Nghiên cứu chuyển gen kháng sâu Cryiab vào cây cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211<br /> <br /> NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU cryIAb VÀO CÂY CÀ CHUA<br /> (Lycopersicon esculentum Mill.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN<br /> Agrobacterium tumefaciens<br /> <br /> Lê Tấn Đức1*, Phạm Đức Trí1, Nguyễn Hữu Hổ1, Hà Trần Minh Dũng1, Dương Thị Ngọc Thi2<br /> (1)<br /> Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)tanduc2007@gmail.com<br /> (2)<br /> Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp công nghệ cao tp Hồ Chí Minh<br /> <br /> TÓM TẮT: Mục đích của nghiên cứu này là chuyển gen kháng sâu cryIAb vào cây cà chua (Lycopersicon<br /> esculentum Mill.) bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium. Kháng sinh Kanamycin được dùng<br /> như một chất chọn lọc. Chủng Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang plasmid CAMBIA2301cryIAb<br /> chứa gen kháng kanamycin (nptII), gen GusA và gen kháng sâu cryIAb. Chúng tôi nghiên cứu một vài yếu<br /> tố ảnh hưởng đến khả năng chuyển gen cà chua như nồng độ của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và<br /> nồng độ acetosyringone trong quá trình xâm nhiễm. Để phục vụ cho việc chuyển gen, lá mầm 10 ngày tuổi<br /> được dùng làm nguyên liệu. Sau 2 ngày xử lí chuyển gen lá mầm được rửa và cấy trên môi trường tái sinh<br /> MS có chứa chất sinh trưởng IAA (0,5 mg/l), BA (2 mg/l), chất chọn lọc kanamycin (100 mg/l) và 500<br /> mg/l kháng sinh cefotaxime để diệt vi khuẩn. Sau vài tuần chọn lọc trong môi trường trên, các chồi kháng<br /> chất chọn lọc kanamycin sẽ được chuyển sang môi trường MS để phát triển và tạo rễ. Sự biểu hiện của<br /> gen GusA được kiểm tra bởi chất chỉ thị X-Glu. Sự hiện diện của gen nptII và gen cryIAb trong cây cà<br /> chua giả định chuyển gen đã được khẳng định bằng kỹ thuật PCR. Sự biểu hiện của độc tố tạo bởi gen<br /> kháng sâu cryIAb trong lá cây cà chua giả định chuyển gen đã được kiểm tra bởi Kit Quickstix strip của<br /> công ty Envirologix (Mỹ).<br /> Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, Lycopersicon esculentum, chuyển gen, plasmid, lá mầm, gen cryIA,<br /> PCR.<br /> <br /> MỞ ĐẦU al. (2009) [12]. Trong những nghiên cứu này, lá<br /> Cà chua là một loại rau ăn quả được trồng mầm và lá thật được dùng làm nguyên liệu cho<br /> rất phổ biến ở nhiều nước. Đây là loại rau quả việc chuyển gen cà chua thông qua vi khuẩn<br /> được ưa thích vì phẩm chất ngon và dễ chế biến. Agrobacterium tumefaciens. Theo hướng nghiên<br /> Tính đa dụng và nhu cầu tiêu thụ cà chua tươi cứu này, chúng tôi tiến hành chuyển gen kháng<br /> ngày càng lớn đã thúc đẩy sự phát triển cây cà sâu cryIAb vào cây cà chua (Lycopersicon<br /> chua như một trong những loại cây trồng chính. esculentum Mill.) với hy vọng sự biểu hiện của<br /> Ngoài ra, trồng cà chua đã mang lại hiệu quả gen chuyển cryIA sẽ có tác dụng góp phần làm<br /> kinh tế khá cao. giảm tác hại của sâu hại cà chua.