Nghiên cứu đa hình di truyền loài lan Hài đốm (Paphiopedilum concolor Pfitzer) bản địa của Việt Nam

Chia sẻ: Leon Leon | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

92
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bản địa Paphiopedilum concolor Pfitzer loài ở Việt Nam là rất khác nhau. mười sáu accessions Paphiopedilum concolor thu thập từ nhiều vùng sinh thái có sự khác biệt về hình thái đặc. Ở mức độ phân tử DNA, hai mươi bốn mồi được sử dụng trong phân tích RAPD để phân biệt, bằng cách so sánh sự khác biệt trong mô hình dải DNA. Tổng cộng có 1738 ban nhạc DNA khuếch đại, và 91 trong số đó (62,3%) là đa hình. Mức trung bình của ban nhạc đã được khuếch đại 17 mồi là 102,2 ban nhạc mỗi mồi. Hệ số di truyền...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu đa hình di truyền loài lan Hài đốm (Paphiopedilum concolor Pfitzer) bản địa của Việt Nam

NGHIÊN C U ĐA HÌNH DI TRUY N LOÀI LAN HÀI Đ M (Paphiopedilum concolor Pfitzer) B N Đ A C A VI T NAM Khu t H u Trung1, Ki u Th Dung1, Nguy n Thuý i p1, Bùi Th Thu Hương2, Tr n Duy Dương1, ng Tr ng Lương1 Summary Studying on genetic diversity of native Paphiopedilum concolor species in Vietnam The native Paphiopedilum concolor Pfitzer species in Vietnam is very various. Sixteen accessions Paphiopedilum concolor collected from many ecological areas have difference morphological characteristics. In molecular DNA level, twenty-four primers were used in the RAPD analysis to distinguish, by comparing differences in DNA banding patterns. A total of 1738 DNA bands were amplified, and 91 of which (62,3%) were polymorphic. The average of the bands that was amplified by 17 primers was 102,2 bands per primer. Genetic similarity coefficients of sixteen accessions Paphiopedilum concolor in each pair were ranging from 0,56- 0,94. According to these results, sixteen accessions of Paphiopedilum concolor were divided into six groups based on their genetic similarity coefficients. The phylogenetic tree derived from the RAPD results were complemented with morphological characteristics useful for studying the genetic relationships between accessions of Paphiopedilum concolor Pfitzer. Keywords: Paphiopedium concolor, native, genetic diversity, RAPD marker. I. TV N góp ph n t o l p cơ s d li u Lan Hài (Paphiopedilum) là m t v các c i m hình thái và m c nhóm r t khác bi t. Chúng có th d dàng phân t ADN, ph c v công tác phân nh n ra b i c u trúc hoa khác thư ng v i lo i dư i loài, nh n d ng, g i tên chính cánh môi hình túi sâu trông gi ng m t xác, kh ng nh ch quy n qu c gia v chi c hài n m v trí th p nh t c a hoa, loài Hài m (Paphiopedilum t o nên m t v b ngoài r t c s c. Chính concolor), chúng tôi th c hi n tài: vì v y “Hài” tr thành tên chung c a “ ghiên c u a hình di truy n loài lan nhóm lan này. M i loài lan Hài khác nhau Hài m (Paphiopedilum concolor u có nh ng c i m c trưng riêng v Pfitzer) b n a c a Vi t am”. kích thư c, màu s c c a lá, hoa và t ng cánh hoa [2]. Vi t Nam, lan Hài ư c II. V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP ch ng minh là r t phong phú và có a NGHIÊN C U d ng cao hơn b t c nơi nào khác trên th 1. V t li u gi i. Nhi u loài c a Vi t Nam không ch V t li u ư c s d ng trong các thí r t hi m mà còn là loài c h u h p c a nghi m bao g m 16 m u lan Hài thu c loài Vi t Nam và trên th gi i [1], [6]. 1 Vi n Di truy n Nông nghi p; 2Trư ng i h c Nông nghi p Hà N i.
