Nghiên cứu định lượng acyclovir trong huyết tương chó bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2020<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ACYCLOVIR TRONG HUYẾT TƯƠNG<br /> CHÓ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO<br /> Lê Văn Thanh1; Vũ Thị Thu Giang2; Trần Cát Đông3<br /> Tạ Mạnh Hùng4; Nguyễn Văn Bạch1<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: thẩm định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao nhằm định lượng acyclovir<br /> trong huyết tương chó. Đối tượng và phương pháp: loại protein trong huyết tương chó bằng<br /> phương pháp tủa protein, sau đó định lượng acyclovir bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu<br /> năng cao. Khảo sát các điều kiện sắc ký, thẩm định độ đặc hiệu, độ chọn lọc, khoảng tuyến<br /> tính, giới hạn định lượng dưới, hiệu suất chiết và độ ổn định của acyclovir theo các tiêu chí của<br /> FDA. Kết quả: chiết acyclovir từ huyết tương chó bằng phương pháp tủa protein với dung môi<br /> gây tủa là axít percloric 20%; xác định được các điều kiện sắc ký như: cột, pha động, tốc độ dòng,<br /> detector. Phương pháp được thẩm định và đạt các tiêu chí theo quy định của FDA. Kết luận:<br /> có thể sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng acyclovir trong huyết<br /> tương chó khi đánh giá sinh khả dụng của acyclovir trên chó thực nghiệm.<br /> * Từ khóa: Acyclovir; Huyết tương chó; Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.<br /> <br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ thu [1, 2]. Để khắc phục những nhược<br /> điểm trên, chúng tôi đã bào chế thành<br /> Acyclovir (ACV) là một dẫn chất tổng công viên nén ACV kết dính sinh học, chế<br /> hợp của axít nucleosid - guanosin, có tác phẩm đạt tiêu chuẩn cơ sở theo các tiêu<br /> dụng mạnh và chọn lọc trên virut gây chí về viên nén của Dược điển Việt Nam<br /> bệnh ở người, bao gồm virut Herpes V và dạng thuốc kết dính sinh học giải<br /> simplex týp 1 và 2, các virut Varicella- phóng kéo dài. Việc xác định sinh khả<br /> Zoster, virut Epstien-barr và cytomegalo. dụng và tương đương sinh học dựa vào<br /> Tuy nhiên, ACV có thời gian bán thải các thông số dược động học của viên nén<br /> ngắn, hấp thu qua đường tiêu hóa chậm ACV kết dính sinh học là cần thiết [3].<br /> và không hoàn toàn. Với liều hiện nay, Nhằm mục đích đánh giá sinh khả dụng<br /> lượng thuốc hấp thu rất thấp (15 - 30%) trên chó thực nghiệm, chúng tôi tiến hành<br /> do thời gian lưu trú tại vùng hấp thu ngắn. xây dựng và thẩm định phương pháp sắc<br /> Kết quả, hầu hết thuốc được đào thải qua ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định<br /> phân (50 - 60%) ở dạng không được hấp lượng ACV trong huyết tương chó [4].<br /> <br /> 1. Học viện Quân y<br /> 2. Trường Đại học Dược Hà Nội<br /> 3. Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh<br /> 4. Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương<br /> Người phản hồi (Corresponding author): Lê Văn Thanh (levanthanh09091963@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 04/09/2019; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 03/10/2019<br /> Ngày bài báo được đăng: 02/01/2020<br /> <br /> 3<br /> T¹P CHÝ Y - d−îc HäC QU¢N Sù Sè 1-2020<br /> <br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP trong 1.000 ml nước, chỉnh về pH 3,0 bằng<br /> NGHIÊN CỨU axít photphoric).<br /> 1. Nguyên liệu và thiết bị. + Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút.<br /> * Nguyên liệu và hóa chất: + Detector: PDA 252 nm.<br /> - ACV chuẩn: hàm lượng 99,9% (do Viện + Thể tích tiêm: 100 µl.<br /> Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương cung cấp). + Nhiệt độ autosampler: 4oC.<br /> - Viên nén ACV khả dụng sinh học * Thẩm định phương pháp định lượng<br /> đường tiêu hóa (tự bào chế) đạt tiêu chuẩn ACV trong huyết tương chó:<br /> cơ sở.<br /> - Pha dung dịch ACV chuẩn trong huyết<br /> - Huyết tương chó trắng đạt tiêu chuẩn tương trắng:<br /> thử thuốc.<br /> + Dung dịch chuẩn gốc: nồng độ chính<br /> - Các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn cho xác 500 µg/ml ACV trong nước cất.<br /> HPLC hoặc tinh khiết phân tích.<br /> + Pha loãng dung dịch chuẩn gốc với<br /> * Thiết bị:<br /> huyết tương trắng để thu được mẫu ACV<br /> Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao trong huyết tương có nồng độ 1 và 5 µg/ml.<br /> SHIMADZU; máy ly tâm lạnh SARTORIUS<br /> + Mẫu chuẩn: pha loãng dãy dung dịch<br /> (Đức), máy lắc xoáy VELP (Italia); cân<br /> trên với huyết tương trắng để thu được<br /> phân tích SARTORIUS (Đức) có độ chính mẫu chuẩn có nồng độ ACV trong từ<br /> xác 0,1 mg và các dụng cụ khác đạt tiêu 0,1 - 5 µg/ml.<br /> chuẩn phân tích.<br /> Quy trình thẩm định phương pháp định<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu. lượng tiến hành theo hướng dẫn của FDA<br /> * Phương pháp định lượng: [5]:<br /> - Xử lý mẫu ACV trong huyết tương: - Tính chọn lọc: chuẩn bị 6 mẫu huyết<br /> mẫu huyết tương để rã đông ở nhiệt độ tương chó khác nhau ở nồng độ giới hạn<br /> phòng. Lấy 1 ml huyết tương, thêm 250 µl định lượng dưới (LLOQ) dự kiến khoảng<br /> dung dịch axít percloric 20%, lắc xoáy 0,1 µg/ml. Phân tích các mẫu bằng phương<br /> 15 giây, ly tâm 10.000 vòng trong 15 phút, pháp HPLC.<br /> sau đó hút lớp dung dịch phía trên, tiêm - Đường chuẩn và khoảng tuyến tính:<br /> sắc ký. Các mẫu huyết tương trắng có chuẩn bị mẫu huyết tương chó chứa ACV<br /> pha ACV chuẩn và huyết tương chó sau với 7 nồng độ chính xác (0,1; 0,2; 0,5;<br /> khi uống thuốc đều được chiết theo quy 1,0; 2,0; 3,0 và 5,0 µg/ml), mỗi nồng độ 2<br /> trình trên rồi tiến hành định lượng. mẫu độc lập (có điều chỉnh khối lượng<br /> - Điều kiện sắc ký: ACV cân). Phân tích các mẫu bằng<br /> + Cột sắc ký: C18; 250 x 4,6 mm; 5 µm. phương pháp HPLC. Xây dựng đường<br /> Nhiệt độ cột 400C. chuẩn theo mô hình hồi quy tuyến tính.