<br /> Ở Việt Nam, việc phát triển trồng cà chua PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> còn có ý nghĩa quan trọng về mặt luân canh, Vật liệu<br /> tăng vụ và tăng năng suất trên đơn vị diện tích,<br /> do đó cà chua là loại rau quả được khuyến khích Sử dụng giống cà chua vô hạn TN386,<br /> phát triển. Tuy nhiên, cà chua thường bị hại bởi TN148 của Công ty Trang Nông và giống Hồng<br /> sâu ăn lá, đục quả (Heliothis armigera và Châu của Công ty Sygenta.<br /> Spodoptera litura). Một số loại thuốc hóa học Phương pháp<br /> bảo vệ thực vật được áp dụng vào các giai đoạn Môi trường nuôi cấy mô và điều kiện nuôi cấy<br /> khác nhau của cà chua để bảo vệ cây trồng<br /> chống lại dịch hại. Tuy nhiên, dư lượng chất Môi trường gieo hạt là 1/2MS [10] không<br /> hóa học của các loại thuốc này có thể tác hại chất điều hòa sinh trưởng.<br /> đến người tiêu dùng. Môi trường tiền tái sinh là MS với vitamin<br /> Có nhiều báo cáo về nghiên cứu chuyển B5 [7] có các chất điều hòa sinh trưởng 0,1 mg/l<br /> gen trên cây cà chua như các tác giả Cortina et NAA, 1 mg/l BA.<br /> al. (2004) [2], Park et al. (2003) [11], Sarker et Môi trường tái sinh chồi từ lá mầm là MS với<br /> <br /> 205<br />  Le Tan Duc, Pham Duc Tri, Nguyen Huu Ho, Ha Tran Minh Dung, Duong Thi Ngoc Thi<br /> <br /> <br /> vitamin B5 có bổ sung các chất điều hòa sinh BA trong thời gian 2 ngày; 2. Gây nhiễm các<br /> trưởng 1 mg/l IAA, 2 mg/l BA. mẫu lá mầm với vi khuẩn trong thời gian 20<br /> Môi trường chọn lọc như môi trường tái phút; vớt mẫu ra, thấm bớt dịch vi khuẩn thừa<br /> sinh có 100 mg/L kanamycin và 500 mg/l bằng giấy lọc; 3. Nuôi chung mẫu lá mầm với vi<br /> cefotaxime. khuẩn trong 2 ngày; sử dụng môi trường như<br /> trên nhưng có 100 µM acetosyringone; 4. Rửa<br /> Môi trường ra rễ là MS. thật sạch vi khuẩn bằng nước cất và dung dịch<br /> Điều kiện nuôi cấy trong 9 giờ chiếu kháng sinh 500 mg/l cefotaxime (kết hợp lắc<br /> sáng/ngày, nhiệt độ 25-28oC. nhẹ); 5. Vớt mẫu ra, thấm ráo nước và cấy các<br /> Dòng vi khuẩn, môi trường và điều kiện mẫu lá mầm trên môi trường tái sinh có chọn<br /> nuôi cấy lọc. Thời gian nuôi 15 ngày/chu kỳ chọn lọc; 6.<br /> Khi xuất hiện chồi tái sinh (cao khoảng 1-2 cm)<br /> Sử dụng dòng vi khuẩn Agrobacterium cấy truyền sang môi trường MS không chất sinh<br /> tumefaciens EHA 105 mang plasmid trưởng đến khi vươn chồi tạo cây, thời gian nuôi<br /> pCAMBIA2301 chứa gen cryIAb, gen gusA (có khoảng 1 tháng.<br /> intron, promoter CaMV35S) và gen nptII (kháng<br /> kanamycin) với promoter CaMV35S. Môi trường Kiểm tra cây chuyển gen<br /> giữ giống vi khuẩn là môi trường LB có 50 mg/l Thử GUS [6]: Dùng để kiểm tra sự biểu<br /> kanamycin. Để nhân giống cho nghiên cứu hiện của gen chỉ thị gusA mã hóa enzyme β-<br /> chuyển gen, vi khuẩn được nuôi lắc qua đêm glucoronidase trong mô tế bào thực vật chuyển<br /> trong môi trường AB [3] cũng có nồng độ gen. Lá mầm sau khi chuyển gen 4 ngày và chồi<br /> kanamycin như trên và 50 mg/l rifamycin. Nhiệt con tái sinh được ngâm trong dung dịch X-Gluc<br /> độ nuôi cấy ở 28oC. (5-bromo-4-cloro-3-indolyl-β-D-glucuronide) ở<br /> Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch nuôi vi khuẩn nhiệt độ 37oC trong 20 giờ thì loại bỏ dung dịch<br /> Agrobacterium tumefaciens với các nồng độ và thay bằng cồn 70% cho đến khi các điểm<br /> khác nhau đến khả năng chuyển gen xanh xuất hiện rõ ràng.