Hài m (Paphiopedilum concorlor - Tách chi t AD t ng s : Lá bánh t Pfitzer) ư c thu th p t nhi u vùng sinh c a các m u ư c thu th p, x lí và tách thái Vi t Nam (L ng Sơn, Hòa Bình, chi t ADN t ng s theo phương pháp c a Thanh Hóa, k L k...) hi n ang ư c Obara-Okeyo & Kako (1998) có c i ti n; tr ng lưu gi t i vư n lan Tam o và ADN t ng s ư c xác nh n ng b ng vư n lan Văn Giang c a Vi n Di truy n phương pháp o quang ph và ki m tra trên Nông nghi p (b ng 2). gel agarose 0,8% [3], [4]. 24 m i khác nhau s d ng trong các - Ch y PCR: Các ph n ng PCR ư c ph n ng RAPD-PCR có dài t 9-10 th c hi n theo chương trình: 940C (5 phút), nucleotit thu c nhóm OPA, OPC, UBC, 40-45 chu kì [940C (1 phút); 330C - 360C BIO và nhóm S c a hãng Bioneer (b ng 1). (30s), 720C (2 phút)] và k t thúc 720C (5 - Phương pháp mô t hình thái (theo phút); s n phNm PCR ư c i n di trên gel phương pháp mô t chi ti t các c i m agarose 1-1,2%. hình thái c a Pellegrino và c ng s , 2005) - Phân tích s li u: K t qu ư c [5]: S d ng m t thư ng quan sát, t ó mô th ng kê d a vào s xu t hi n hay t hình thái, màu s c c a lá, hoa; dùng không xu t hi n c a các băng ADN . S thư c o chi u dài, chi u r ng c a lá, chi u li u ư c x lí, phân tích b ng chương dài và ư ng kính hoa; th ng kê, so sánh s trình EXCEL version 5.0 và ph n m m lư ng hoa trên m t ng ng hoa. N TSYSpc 2.1. B ng 1. Trình t nucleotit c a các primer ư c s d ng trong các ph n ng RAPD-PCR STT Primer Trình t nucleotit STT Primer Trình t nucleotit 1 OPC2 GTGAGGCGTC 13 BIO27 TGACGCGCTC 2 OPC4 CCGCATCTAC 14 UBC701 CCCACAACCC 3 OPC5 GATGACCGCC 15 UBC709 CCTCCTCCCT 4 OPC10 TGTCTGGGTG 16 UBC728 GTGGGTGGTG 5 OPC11 AAAGTCGCGG 17 S201 GGGCCACTCA 6 OPC14 TGCGTGCTTG 18 S202 GGAGAGACTC 7 OPC15 GACGGATCAG 19 S208 AACGCCGACA 8 OPA2 TGCCGAGCTG 20 S239 GGGTGTGCAG 9 OPA18 AGGTGACCGT 21 S256 CTGCGCTGGA 10 OPA5 AGGGGTCTTG 22 S279 CAAAGCGCTC 11 BIO12 CAATCGCCGT 23 S285 GGCTGCAATG 12 BIO24 CTGGCGGCTG 24 S300 AGCCGTGGAA
