền<br /> AP2/ERF có khoảng 60 amino acid [50], [6],<br /> *<br /> <br /> Tel: 0989 516346; Email: ptnhansptn@gmail.com<br /> <br /> [7]. Phân họ gen DREB có 10 thành viên<br /> được xác định trong hệ gen cây đậu tương<br /> (GmDREBa,<br /> GmDREBb,<br /> GmDREBc,<br /> GmDREB1,<br /> GmDREB2,<br /> GmDREB3,<br /> GmDREB5, GmDREB6, GmDREB7) [10].<br /> Mỗi gen trong họ DREB có trình tự, độ dài<br /> khác nhau nhưng đều được biểu hiện nhiều<br /> khi cây gặp hạn. Nhóm DREB1 điều khiển<br /> tính chịu hạn, mặn và lạnh, trong khi nhóm<br /> DREB2 điều khiển tính chịu hạn.<br /> Phân nhóm DREB2 gồm 8 thành viên trong cây<br /> Arabidopsis [11] và 5 thành viên trong lúa gạo<br /> [8]. Chen và cộng sự (2007) [6] đã phân lập<br /> gen GmDREB2 từ đậu tương và dựa trên sự<br /> giống nhau về miền AP2, gen GmDREB2 xếp<br /> vào phân họ A-5 trong phân họ DREB. Sự biểu<br /> hiện của GmDREB2 ở cây thuốc lá chuyển gen<br /> thể hiện ở sự tích lũy hàm lượng proline cao.<br /> Sản phẩm biểu hiện của gen GmDREB2 được<br /> tìm thấy khi cây đậu tương gặp hạn, lạnh và<br /> mặn [6], [8]. Bài báo này trình bày kết quả<br /> chuyển cấu trúc mang gen GmDREB2 vào<br /> giống đậu tương ĐT12 phục vụ tạo dòng cây<br /> đậu tương chuyển gen chịu hạn.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Vật liệu và hóa chất<br /> Hạt giống đậu tương ĐT12 do Trung tâm<br /> Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ cung cấp.<br /> 81<br /> <br /> Phạm Thị Thanh Nhàn và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 180(04): 81 - 86<br /> <br /> Chủng A. tumefaciens chứa cấu trúc pBI121-GmDREB2 do Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo<br /> dục sinh học, Khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên cung cấp. Cấu<br /> trúc vector chuyển gen được trình bày ở hình 1.<br /> <br /> Hình 1. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121 mang gen GmDREB2 (pBI121-GmDREB2). (LB: Bờ trái<br /> của T-DNA; RB: Bờ phải của T-DNA; KanR: trình tự kháng kanamycin; 35S: Promoter 35S; GmDREB2:<br /> Trình tự gen GmDREB2; Cmyc: Trình tự nucleotide mã hóa kháng nguyên Cmyc; NOS (Nos ter): Nopaline<br /> synthase terminator (đoạn kết thúc)<br /> <br /> Các hóa chất được sản xuất bởi các hãng<br /> Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma,<br /> Amersham Pharmacia Biotech, như: Yeast<br /> extract, trypton, tris HCl, EDTA, glycerol,<br /> kanamycin, rifamicine, cefotaxime...<br /> Các thiết bị chính dùng trong nghiên cứu gồm<br /> có: Máy PCR System 9700 (Appied<br /> Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300<br /> (Bio-Rad, Mỹ), máy xung điện Gen Plulser...<br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> Phương pháp chuyển gen thông qua nách lá<br /> mầm nhờ A.tumefaciens được tiến hành dựa<br /> trên nghiên cứu của Olhoft và cộng sự (2006)<br /> [9] và Nguyễn Thị Thúy Hường (2011) [2].<br /> Các thí nghiệm được thực hiện trong phòng<br /> nuôi cấy với điều kiện chiếu sáng theo quang<br /> chu kì 16 giờ sáng và 8 giờ tối, nhiệt độ phòng<br /> 25oC ± 2, cường độ chiếu sáng 2000 lux.<br /> Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ các<br /> mẫu lá non được thực hiện theo phương pháp<br /> của Saghai Maroof và cộng sự (1984) [12].