<br /> Sử dụng dịch vi khuẩn Agrobacterium Phân tích bằng phương pháp sinh học phân<br /> tumefaciens với nồng độ OD ở bước sóng 600 tử PCR: Cây con sau khi tái sinh chọn lọc được<br /> nm là 0,5; 1 và 1,5 trong quá trình chuyển gen tách chiết DNA nhiễm sắc thể từ lá theo phương<br /> với giống cà chua TN386. Sau 4 ngày xử lí pháp của Dellaporta et al. (1983) [4].<br /> chuyển gen, các mẫu lá mầm được nhuộm với Sự hiện diện của gen nptII và gen cryIAb<br /> dung dịch X-Gluc để kiểm tra khả năng chuyển được kiểm tra dùng các cặp mồi đặc hiệu. Gen<br /> gen thông qua biểu hiện của gen gusA. nptII: Mồi 1 (F): 5’-GCACA ACAGA CAATC -<br /> Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 3’, Mồi 2 (R): 5’-CCGCC AAGCT CTTCA - 3’;<br /> acetosyringone trong dịch nuôi vi khuẩn chương trình nhiệt: 94C: 5 phút; 35 chu kỳ<br /> Agrobacterium tumefaciens đến khả năng (94C: 1 phút, 58C: 1 phút, 72C: 1 phút); 72C:<br /> chuyển gen 5 phút; khuếch đại đoạn DNA 600 bp. Gen<br /> Để nâng cao tần số chuyển gen cryIA(b) : Mồi 1 (F): 5’ - TTC CT T GGA CGA<br /> acetosyringone được sử dụng với các nồng độ 50, AAT CCC ACC - 3’, Mồi 2 (R): 5’ - GCC AGA<br /> 100 và 150 µM trong quá trình chuyển gen với ATT GAA CAC ATG AGC GC - 3’; chương<br /> giống cà chua TN386. Sau 4 ngày xử lí chuyển trình nhiệt: 94C: 4 phút; 35 chu kỳ (94C: 30<br /> gen các mẫu lá mầm được nhuộm với dung dịch giây, 54C: 60 giây, 72C: 1 phút 30 giây); 72C:<br /> X-Gluc để kiểm tra khả năng chuyển gen. 10 phút; khuếch đại đoạn DNA 559 bp.<br /> Quy trình chuyển gen Kiểm tra biểu hiện của gen cryIAb: Kit của<br /> Các mẫu lá mầm 10 ngày tuổi từ cây in vitro Công ty Envirologix Quickstix (Hoa Kỳ) được<br /> được sử dụng làm vật liệu chuyển gen. sử dụng để phát hiện protein độc tố tạo ra bởi<br /> gen cry1Ab trong lá của cây cà chua chuyển<br /> Các bước chuyển gen: 1. Nuôi cấy lá mầm<br /> gen. Lá tươi của cây cà chua được nghiền trong<br /> trên môi trường MS có 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l<br /> <br /> 206<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211<br /> <br /> tube lá mầm có phát triển bằng cách phình to ra sau 2<br /> 1,5 ml đến khi lá bị vỡ nát cho thêm dung dịch ngày, các lá mầm này được sử dụng làm nguyên<br /> tách chiết protein được cung cấp bởi công ty. liệu chuyển gen.<br /> Tiếp tục nghiền. Que thử được nhúng vào trong Nghiên cứu ảnh hưởng OD600nm của dịch nuôi<br /> tube khoảng 5 phút sẽ cho kết quả nếu có mặt vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đến khả<br /> của độc tố tạo bởi gen cryIAb sẽ xuất hiện hai năng chuyển gen<br /> vạch (dương tính) trên que thử nếu chỉ có môt<br /> vạch là âm tính. Sau khi lá mầm giống cà chua TN 386<br /> được tạo vết thương và xâm nhiễm bởi vi khuẩn<br /> Các thí nghiệm được bố trí