III. K T QU VÀ TH O LU N K t qu o m, th ng kê m t s c i m hình thái c a các m u Hài m nghiên 1. M t s c i m hình thái c a 16 m u c u ch ra b ng 2. Hài m B ng 2. c i m hình thái c a các m u lan Hài m Chi u Đư ng Chi u Chi u Chi u Chi u Đư ng Chi u Chi u Đư ng dài kính dài r ng dài r ng S Chi u dài kính kính Ký r ng cánh cánh cánh cánh cánh cánh lá dài lá ng ng ng ng hi u lá môi hoa /cây (cm) môi bên bên trên trên m u (cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm) GL2 5 14,7 3,6 10 0,3 4 2,5 4 3,5 4 4,5 8 HTD5 4 13,8 3,5 8 0,4 2,5 1,6 4 3,5 4 4,5 7 HTD7 5 10,1 3,9 9 0,4 3 1,8 3 3 3,5 3,5 9 HTD13 5 14 2,2 7 0,3 2,2 1,6 2,9 2 2,4 2,3 6 TD33 6 10,6 3,5 10 0,4 3 2,2 5 2,5 3,5 2,7 5,3 TD34 6 10,4 3,6 9 0,4 4 2 5 3,5 3,5 3 7 TD36 6 14,1 3,5 8 0,4 3 1,2 6 2,5 3 4 10 TD37 5 6,4 2,4 6 0,4 4 1,6 4 3 4,5 3,5 6 TD39 6 7,8 3,9 4,7 0,3 3,5 1,8 4 3,5 4,5 4 5,3 TD40 5 10,3 4,1 7,5 0,4 2,5 1,7 5,5 3,4 5,0 4 9 TD41 3 10 3,6 6 0,5 2,2 1,6 3 2,7 2,6 2,7 4,6 TD42 5 7,2 3,4 6 0,4 4 1,5 4 3 4,4 3,5 6 TD45 3 11 3,8 8 0,5 2,2 1,7 3 2,8 2,7 2,6 4,7 TD46 6 7,1 3,2 4 0,4 2,2 1,5 5 3,8 4,5 4 6 TD47 5 8,3 3,4 7 0,3 1,8 1,5 4,5 3,5 4,5 4 6,2 TD49 7 15,2 3,7 9 0,4 2,2 1,4 3,7 2,9 2,8 2,4 4,1 Qua b ng 2 cho th y: Các m u Hài TD34, TD37, TD42). ư ng kính cánh m có s lá dao ng t 3 lá/cây (TD45, môi dao ng t 1,2 cm (TD36) n 2,5 cm TD41) n 7 lá/cây (TD49). Chi u dài lá (GL2). Chi u dài cánh bên dao ng khá r t khác nhau, dao ng t 6,4 cm (TD37) l n t 2,9 cm (HTD13) n 6 cm (TD36). n 15,2 cm (TD49). Chi u r ng lá dao Chi u r ng cánh bên dao ng t 2 cm ng t 2,2 cm (HTD13) n 4,1 cm (HTD23) n 3,8 cm (TD46). Chi u dài (TD40). c i m lá c a các m u thu c cánh trên dao ng t 2,4 cm (HTD13) n loài này thư ng ng n, xanh m ho c xanh 5 cm (TD40). Chi u r ng cánh trên dao nh t, m t trên lá có nhi u m tr ng như ng t 2,3 cm (HTD13) n 4,5 cm (GL2, da báo, m t dư i lá tía, m t s m u mép HTD5). ư ng kính hoa dao ng r t l n lá màu tím và có răng cưa. Các m u Hài t 4,1 cm (TD49) n 10 cm (TD36). Cánh m có chi u dài ng ng hoa dao ng t hoa thon, tròn u. Cánh môi hình b u 4 cm (TD46) n 10 cm (GL2, TD33). d c ho c hình tr ng h p, cánh môi r t dày ư ng kính ng ng hoa dao ng t 0,3 cm và có mép u n cong. Hoa Hài m màu (GL2, HTD13, TD39, TD47) n 0,5 cm vàng nh t, vàng n vàng m, có các m (TD41, TD45). Chi u dài cánh môi dao tía ho c nâu trên kh p b m t cánh, hoa ng t 1,8 cm (TD47) n 4 cm (GL2, có mùi thơm ng t c trưng.