<br /> + Pha động: methanol:dung dịch đệm - LLOQ: chuẩn bị 6 mẫu huyết tương chó<br /> pH 3,0 (tỷ lệ 8:92) (dung dịch đệm pH 3,0 chứa ACV ở nồng độ chính xác (0,1 µg/ml)<br /> pha như sau: 0,43 g natri octansulfonic (có điều chỉnh khối lượng ACV cân).<br /> <br /> 4<br />  t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2020<br /> <br /> Chuẩn bị một đường chuẩn trong cùng tích của mẫu kiểm tra so với nồng độ<br /> điều kiện. Phân tích các mẫu bằng thực đã pha. Xác định độ lặp lại trong<br /> phương pháp HPLC. Xác định độ đúng ngày bằng cách tính độ lệch chuẩn tương<br /> bằng cách so sánh nồng độ tính được từ đối RSD giữa các giá trị phân tích của<br /> đường chuẩn với nồng độ thực đã pha. mỗi nồng độ. Xác định độ lặp khác ngày<br /> Xác định độ chính xác bằng cách tính độ bằng cách lặp lại các bước trên trong<br /> lệch chuẩn tương đối RSD. 3 ngày. Tính độ lệch chuẩn tương đối RSD<br /> - Độ đúng, độ chính xác (độ lặp lại giữa giá trị phân tích của mỗi nồng độ<br /> trong ngày và khác ngày): chuẩn bị 3 lô trong những ngày đánh giá.<br /> mẫu huyết tương chó chứa ACV, mỗi lô - Độ ổn định: chuẩn bị 2 lô mẫu huyết<br /> gồm 6 mẫu độc lập: mẫu kiểm tra nồng tương chó chứa ACV, mỗi lô gồm 6 mẫu<br /> độ thấp (LQC) khoảng 0,3 µg/ml. Mẫu độc lập: mẫu kiểm tra LQC khoảng<br /> kiểm tra nồng độ trung bình (MQC) 0,3 µg/ml. Mẫu kiểm tra HQC khoảng<br /> khoảng 2,5 µg/ml. Mẫu kiểm tra nồng độ 4,0 µg/ml. Phân tích ngay các mẫu bằng<br /> cao (HQC) khoảng 4,0 µg/ml. Chuẩn bị phương pháp HPLC, xác định hàm lượng<br /> một đường chuẩn trong cùng điều kiện. dược chất trong mẫu ban đầu. Sau 24 giờ,<br /> Phân tích các mẫu bằng phương pháp phân tích lại các mẫu bằng phương pháp<br /> HPLC. Xác định độ đúng của phương HPLC, xác định lại hàm lượng dược chất<br /> pháp bằng cách so sánh nồng độ phân trong các mẫu trên.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> 1. Tính tương thích của hệ thống.<br /> Xác định tính tương thích của hệ thống HPLC: tiêm lặp lại 6 lần các dung dịch<br /> chuẩn ACV trong mẫu huyết tương tự tạo có nồng độ khoảng 2,5 µg/ml. Xác định thời<br /> gian lưu (TR), diện tích píc của ACV trên sắc ký đồ.<br /> Bảng 1: Kết quả đánh giá tính tương thích của hệ thống HPLC (n = 6).<br /> Mẫu Diện tích píc (mAU.s) Thời gian lưu (giây) Hệ số kéo đuôi<br /> 1 455080 7,575 1,381<br /> 2 451887 7,568 1,383<br /> 3 453141 7,567 1,377<br /> 4 452448 7,566 1,384<br /> 5 450325 7,555 1,384<br /> 6 452407 7,557 1,388<br /> Trung bình 452548 7,565 1,383<br /> CV (%) 0,3 0,1 0,3<br /> <br /> Hệ thống HPLC hoạt động ổn định, có độ lặp lại tốt. Hệ số biến thiên CV (%) của<br /> thời gian lưu, diện tích píc và hệ số kéo đuôi của ACV đều < 2,0%, chứng tỏ hệ thống<br /> có tính phù hợp cao. Phù hợp với việc phân tích dược chất trong dịch sinh học.<br /> <br /> 5<br /> T¹P CHÝ Y - d−îc HäC QU¢N Sù Sè 1-2020<br /> <br /> 2. Kết quả thẩm định tính chọn lọc.<br /> Phân tích các mẫu huyết tương trắng và mẫu huyết tương tự tạo chứa ACV chuẩn<br /> có nồng độ 0,1 µg/ml (ở nồng độ LLOQ).