theo khối hoàn toàn Agrobacterium tumefaciens mang<br /> ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Phần mềm MSTAT-C plasmidCAMBIA2301cryIAb và plasmid này<br /> được dùng để phân tích kết quả thí nghiệm. có mang gen gusA (gen chỉ thị) nên chúng tôi<br /> sử dụng biểu hiện của gen này để đánh giá kết<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> quả chuyển gen của thí nghiệm. Kết quả sau khi<br /> Giống cà chua TN 386 được dùng trong thí chuyển gen 4 ngày chúng tôi nhuộm các lá mần<br /> nghiệm các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng để xem biểu hiện của gen GusA cho thấy mức<br /> chuyển gen. Theo tác giả Abida Yasmeen et al. độ chuyển gen thông qua biểu hiện của gen<br /> (2009) [1] nếu trước khi chuyển gen đặt lá mầm gusA gia tăng hay giảm tùy thuộc nồng độ của<br /> vào môi trường MS có 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l dịch nuôi vi khuẩn phù hợp với miêu tả trước<br /> BA trong thời gian 2 ngày sẽ giúp tăng khả đây của tác giả Fillatti et al (1987) [5]. Biểu<br /> năng tái sinh và tần số chuyển gen nên trước khi hiện tạm thời cao nhất của gen gusA (hình 1)<br /> cho xử lí chuyển gen chúng tôi đặt lá mầm 10 khi OD600nm là 1,0 với tần suất là 40,55%, khi<br /> ngày tuổi được dùng làm nguyên liệu và nuôi OD600nm là 0,5 thì biểu hiện của gen gusA cũng<br /> cấy trong môi trường này. Lá mầm đã được cắt giảm và khi OD600nm tăng là 1,5 thì biểu hiện<br /> ở phần đầu lá và phần cuống lá để tạo vết của gen gusA cũng không tăng theo chỉ số OD<br /> thương giúp vi khuẩn Agrobacterium (bảng 1).<br /> tumefaciens dễ dàng xâm nhiễm. Khoảng 80%<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Biểu hiện của gen gusA trên lá mầm<br /> Bảng 1. Ảnh hưởng của dịch nuôi vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đến khả năng biểu hiện tạm<br /> thời của gen gusA<br /> Số lượng lá mầm xử lí Số lượng lá mầm biểu % lá mầm biểu hiện<br /> OD600nm<br /> chuyển gen hiện gen gusA gen gusA<br /> 0,5 30 6 b*<br /> 19,17  6,29<br /> 1,0 30 12 a<br /> 40,56  10,05<br /> 1,5 30 8 ab<br /> 26,67  2,89<br /> <br /> <br /> 207<br />  Le Tan Duc, Pham Duc Tri, Nguyen Huu Ho, Ha Tran Minh Dung, Duong Thi Ngoc Thi<br /> <br /> * Các số trung bình trong các cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có nghĩa với p = 0,05.<br /> Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cho vào trong giai đoạn xử lý ngâm dung dịch<br /> acetosyringone trong dịch nuôi vi khuẩn vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với lá<br /> Agrobacterium tumefaciens đến khả năng mầm của giống cà chua TN386 ở các nồng độ<br /> chuyển gen 50, 100 và 150 µM. Kết quả cho thấy khi nồng<br /> Sự có mặt của acetosyringone làm tăng khả độ acetosyringone 100 µM sẽ cho tần số chuyển<br /> năng chuyển gen trên nhiều loại cây trồng trong gen cao nhất và khi tăng lên 150 µM sẽ làm<br /> đó có cà chua. Vì vậy, acetosyringone đã được giảm tần số chuyển gen (bảng 2).