Hình 1. nh các m u lan Hài m 2. K t qu ph n ng RAPD-PCR agarose 0,8% cho th y các m u ADN có ADN t ng s c a 16 m u lan Hài tách n ng tương i cao, không b t gãy chi t theo phương pháp Okeyo & Kako hay l n t p (hình 2). (1998) có ch t lư ng khá t t. K t qu ki m tra b ng phương pháp i n di trên gel Hình 2. nh i n di AD t ng s c a 16 m u Hài m K t qu phân tích RAPD-PCR c a 16 Các s li u thu ư c b ng 3 cho th y: m u lan Hài v i t ng s 24 m i thu c các V i 272 ph n ng PCR nhân lên ư c t ng nhóm OPA, OPC, BIO, UBC và nhóm S. s 1738 băng thu c 146 lo i băng có kích c Trong ó, có 17 m i cho a hình rõ r t là: khác nhau. Trong ó có 91 băng cho a hình OPC4, OPC5, OPC10, OPC11, OPC15, (chi m 62,3%) và 55 băng ơn hình (chi m S201, S202, S208, S239, S256, S279, S285, 37,7%). Kích thư c băng nh nh t kho ng S300, UBC709, UBC728, OPA18 và 250 bp và kích thư c băng l n nh t kho ng BIO24. Các m i còn l i cho k t qu ơn 2500 bp. Xu t hi n 6 băng cá bi t (ch xu t hình ho c a hình không rõ ràng. Th ng kê hi n duy nh t m t m u) và khuy t 6 băng k t qu phân tích v i 17 m i ư c trình bày m t m u duy nh t còn xu t hi n 15 m u b ng 3. còn l i. M i OPC5 nhân lên ư c s băng
nhi u nh t (218 băng) và m u HTD7 kho ng 750 bp. M i BIO24 nhân lên ư c khuy t 2 băng v trí có kích thư c kho ng 93 băng trong ó m u HTD13 có 1 băng cá 500 bp và 300 bp. M i OPC10 nhân lên bi t v trí có kích thư c kho ng 1500 bp. ư c 114 băng trong ó m u HTD7 M i S201 nhân lên ư c 159 băng và m u khuy t băng v trí có kích thư c kho ng HTD13 khuy t băng v trí có kích thư c 2500 bp; m u TD36 khuy t băng v trí có kho ng 100 bp. M i S285 nhân lên ư c 88 kích thư c kho ng 1200 bp; m u HTD13 băng và m u HTD13 xu t hi n băng cá xu t hi n m t băng cá bi t v trí có kích bi t có kích thư c kho ng 800 bp. M i S239 thư c kho ng 350 bp. M i UBC709 nhân nhân lên ư c s băng ít nh t (31 băng) và ư c 101 băng và m u HTD13 khuy t 1 m u TD41 xu t hi n 2 băng cá bi t có kích băng v trí có kích thư c kho ng 500 bp. thư c kho ng 1000 bp và 1500 bp. S băng M i UBC728 nhân ư c 152 băng và m u nhân lên trung bình cho c 17 m i là 102,2 TD45 khuy t băng v trí có kích thư c băng/m i. B ng 3. S băng AD thu ư c c a các m u lan Hài nghiên c u v i 17 m i RAPD M i OPC OPC OPC OPC OPC S S S S S S S S UBC UBC BIO OPA T ng M u 4 5 10 11 15 201 202 208 239 256 279 285 300 709 728 24 18 GL2 4 13 7 4 5 13 9 5 1 5 7 5 6 5 12 6 5 112 HTD5 4 13 6 6 3 13 9 5 2 5 7 4 5 7 12 4 5 110 HTD7 4 11 5 4 4 10 9 4 0 5 3 4 3 6 4 2 4 82 HTD13 4 14 6 5 3 8 4 5 1 5 7 7 5 5 13 7 3 102 TD33 4 14 8 3 4 0 1 0 0 9 3 6 6 8 12 6 6 90 TD34 4 13 8 6 4 11 9 5 2 7 7 6 5 8 11 6 6 118 TD36 4 14 5 3 5 12 10 5 2 7 6 5 5 8 11 7 6 115 TD37 4 14 10 6 6 10 9 5 2 10 9 6 5 8 12 7 6 129 TD39 4 14 8 4 5 10 9 5 1 8 8 4 5 5 3 7 6 106 TD40 4 14 7 3 6 10 10 5 2 8 5 6 4 6 10 7 3 110 TD41 4 14 7 3 6 8 10 5 6 10 7 6 4 6 10 7 5 118 TD42 4 14 6 7 5 13 8 5 4 10 6 6 4 7 10 7 5 121 TD45 4 14 8 7 4 10 7 5 4 6 6 7 2 6 2 5 4 101 TD46 4 14 8 7 4 9 6 5 1 7 7 6 4 6 10 5 6 109 TD47 4 14 8 6 4 9 8 5 1 6 6 6 4 6 10 5 3 105 TD49 4 14 7 6 4 13 10 5 2 5 6 4 5 4 10 5 6 110 T ng 64 218 114 80 72 159 128 74 31 113 100 88 72 101 152 93 79 1738 (a) (b) Hình 3. K t qu i n di s n ph m RAPD-PCR (a) M i OPC10; (b) M i S279 (M: Marker 1kb).