<br /> Phương pháp PCR xác định sự có mặt của<br /> gen chuyển GmDREB2 bằng cặp mồi<br /> GmDREB2-BamHI/Cmyc-SacI (sản phẩm dự<br /> kiến có kích thước 543 bp), và vector pBI121GmDREB2 bằng cặp mồi 35S-F/35S-R (sản<br /> phẩm dự kiến có kích thước 314 bp) trong cây<br /> đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0. Trình tự<br /> nucleotide của cặp mồi GmDREB2BamHI/Cmyc-SacI và 35S-F/35S-R như sau:<br /> GmDREB2-BamHI:<br /> 5’<br /> –<br /> CGGATCCGATGGAAGAAGCGGGTTTA<br /> GG – 3’<br /> GmDREB2-Cmyc-SacI:<br /> 5’<br /> –<br /> CGAGCTCGTCAATTCAGATCCTCTTCTG<br /> – 3’<br /> 82<br /> <br /> 35S-F:<br /> 5’<br /> –<br /> CACGACACACTTGTCTAC – 3’<br /> 35S-R:<br /> 5’<br /> –<br /> TCACATCAATCCACTTGCT – 3’<br /> Phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình<br /> nhiệt: 94oC trong 3 phút; (94oC trong 1 phút;<br /> 56oC trong 1 phút; 72oC trong 1 phút) lặp lại 30<br /> chu kỳ; 72oC trong 10 phút; bảo quản ở 4oC.<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> Lây nhiễm và tái sinh cây đậu tương<br /> chuyển gen<br /> Hạt đậu tương nảy mầm trên môi trường GM,<br /> sau khoảng 5 ngày, kích thước mầm đạt<br /> khoảng 5 cm và lá mầm xanh (Hình 2A). Các<br /> mảnh lá mầm được thu, gây tổn thương ở<br /> nách lá mầm để sử dụng làm mẫu biến nạp<br /> (Hình 2B). Lá mầm đã gây tổn thương được<br /> ngâm trong dịch huyền phù chứa<br /> A.tumefaciens mang cấu trúc chứa gen<br /> GmDREB2 có OD600 đạt 0,8 trong thời gian<br /> 30 phút (Hình 2C). Sau thời gian nhiễm<br /> khuẩn, mẫu được chuyển sang môi trường<br /> đồng nuôi cấy CCM ở 25oC trong tối 5 ngày<br /> (Hình 2D).<br /> Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp<br /> được rửa khuẩn ngoại vi bằng cefotaxim 500<br /> mg/l, sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử<br /> trùng. Cắt lấy các mảnh lá mầm và cấy mẫu<br /> lên môi trường tạo cụm chồi có bổ sung<br /> cefotaxim 500 mg/l. Sau 2 tuần, mẫu được<br /> chuyển sang môi trường SIM có bổ sung<br /> cefotaxim 500 mg/l và kháng sinh thích hợp.<br /> Hình 3 trình bày kết quả cảm ứng tạo đa chồi<br /> trên môi trường SIM bổ sung BAP 2 mg/l và<br /> kanamycine (Hình 3A và 3B), sau đó chuyển<br /> sang môi trường kéo dài chồi SEM (Hình 3C<br /> và 3D).<br /> <br /> Phạm Thị Thanh Nhàn và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> Nách lá mầm<br /> <br /> A<br /> <br /> B<br /> <br /> D<br /> <br /> C<br /> <br /> Hình 2. Hình ảnh gây tổn thương nách lá mầm và<br /> biến nạp. A: Hạt đậu tương ĐT12 nảy mầm trên<br /> môi trường GM; B: Gây tổn thương nách lá mầm;<br /> C: Mảnh lá mầm được nhiễm khuẩn; D: Mẫu biến<br /> nạp chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM<br /> <br /> A<br /> <br /> C<br /> <br /> B<br /> <br /> D<br /> <br /> Hình 3. Hình ảnh đa chồi và kéo dài chồi. A:<br /> Cảm ứng tạo đa chồi trên SIM bổ sung BAP 2<br /> mg/l và kanamycine trong 1 tuần; B: Cảm ứng<br /> tạo đa chồi trên SIM bổ sung BAP 2 mg/l và<br /> kanamycine trong 2 tuần; C: Kéo dài chồi SEM<br /> (bổ sung GA3 0,5 mg/l + IAA 0,1 mg/l +<br /> kanamycine 50 mg/l) trong 1 tuần; D: Kéo dài<br /> chồi SEM (bổ sung GA3 0,5 mg/l + IAA 0,1 mg/l<br /> + kanamycine 50 mg/l) trong 2 tuần<br /> <br /> Hình 4. Giai đoạn ra rễ và trồng cây đậu tương<br /> chuyển gen ĐT12 trên giá thể<br /> <br /> Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 3 - 5<br /> cm sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ<br /> (RM) có bổ sung cefotaxim 250 mg/l để tạo<br /> cây hoàn chỉnh (Hình 4).