<br /> <br /> Bảng 2. Ảnh hưởng của nồng độ acetosyringone đến khả năng biểu hiện tạm thời của gen gusA<br /> Số lượng lá mầm Số lượng lá mầm biểu % lá mầm biểu<br /> Nồng độ Acetosyringone<br /> xử lí chuyển gen hiện gen gusA hiện gen gusA<br /> b*<br /> 50 25 6 24,07  1,61<br /> a<br /> 100 25 9 36,11  2,41<br /> b<br /> 150 25 4 15,74  5,61<br /> * Các số trung bình trong các cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có nghĩa với p = 0,01.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Biểu hiện của gen gusA Hình 3. Tái sinh chồi cà chua<br /> trên chồi cà chua trên môi trường chọn lọc<br /> <br /> Nghiên cứu chuyển gen cho thấy, khoảng 60% mẫu chồi giả định<br /> chuyển gen được kiểm tra gen gusA có những<br /> Lá mầm của các giống cà chua TN 386, đốm xanh chàm ở những mức độ đậm nhạt khác<br /> 148 và Hồng Châu sau khi xử lí chuyển gen nhau cho thấy, việc biểu hiện của gen gusA<br /> được đặt vào môi trường tái sinh chồi có bổ (hình 2) không đồng nhất trong các chồi chuyển<br /> sung chất chọn lọc 100 mg/l kanamycin, kết quả gen, trong khi đó, các mẫu không chuyển gen<br /> sau hai tuần một số lá mầm có mô sẹo phát triển thì không có vệt xanh nào. Đồng thời, tần số<br /> và tái sinh chồi sau 4-6 tuần trong khi các lá chuyển gen dựa trên khả năng tái sinh trong môi<br /> mầm đối chứng (không xử lí chuyển gen) hoàn trường chọn lọc 100 mg/l kanamycin cho thấy<br /> toàn không phát triển mô sẹo và chồi sau 4 tuần rất phụ thuộc vào giống, các giống TN 386 và<br /> trong môi trường chọn lọc. Các chồi đã tái sinh TN148 khả năng tái sinh chồi tạo dòng kháng<br /> trên môi trường chọn lọc được chọn ngẫu nhiên kanamycin (hình 3) là 5,22% và 4,11% theo thứ<br /> để kiểm tra biểu hiện của gen gusA đồng thời tự, riêng với Hồng Châu, tỷ lệ tái sinh khá thấp<br /> quan sát trên chồi không chuyển gen. Kết quả 2,45% (bảng 3). Các chồi kháng kanamycin và<br /> <br /> <br /> 208<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211<br /> <br /> có biểu hiện gen gusA được cấy chuyền vào môi trường MS để chồi phát triển thành cây và ra rễ.<br /> Bảng 3. Tần số chuyển gen của lá mầm thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ở một số<br /> giống cà chua<br /> Giống Số lượng lá mầm Số lượng chồi tái sinh Phần trăm chồi tái sinh trên<br /> cà chua xử lí chuyển gen trên môi trường chọn lọc môi trường chọn lọc (%)<br /> a*<br /> TN 386 350 18 5,22  0,69<br /> ab<br /> TN148 350 14 4,11  0,84<br /> b<br /> Hồng Châu 250 6 2,45  0,43<br /> * Các số trung bình trong các cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có nghĩa với p = 0,01.<br /> <br /> Phân tích PCR các gen nptII và cryIAb Kết quả PCR các gen cryIAb và nptII với các<br /> Các dòng chồi tái sinh và phát triển tốt trên cặp mồi đặc hiệu cho thấy có sự hiện diện của<br /> môi trường tái sinh có chất chọn lọc kanamycin các băng DNA được khuếch đại tương ứng là<br /> được tách chiết nhiễm sắc thể để kiểm tra sự 559 bp (hình 4) và 600 bp (hình 5) trong các<br /> hiện diện của gen chuyển bằng phản ứng PCR. dòng cà chua giả định chuyển gen.