màu xanh m, m t dư i có m nâu, 3. H s tương ng di truy n gi a các m u TD33 có lá màu xanh nh t, m t dư i m u Hài m màu tía m, còn m u TD42 lá bóng, to D a trên k t qu th ng kê các băng b n, m t dư i có nhi u m nâu dày ADN thu ư c, k t qu thi t l p b ng h s c; màu s c hoa cũng khác nhau: M u tương ng di truy n và sơ hình cây HTD7 hoa có màu vàng nh t, còn 2 m u quan h di truy n c a 16 m u Hài m ch TD33 và TD42 hoa màu vàng m. ra b ng 4 và hình 4. C p m u (TD46 - TD47) có h s Qua k t qu b ng 4 cho th y h s tương ng di truy n cao nh t là 0,94. M u tương ng di truy n c a 16 m u Hài m TD46 và TD47 có hình thái lá và hoa khá dao ng t 0,56 n 0,94. Hai c p m u gi ng nhau, cánh trên và 2 cánh bên hoa (HTD7 - TD33) và (HTD7 - TD42) có m c u màu vàng, có nhi u m nh li ti sai khác di truy n l n nh t (h s tương trên kh p cánh hoa. Hai m u này ch khác ng di truy n nh nh t là 0,56). m c nhau màu s c c a hoa: M u TD46 hoa có hình thái, hai c p m u này có nhi u c màu vàng nh t, còn m u TD47 hoa có màu i m hình thái khác nhau: M u HTD7 có lá vàng m hơn. B ng 4. H s tương ng di truy n gi a các m u Hài m GL2 HTD5 HTD7 HTD13 TD33 TD34 TD36 TD37 TD39 TD40 TD41 TD42 TD45 TD46 TD47 TD49 GL2 1,00 HTD5 0,88 1,00 HTD7 0,63 0,65 1,00 HTD13 0,76 0,75 0,58 1,00 TD33 0,71 0,68 0,56 0,65 1,00 TD34 0,84 0,84 0,63 0,72 0,78 1,00 TD36 0,86 0,84 0,61 0,72 0,74 0,86 1,00 TD37 0,81 0,80 0,60 0,71 0,77 0,89 0,85 1,00 TD39 0,76 0,71 0,70 0,65 0,68 0,78 0,77 0,81 1,00 TD40 0,82 0,77 0,63 0,74 0,71 0,81 0,88 0,84 0,82 1,00 TD41 0,79 0,75 0,57 0,66 0,72 0,78 0,83 0,82 0,77 0,88 1,00 TD42 0,81 0,80 0,56 0,70 0,70 0,80 0,84 0,82 0,75 0,85 0,88 1,00 TD45 0,69 0,72 0,69 0,63 0,64 0,74 0,69 0,73 0,77 0,76 0,69 0,76 1,00 TD46 0,79 0,80 0,63 0,70 0,75 0,84 0,79 0,84 0,80 0,83 0,79 0,83 0,83 1,00 TD47 0,79 0,78 0,63 0,74 0,70 0,81 0,77 0,80 0,76 0,87 0,79 0,82 0,82 0,94 1,00 TD49 0,85 0,88 0,65 0,74 0,68 0,84 0,84 0,80 0,74 0,80 0,76 0,82 0,76 0,85 0,84 1,00
Hình 4. Sơ hình cây v m i quan h di truy n c a 16 m u Hài m
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam D a vào sơ hình cây v m i quan h di truy n gi a các m u Hài m (hình 4) cho th y m c tương ng 80% có th chia 16 m u Hài m thành 6 nhóm: Nhóm I: Bao g m 9 m u GL2, HTD5, TD49, TD34, TD37, TD36, TD40, TD41 và TD42, ư c chia làm 2 nhóm ph : Nhóm 1.1: G m 6 m u GL2, HTD5, TD49, TD34, TD37 và TD36. H s tương ng dao ng t 0,80 (TD37 - TD49) và (TD37 - HTD5) n 0,89 (TD34 và TD37). Nhóm 1.2: G m 3 m u TD40, TD41 và TD42. H s tương ng gi a 2 c p m u (TD41 - TD40) và (TD41 - TD42) u là 0,88; gi a TD40 và TD42 là 0,85. Nhóm II: G m 3 m u