<br /> <br /> 180(04): 81 - 86<br /> <br /> Thí nghiệm biến nạp cấu trúc chứa gen<br /> GmDREB2 qua nách lá mầm nhờ<br /> A.tumefaciens được thực hiện lặp lại 3 lần.<br /> Kết quả thí nghiệm chuyển gen và đối chứng<br /> được trình bày ở bảng 1. Trong 300 mẫu được<br /> biến nạp cấu trúc chứa gen GmDREB2, 203<br /> mẫu tạo được đa chồi, trong đó có 393 chồi<br /> sống sót, 197 chồi được kéo dài. Số chồi ra rễ<br /> là 60, số cây được trồng trên giá thể là 20 cây<br /> và có 5 cây sống sót. Đối với lô đối chứng<br /> ĐC0, với 30 mẫu biến nạp và kết quả không<br /> có chồi nào được tạo thành, vì thế cũng không<br /> có chồi được kéo dài, ra rễ và ra giá thể. Đối<br /> với lô đối chứng ĐC1, 20 mẫu được tạo đa<br /> chồi, 35 chồi sống sót, 20 chồi được kéo dài<br /> và 15 chồi được chuyển vào môi trường ra rễ.<br /> Số cây được đưa ra giá thể là 15 cây, trong đó<br /> có 10 cây sống sót. Như vậy ở giai đoạn tái sinh<br /> và chọn lọc in vitro, chúng tôi thu được 5 cây<br /> đậu tương được chuyển gen ở thế hệ T0 (ký<br /> hiệu là ĐT12-01, ĐT12-02, ĐT12-03, ĐT1204, ĐT12-05). Hiệu suất chuyển gen ở giai đoạn<br /> chọn lọc bằng kháng sinh là 1,67% (5/300).<br /> Cũng theo phương pháp chuyển gen này, Lò<br /> Thị Mai Thu (2014) [4] chuyển cấu trúc CPi<br /> (SMV- BYMV) vào hai giống đậu tương<br /> ĐT12 và DT2008 có hiệu suất lần lượt là<br /> 4,32% và 3,76%; Lò Thanh Sơn (2015) [3]<br /> chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào<br /> giống đậu tương DT84 với hiệu suất 2,37%;<br /> Nguyễn Thu Hiền (2011) [1] chuyển gen HA1<br /> vào giống đậu tương ĐT12 với hiệu suất<br /> 2,37%; Nguyễn Thúy Hường (2011) [2] chuyển<br /> gen vào giống đậu tương DT84 với hiệu suất là<br /> 2,22%. Như vậy, hiệu suất chuyển gen ở giai<br /> đoạn này của chúng tôi thấp hơn hiệu suất<br /> chuyển gen của các tác giả trước.<br /> Lá non của cây đậu tương không chuyển gen<br /> và 5 cây đậu tương chuyển gen sống sót trên<br /> giá thể ở thế hệ T0 được thu nhận để tách<br /> chiết DNA tổng số, kiểm tra sự có mặt của<br /> cấu trúc mang gen chuyển pBI121GmDREB2.<br /> <br /> 83<br /> <br /> Phạm Thị Thanh Nhàn và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 180(04): 81 - 86<br /> <br /> Bảng 1. Kết quả biến nạp gen GmDREB2 vào giống đậu tương ĐT12<br /> Lô đối chứng và Số mẫu Số mẫu tạo Số chồi<br /> Số chồi Số chồi Số cây trồng<br /> Số cây<br /> thí nghiệm<br /> biến nạp<br /> đa chồi<br /> sống sót kéo dài<br /> ra rễ<br /> trên giá thể<br /> sống sót<br /> ĐC0<br /> 30<br /> 0<br /> 0<br /> 0<br /> 0<br /> 0<br /> 0<br /> ĐC1<br /> 30<br /> 20<br /> 35<br /> 20<br /> 15<br /> 15<br /> 10<br /> 1<br /> 100<br /> 68<br /> 136<br /> 67<br /> 20<br /> 7<br /> 1<br /> 2<br /> 100<br /> 55<br /> 109<br /> 45<br /> 15<br /> 5<br /> 2<br /> 3<br /> 100<br /> 80<br /> 148<br /> 85<br /> 25<br /> 8<br /> 2<br /> Tổng số (1+2+3)<br /> 300<br /> 203<br /> 393<br /> 197<br /> 60<br /> 20<br /> 5<br /> Ghi chú: ĐC0*: Lá mầm đậu tương không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh;<br /> ĐC1*: Lá mầm đậu tương không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh.<br /> <br /> Phân tích sự có mặt của gen chuyển GmDREB2 trong cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0<br /> PCR là phương pháp nhanh, chính xác để đánh giá cây chuyển gen. Do vậy, chúng tôi tiến hành<br /> phản ứng PCR với cặp mồi 35S-F/35S-R để kiểm tra sự có mặt của promoter 35S trong cấu trúc<br /> vector pBI121- GmDREB2 ở cây đậu tương chuyển gen. Sản phẩm của phản ứng có kích thước<br /> theo dự tính 314 bp (Hình 5A).