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 4. PCR gen cryIAb dương tính với băng Hình 5. PCR gen nptII dương tính với băng DNA<br /> DNA 559 bp. M. Thang DNA chuẩn 1 kb; PC. 600 bp. M. Thang DNA chuẩn 1 kb; PC. Đối<br /> ĐC dương (plasmid); 3. NC âm (cây không chứng dương (plasmid); 3. NC âm (cây không<br /> chuyển gen); 1, 2, 3, 4, 5. Cây chuyển gen. chuyển gen); 1, 2, 3, 4, 5: Cây chuyển gen.<br /> <br /> Kiểm tra biểu hiện của gen cryIAb gen trong khi mẫu đối chứng chỉ<br /> Chọn một ít dòng cây cà chua giả định<br /> chuyển gen phát triển tốt trên môi trường chọn<br /> lọc 100 mg/l kanamycin để kiểm tra biểu hiện<br /> của gen cryIAb thông qua bộ Kit của Công ty<br /> Envirologix Quickstix (Mỹ) bằng cách phát<br /> hiện protein độc tố tạo ra bởi gen cry1Ab trong<br /> lá của cây cà chua chuyển gen. Lá của cây giả<br /> định chuyển gen và đối chứng được nghiền<br /> trong dung dịch tách chiết protein, que thử được<br /> nhúng vào trong tube khoảng 5 phút cho kết quả<br /> sự có mặt của độc tố Bt (Bacillus thuringiensis)<br /> đã được khẳng định bằng sự xuất hiện hai vạch<br /> (dương tính) trên que thử cây cà chua chuyển<br /> <br /> <br /> 209<br />  Le Tan Duc, Pham Duc Tri, Nguyen Huu Ho, Ha Tran Minh Dung, Duong Thi Ngoc Thi<br /> <br /> <br /> có một vạch (âm tính) (hình 6). Hình 6. Kiểm tra biểu hiện của gen cryIAb<br /> bằng que thử của Envirologix Quickstix<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> KẾT LUẬN 4. Dellaporta S., Wood J., Hicks J. B., 1983. A<br /> Qua nghiên cứu chuyển nạp gen nhờ vi plant DNA minipreparation: version II. Plant<br /> khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên các Molecular Biology Reporter, 1(4): 19-21.<br /> giống cà chua, chúng tôi nhận thấy, nồng độ 5. Fillatti, JoAnne J., Kiser John, Rose Ronald,<br /> thích hợp cho vi khuẩn Agrobacterium Comai Luca, 1987. Efficient transfer of a<br /> tumefaciens trong quá trình xử lí chuyển gen là glyphosate tolerance gene into tomato using<br /> OD600nm bằng 1 và nồng độ acetosyringone cho a binary Agrobacterium tumefaciens vector.<br /> hiệu quả chuyển gen cao là 100 µM. Đã nhận Nature Biotechnology, 5(7): 726-730.<br /> được nhiều dòng cây cà chua mang gen nptII và<br /> 6. Jefferson R. A., Kavanagh T. A., Bevan B.<br /> cryIAb và sự có mặt của gen chuyển trong cây<br /> W., 1987. GUS fusion: -glucuronidase as a<br /> đã được kiểm tra dương tính bằng phân tích<br /> sensitive and versatile gene fusion marker in<br /> PCR. Đồng thời biểu hiện của độc tố Bt đã được<br /> higher plants. EMBO, 6: 3901-3907.<br /> kiểm tra bằng que thử của công ty Envirologix<br /> Quickstix (Hoa Kỳ). 7. Gamborg O., Miller R., Ojima K., 1968.<br /> Nutrient requirement suspensions cultures<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO of soybean root cells. Experimental Cell<br /> Research, 50(1): 151-158.<br /> 1. Abida Yasmeen, 2009. An improved<br /> protocol for the regeneration and 8. Murashige T., Skoog F., 1962. A revised<br /> transformation of tomato (cv Rio Grand), medium for rapid growth and bioassay with<br /> Acta. Physiol. Plant, 31: 1271-1277. tobacco tissue culture. Physiol. Plant, 15:<br /> 473-497.