TD45, TD46 và TD47, h s tương ng gi a TD45 và TD46 là 0,83; gi a TD45 và TD47 là 0,82; gi a TD46 và TD47 là 0,94. Nhóm III: G m duy nh t m u TD39 có h s tương ng v i 15 m u còn l i dao ng t 0,65 (TD39 và HTD13) n 0,82 (TD39 và TD40). Nhóm IV: G m duy nh t m u TD33 có h s tương ng v i các m u còn l i dao ng t 0,56 (TD33 và HTD7) n 0,78 (TD33 và TD34). Nhóm V: G m 1 m u HTD13 có h s tương ng v i các m u còn l i dao ng t 0,58 (HTD7 và HTD13) n 0,76 (HTD13 và GL2). Nhóm VI: G m duy nh t m u HTD7 có h s tương ng di truy n v i 15 m u còn l i dao ng t 0,56 (HTD7 - TD42) và (HTD7-TD33) n 0,70 (HTD7 - TD39). IV. K T LU N 1. K t lu n - Loài lan Hài m (Paphiopedium concolor Pfitzer) b n a c a Vi t Nam r t a d ng và phong phú. Các m u gi ng thu th p t i các vùng sinh thái khác nhau u có các c i m c trưng riêng v hình thái. - m c phân t ADN, k t qu phân tích b ng k thu t RAPD-PCR ch ra h s tương ng di truy n c a các m u Hài m dao ng t 0,56 n 0,94; 16 m u Hài m nghiên c u ư c phân thành 6 nhóm khác nhau. - Phương pháp mô t các c i m hình thái và phương pháp ánh giá a hình di truy n m c ADN có th b sung và h tr l n nhau công vi c phân lo i dư i loài tr nên chính xác hơn, ph c v cho công tác b o t n, khai thác và s d ng m t cách có hi u qu các ngu n gen lan Hài b n a c a Vi t Nam. 2. ngh Ti p t c i u tra, thu th p thêm các gi ng lan Hài ph c v cho công tác phân lo i, b o t n và ch n t o gi ng m i. Nghiên c u sâu hơn m c phân t xác nh các marker/ch th nh n d ng chính xác các ngu n gen lan Hài c a Vi t Nam. 8
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam TÀI LI U THAM KH O 1. Tr n H p, 1998. Phong lan Vi t am, Nhà xu t b n Nông nghi p, 703 trang. 2. Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan K L c, guy n Ti n Hi p, 2004. Lan Hài Vi t Nam, Nhà xu t b n Giao thông v n t i, 308 trang. 3. Li D. M., Sheng Y. Q, and Zhu G. F., 2007. “Analysis of the Germ plasm Resources and Genetic Relationships Among Hybrid Cymbidium Cultivars and Native Species with RAPD Markers”, Agricultural Sciences in China, 6 (8), pp. 922-929. 4. Obara-Okeyo P. and S. Kako, 1998. “Genetic diversity and identification of cymbidium cultivars as measured by random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers”, Euphytica, 99, pp. 95-1001. 5. Pellegrino G., Musacchio A., oce M. E., Palermo A. M. and Widmer A., 2005. “Reproductive Versus Floral Isolation Among Morphologically Similar Serapias L. species (Orchidaceae)”, Journal of Heredity, 96 (1), pp. 15-23. 6. Tr n Duy Quý, 2005. S tay ngư i Hà N i chơi lan, Nhà xu t b n Nông nghi p, tr. 105-107. gư i ph n bi n: Tr n Duy Qúy 9