<br /> Bảng 2: Đáp ứng píc của mẫu trắng tại thời điểm trùng thời gian lưu (tR ) của ACV.<br /> <br /> Diện tích píc của Diện tích píc mẫu chuẩn ACV ở<br /> Mẫu<br /> mẫu trắng (mAU.s) nồng độ LLOQ (mAU.s)<br /> <br /> 1 2377 19615<br /> <br /> 2 2782 20542<br /> <br /> 3 2545 20007<br /> <br /> 4 1982 19669<br /> <br /> 5 2289 20808<br /> <br /> 6 2405 18366<br /> <br /> Trung bình 2397 19835<br /> <br /> Tỷ lệ đáp ứng píc (%) 12,1<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> (a) (b)<br /> <br /> Hình 1: Sắc ký đồ của mẫu huyết tương trắng (a) và sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng<br /> có pha chuẩn ACV ở nồng độ 0,1 µg/ml (b).<br /> <br /> Kết quả cho thấy, tỷ lệ diện tích píc của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian<br /> lưu của ACV bằng 12,1% so với diện tích píc của mẫu LLOQ nằm trong giới hạn cho<br /> phép (≤ 20%). Trên sắc ký đồ của mẫu huyết tương trắng, hầu như không có píc xuất<br /> hiện tại vị trí xuất hiện píc của ACV pha trong huyết tương trắng. Vì vậy, phương pháp<br /> phân tích ACV đáp ứng yêu cầu về độ chọn lọc theo hướng dẫn của FDA.<br /> <br /> 6<br />  t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2020<br /> <br /> 3. Kết quả thẩm định độ tuyến tính và giới hạn định lượng dưới.<br /> Bảng 3: Tương quan giữa nồng độ ACV trong huyết tương chó và diện tích píc.<br /> <br /> Tên mẫu S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7<br /> <br /> Nồng độ thực (µg/ml) 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 3,0 5,0<br /> <br /> Diện tích píc (mAU.s) 26639 45027 102556 200375 384079 587020 977053<br /> <br /> Phương trình hồi quy 2<br /> * Y = 193848x + 5048,8 R = 0,9999<br /> (Y = aX+b)<br /> <br /> Nồng độ xác định từ<br /> 0,110 0,210 0,503 1,008 1,9553 3,002 5,014<br /> đường chuẩn (ng/ml)<br /> <br /> Nồng độ xác định từ<br /> đường chuẩn so với 111,4 103,1 100,6 100,8 97,8 100,1 100,3<br /> giá trị thực (%)<br /> <br /> <br /> <br /> 1200000<br /> D iệ n tíc h p íc (m A U .s )<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 1000000<br /> y = 193848x + 5048.8<br /> 800000 2<br /> R = 0.9999<br /> 600000<br /> <br /> 400000<br /> <br /> 200000<br /> <br /> 0<br /> 0 1 2 3 4 5 6<br /> Nồng độ (mcg/ml)<br /> <br /> <br /> Hình 2: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ ACV trong huyết tương chó và<br /> diện tích píc.<br /> Tính lại nồng độ hoạt chất có trong mẫu chuẩn theo phương trình hồi quy đã xây<br /> dựng. Kết quả cho thấy, trong khoảng nồng độ khảo sát, 100% số điểm đạt độ đúng so<br /> với giá trị thực nằm ở giới hạn cho phép (85 - 115%), giá trị R2 = 0,9999. Như vậy,<br /> trong khoảng nồng độ đã khảo sát, có tương quan tuyến tính giữa nồng độ ACV trong<br /> huyết tương chó và diện tích píc thu được. Khoảng tuyến tính này phù hợp để định<br /> lượng ACV trong huyết tương chó.<br /> LLOQ: tiến hành khảo sát mẫu chuẩn ACV ở nồng độ khoảng 0,1 µg/ml.