<br /> <br /> (A)<br /> <br /> (B)<br /> <br /> Hình 5. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của đoạn promoter 35S (A) và gen chuyển<br /> GmDREB2 (B) trong các cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0. M: Thang DNA 1kb; 1, 2, 3, 4, 5: Sản phẩm<br /> PCR các cây chuyển gen ĐT12-01, ĐT12-02, ĐT12-03, ĐT12-04, ĐT12-05; (+): Sản phẩm PCR từ vector<br /> pBI121-GmDREB2; (-): Sản phẩm PCR của cây không chuyển gen.<br /> <br /> Hình 5A cho thấy, băng DNA có kích thước<br /> khoảng 0,3 kb xuất hiện ở đối chứng dương<br /> (+) và bốn cây chuyển gen, trong khi đối<br /> chứng âm (-) không có. Như vậy, cấu trúc<br /> pBI121-GmDREB2 đã có mặt ở 4 cây chuyển<br /> gen ĐT12-01, ĐT12-03, ĐT12-04, ĐT12-05<br /> ở thế hệ T0.<br /> Kết quả kiểm tra sản phẩm của phản ứng PCR<br /> nhân gen GmDREB2 ở hình 5B cho thấy đối<br /> chứng dương và các cây chuyển gen ĐT1201, ĐT12-03, ĐT12-04, ĐT12-05 tồn tại băng<br /> DNA có kích thước khoảng 0,55 kb. Theo<br /> tính toán lý thuyết, đoạn gen GmDREB2 được<br /> nhân bản dài 498 bp, đoạn Cmyc và KDEL<br /> dài 45 bp và dự tính sản phẩm của PCR với<br /> cặp mồi GmDREB2-BamHI/GmDREB2Cmyc-SacI sẽ nhân bản được đoạn DNA có<br /> kích thước là 543 bp. Như vậy, kết quả PCR<br /> thu được đoạn DNA có kích thước phù hợp<br /> với tính toán lý thuyết, là cơ sở để nhận xét<br /> rằng gen chuyển GmDREB2 đã được chuyển<br /> 84<br /> <br /> thành công vào giống đậu tương ĐT12. Cả<br /> hai thí nghiệm sử dụng kỹ thuật PCR nhân<br /> bản đoạn promoter 35S và gen GmDREB2<br /> đều cho kết quả dương tính ở 4 cây đậu tương<br /> chuyển gen ĐT12-01, ĐT12-03, ĐT12-04,<br /> ĐT12-05 ở thế hệ T0. Như vậy, hiệu suất<br /> chuyển gen ở giai đoạn kiểm tra gen chuyển<br /> bằng PCR là 4/300 (hay 1,33%). Trong kết<br /> quả nghiên cứu của Lò Thị Mai Thu (2014)<br /> [4], hiệu suất chuyển gen đạt 1,35% (với<br /> giống ĐT12), 2,24% (với giống DT2008);<br /> của Lò Thanh Sơn (2015) [3], hiệu suất<br /> chuyển gen đạt 0,27%; của Nguyễn Thu<br /> Hiền (2011) [1], hiệu suất là 1,23%; của<br /> Nguyễn Thị Thúy Hường (2011) [2], hiệu<br /> suất chuyển gen đạt 0,23%.<br /> Như vậy, hiệu suất chuyển gen ở đậu tương<br /> thấp, cần tìm kiếm các biện pháp tăng cường<br /> hiệu quả chuyển gen ở đối tượng này. Nguyên<br /> nhân có thể do hóa chất, thời vụ, kĩ thuật thao<br /> tác… Đối với cây đậu tương, thời điểm ra cây<br /> ngoài nhà lưới tốt nhất là vụ xuân hè.<br /> <br /> Phạm Thị Thanh Nhàn và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> Cấu trúc pBI121-GmDREB2 đã được biến<br /> nạp thành công vào giống đậu tương ĐT12 qua<br /> nách lá mầm thông qua chủng A. tumefaciens.<br /> Các mẫu biến nạp được tái sinh in vitro, chọn<br /> lọc bằng kháng sinh và tạo cây đậu tương<br /> chuyển gen. Kết quả có 203/300 mẫu biến<br /> nạp tạo đa chồi, 393 chồi sống sót, có 197<br /> chồi chọn lọc trong môi trường kéo dài chồi<br /> và số chồi được cho ra rễ là 60. Số cây<br /> chuyển gen trồng trên giá thể là 20 cây và có<br /> 5 cây sống sót ở điều kiện nhà lưới, hiệu suất<br /> chuyển gen ở giai đoạn này là 1,67% (5/300).<br /> Phân tích sự có mặt của gen chuyển<br /> GmDREB2 trong 5 dòng cây ở thế hệ T0 thu<br /> được 4 cây chuyển gen dương tính với PCR,<br /> hiệu suất chuyển gen đạt 1,33% (4/300).