<br /> 2. Cortina C., Culiánez-Macià F. A., 2004.<br /> Tomato transformation and transgenic plant 9. Park S. H., Morris J. L., Park J. E., Hirschi<br /> production. Plant Cell, Tissue and Organ K. D., Smith R. H., 2003. Efficient and<br /> Culture, 76: 269-275. genotype-independent Agrobacterium-<br /> mediated tomato transformation. J. Plant<br /> 3. Chilton M. D., Currier T. C., Farrand S. K.,<br /> Physiol., 160: 1253-1257.<br /> Bendich A. J., Gordon M. P., Nester E. W.,<br /> 1974. Agrobacterium tumefaciens DNA and 10. Sarker R. H., Islam K., Hoque M. I., 2009.<br /> P58 bacteriophage DNA not detected in In vitro regeneration and Agrobacterium-<br /> crown gall tumours. Proc. Natl. Acad. Sci. mediated genetic transformation of tomato.<br /> USA, 71: 3672-3676. Plant Tissue Cult., 19(1): 101-111.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 210<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 205-211<br /> <br /> A STUDY ON GENETIC TRANSFORMATION<br /> OF TOMATO (Lycopersicon esculentum Mill.) WITH AN INSECT<br /> RESISTANCE GENE CRY1AB BY Agrobacterium tumefaciens<br /> <br /> Le Tan Duc1, Pham Duc Tri1, Nguyen Huu Ho1 , Ha Tran Minh Dung1, Duong Thi Ngoc Thi2<br /> (1)<br /> Institute of Tropical Biology, VAST<br /> (2)<br /> Research and Development Center for Hi-tech Agriculture<br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> Damage caused by insects to crops is a major problem for the agricultural economy in the tropics. The<br /> main objective of this study was to transfer the gene cryIAb into tomato by using an Agrobacterium-mediated<br /> transformation method. Kanamycin was used as the transformant selectable agent. Agrobacterium tumefaciens<br /> strain EHA105, containing plasmidCAMBIA2301cryIAb that consists of kanamycin resistance gene, gusA<br /> gene and cry1Ab gene encoding for delta endotoxin of Bacillus thuringiensis, was used. Conditions such as<br /> bacterial concentration and concentration of acetosyringone were studied. For genetic transformation, the<br /> cotylendons were infected and co-cultivated with the Agrobacterium tumefaciens. After the 2 day co-<br /> cultivation, the cotylendons were washed by the cefotaxime solution and transferred to the MS medium<br /> containing IAA (0.5 mg/l), BA (2 mg/l) and kanamycin (100 mg/l) for selection. After a few weeks, putative<br /> transformed explants, able to grow on the kanamycin-containing medium, were transferred to MS medium for<br /> root development. Expression of GusA was detected by the X-glu substrate in the GUS assay. The presence of<br /> nptII and cry1Ab in the putative transformed tomatoes was confirmed by polymerase chain reaction analysis.<br /> Transgenic tomatoes were able to produce Bt endotoxin in the leaf tissue, revealed by the Envirologix<br /> Quickstix strip test.<br /> Keywords: Agrobacterium tumefaciens, Bacillus thuringiensis, Lycopersicon essculentum, genetic<br /> transformation.<br /> <br /> <br /> Ngày nhận bài: 21-6-2012<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 211<br />