<br /> <br /> 7<br /> T¹P CHÝ Y - d−îc HäC QU¢N Sù Sè 1-2020<br /> <br /> Bảng 4: Kết quả xác định LLOQ.<br /> Diện tích píc mẫu<br /> Diện tích píc mẫu (b)<br /> huyết tương có Nồng độ tìm Độ đúng Đạt/không<br /> Mẫu huyết tương trắng (a)<br /> ACV (≈ 0,1 µg/ml) thấy (µg/ml) (%) đạt<br /> (mAU.s)<br /> (mAU.s)<br /> <br /> 1 2377 19615 0,091 93,8 Đạt<br /> 2 2782 20542 0,096 99,0 Đạt<br /> 3 2545 20007 0,093 96,0 Đạt<br /> 4 1982 19669 0,091 94,1 Đạt<br /> 5 2289 20808 0,098 100,5 Đạt<br /> 6 2405 18366 0,084 86,7 Đạt<br /> Trung bình 2397 19835 0,092 95,0<br /> <br /> RSD (%) 5,1 5,1<br /> <br /> Đáp ứng trung bình của mẫu LLOQ/mẫu trắng (%) 8,3<br /> <br /> (a: Tính từ phương trình hồi quy; b: % so với nồng độ thực)<br /> Độ đúng tìm thấy ở nồng độ LLOQ cao hơn 90% và có sự chênh lệch không nhiều<br /> giữa các mẫu (RSD 5,1%), chứng tỏ LLOQ xác định phù hợp.<br /> 4. Độ đúng, độ lặp lại trong ngày và khác ngày.<br /> Chuẩn bị các mẫu kiểm tra nồng độ trong huyết tương có nồng độ 0,3 µg/ml;<br /> 2,5 µg/ml và 4,0 µg/ml, mỗi nồng độ chuẩn bị 6 mẫu.<br /> Bảng 5: Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại trong ngày.<br /> <br /> LQC (≈ 0,3 µg/ml) MQC (≈ 2,5 µg/ml) HQC (≈ 4,0 µg/ml)<br /> Mẫu Nồng độ<br /> a<br /> Độ đúng<br /> b<br /> Nồng độ<br /> a<br /> Độ đúng<br /> b<br /> Nồng độ<br /> a<br /> Độ đúng<br /> b<br /> <br /> (µg/ml) (%) (µg/ml) (%) (µg/ml) (%)<br /> <br /> 1 0,294 101,1 2,296 94,7 3,802 98,0<br /> <br /> 2 0,287 98,5 2,448 100,9 3,952 101,8<br /> <br /> 3 0,291 100,0 2,497 102,9 3,986 102,7<br /> <br /> 4 0,274 94,3 2,511 103,5 3,984 102,7<br /> <br /> 5 0,274 94,1 2,513 103,6 4,019 103,6<br /> <br /> 6 0,280 96,4 2,512 103,6 4,007 103,3<br /> <br /> Trung bình 0,283 97,4 2,463 101,5 3,958 102,0<br /> <br /> RSD (%) 3,0 3,0 3,5 3,5 2,0 2,0<br /> <br /> (a: Tính từ phương trình hồi quy; b: % so với nồng độ thực)<br /> <br /> 8<br />  t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2020<br /> <br /> Bảng 6: Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại khác ngày.<br /> <br /> LQC (≈ 0,3 µg/ml) MQC (≈ 2,5 µg/ml) HQC (≈ 4,0 µg/ml)<br /> Ngày a b a b a b<br /> Nồng độ Độ đúng Nồng độ Độ đúng Nồng độ Độ đúng<br /> (µg/ml) (%) (µg/ml) (%) (µg/ml) (%)<br /> <br /> 1 0,294 101,1 2,296 94,7 3,802 98,0<br /> <br /> 2 0,287 98,5 2,448 100,9 3,952 101,8<br /> <br /> 3 0,291 100,0 2,497 102,9 3,986 102,7<br /> I<br /> 4 0,274 94,3 2,511 103,5 3,984 102,7<br /> <br /> 5 0,274 94,1 2,513 103,6 4,019 103,6<br /> <br /> 6 0,280 96,4 2,512 103,6 4,007 103,3<br /> <br /> 1 0,298 102,3 2,209 91,1 3,733 96,2<br /> <br /> 2 0,292 100,2 2,453 101,2 3,969 102,3<br /> <br /> 3 0,288 99,0 2,471 101,9 3,966 102,2<br /> II<br /> 4 0,295 101,4 2,466 101,7 4,003 103,2<br /> <br /> 5 0,283 97,3 2,440 100,6 3,966 102,2<br /> <br /> 6 0,287 98,5 2,459 101,4 3,970 102,3<br /> <br /> 1 0,287 96,5 2,498 100,6 4,129 104,0<br /> <br /> 2 0,291 97,8 2,578 103,9 4,276 107,7<br /> <br /> 3 0,280 93,8 2,617 105,4 4,250 107,0<br /> III<br /> 4 0,289 97,0 2,620 105,6 