<br /> LỜI CẢM ƠN: Nghiên cứu này được hỗ trợ<br /> và trong khuôn khổ của Đề tài cấp Bộ Giáo<br /> dục & Đào tạo, mã số B2017-TNA-38 do<br /> GS.TS Chu Hoàng Mậu làm chủ nhiệm.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Nguyễn Thu Hiền (2011), Nghiên cứu chuyển<br /> gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào<br /> cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật,<br /> Luận án tiến sĩ Sinh học, Đại học Thái Nguyên.<br /> 2. Nguyễn Thị Thuý Hường (2011), Phân lập,<br /> tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính<br /> chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu<br /> tương Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Đại<br /> học Thái Nguyên.<br /> 3. Lò Thanh Sơn (2015), Nghiên cứu đặc điểm và<br /> chuyển gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển<br /> bộ rễ của cây đậu tương, Luận án tiến sĩ Sinh học,<br /> Đại học Thái Nguyên.<br /> 4. Lò Thị Mai Thu (2014), Phân lập đoạn gen CP<br /> từ Soybean mosaic virus và phát triển vector<br /> chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây<br /> <br /> 180(04): 81 - 86<br /> <br /> đậu tương chuyển gen kháng bệnh, Luận án tiến sĩ<br /> Sinh học, Đại học Thái Nguyên.<br /> 5. Chen F., Chen S. Y. and Liu Q. (2002),<br /> “Isolation of a rice cDNA encoding a DREB-like<br /> protein induced by stresses”, GenBank, Accession<br /> AY064403.<br /> 6. Chen M., Wang Q. Y., Xu Z. S., Li L. C., Ye X.<br /> G., Xia L. Q., Ma Y. Z. (2007), “GmDREB2, a<br /> soybean DRE – binding transcription factor,<br /> conferred droungt anh high – salt tolerance in<br /> transgenic plants”, Biochem. Biophys. Res.<br /> Commun., 353(2), pp. 299 – 305.<br /> 7. Huang B., Jin L. and Liu J. (2007), “Molecular<br /> cloning and functional characterization of a<br /> DREB1/CBF-like gene (GhDREB1L) from<br /> cotton”, Sci. China Life Sci., 50 (1), pp. 7-14.<br /> 8. Matsukura S., Mizoi J., Yoshida T., Todaka D.,<br /> Ito Y., Maruyama K., Shinozaki K., YamaguchiShinozaki K. (2010), “Comprehensive analysis of<br /> rice DREB2-type genes that encode transcription<br /> factors involved in the expression of abiotic stressresponsive genes”, Mol. Genet. Genomics, 283,<br /> pp. 185–196.<br /> 9. Olhoft P. M., Somers D. A. (2001), “L-Cysteine<br /> increases<br /> Agrobacteriummediated<br /> T-DNA<br /> delivery into soybean cotyledonarynode cells”,<br /> Plant Cell Rep., 20, pp. 706-711.<br /> 10. Ratcliffe O. J., Riechmann J. L. (2002),<br /> “Arabidopsis transcription factors and the regulation<br /> of flowering time: a genomic perspective”, Curr.<br /> Issues Mol. Biol., 4, pp. 77–91.<br /> 11. Riechmann J. L., Heard J., Martin G., Reuber<br /> L., Jiang C. Z., Keddie J., Adam L., Pineda O.,<br /> Ratcliffe O. J., Samaha R. R., Crelman R., Pilgrim<br /> M., Broun P., Zhang J. Z., Ghandehari D.,<br /> Sherman B. K., Yu G. L. (2000), “Arabidopsis<br /> transcription factors: Genome-wide comparative<br /> analysis among eukaryotes”, Science, 290, pp.<br /> 2105–2110.<br /> 12. Saghai M. M. A., Soliman K. M., Jorgensen R.<br /> A., Allard R. W. (1984), “Ribosomal DNA spacer<br /> - length polymorphisms in barley: Mendelian<br /> inheritance, chromosomal location and population<br /> dymnamics”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp.<br /> 8014-8018.<br /> <br /> 85<br /> <br />