4,260 107,3<br /> <br /> 5 0,283 95,1 2,633 106,1 4,277 107,7<br /> <br /> 6 0,288 96,8 2,644 106,5 4,291 108,0<br /> <br /> Trung bình 0,287 97,8 2,492 101,9 4,047 103,4<br /> RSD (%) 2,3 2,6 4,5 3,8 4,1 3,1<br /> <br /> (a: Tính từ phương trình hồi quy; b: % so với nồng độ thực)<br /> <br /> Ở cả 3 nồng độ, phương pháp đều cho độ đúng trong ngày và khác ngày cao<br /> (trong khoảng 85 - 115%) và độ lặp lại trong ngày và khác ngày với giá trị RSD < 15%,<br /> chứng tỏ phương pháp phân tích có độ đúng, độ lặp lại đáp ứng yêu cầu đối với<br /> phương pháp phân tích các chất trong dịch sinh học.<br /> <br /> <br /> <br /> 9<br /> T¹P CHÝ Y - d−îc HäC QU¢N Sù Sè 1-2020<br /> <br /> 5. Tỷ lệ thu hồi của phương pháp.<br /> Tiến hành sắc ký các lô mẫu kiểm tra nồng độ bao gồm LQC 0,3 µg/ml, MQC 2,5 µg/ml<br /> và HQC 4,0 µg/ml, mỗi lô gồm ít nhất 5 mẫu độc lập. Đồng thời tiến hành sắc ký các<br /> mẫu chuẩn pha trong dung môi pha mẫu có nồng độ tương ứng.<br /> Bảng 7: Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi của ACV.<br /> <br /> LQC (≈ 0,3 µg/ml) MQC (≈ 2,5 µg/ml) HQC (≈ 4,0 µg/ml)<br /> <br /> Diện tích píc Diện tích píc Diện tích píc Diện tích píc Diện tích píc Diện tích<br /> Mẫu ACV trong ACV trong ACV trong ACV trong ACV trong píc ACV<br /> trong<br /> huyết tương dung môi huyết tương dung môi huyết tương<br /> dung môi<br /> (mAU.s) (mAU.s) (mAU.s) (mAU.s) (mAU.s) (mAU.s)<br /> 1 61551 56215 447720 469120 738476 740886<br /> 2 60113 55721 477169 464937 767251 740639<br /> 3 60913 55531 486505 465630 773939 739433<br /> 4 57716 58111 489222 465148 773549 739792<br /> 5 57635 57280 489611 463732 780200 740734<br /> 6 58890 59172 489519 463607 778021 740505<br /> Trung bình 59470 57005 479958 465362 768573 740332<br /> RSD (%) 2,8 2,5 3,4 0,4 2,0 0,1<br /> <br /> Tỷ lệ thu hồi (%) 104,3 103,1 103,8<br /> <br /> Quy trình chiết đạt tỷ lệ thu hồi cao và ổn định. Giá trị RSD% của đáp ứng píc ACV<br /> giữa các mẫu ≤ 3,4%. Tỷ lệ thu hồi khác nhau giữa các nồng độ không quá ± 1,2%.<br /> Do vậy, có thể khẳng định phương pháp chiết tách, xử lý mẫu là thích hợp, có thể áp<br /> dụng trong thực nghiệm.<br /> 6. Độ ổn định của mẫu huyết tương.<br /> - Độ ổn định của mẫu sau ba chu kỳ đông - rã đông: phân tích các mẫu LQC và<br /> HQC theo phương pháp đã xây dựng. So sánh nồng độ ACV trong các mẫu LQC và<br /> HQC ngay sau khi pha (nồng độ ban đầu) với bảo quản sau 3 chu kỳ đông - rã đông.<br /> Bảng 8: Độ ổn định của ACV trong mẫu huyết tương chó sau 3 chu kỳ đông - rã đông.<br /> Nồng độ (µg/ml)<br /> Mẫu LQC (≈ 0,3 µg/ml) Mẫu HQC (≈ 4,0 µg/ml)<br /> Mẫu<br /> Sau 3 chu kỳ đông - Sau 3 chu kỳ đông -<br /> Ban đầu Ban đầu<br /> rã đông rã đông<br /> 1 0,335 0,310 4,140 4,189<br /> 2 0,330 0,311 4,181 4,156<br /> 3 0,319 0,312 4,274 4,223<br /> <br /> <br /> 10<br />  t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2020<br /> <br /> 4 0,329 0,320 4,315 4,258<br /> <br /> 5 0,334 0,315 4,324 4,295<br /> <br /> 6 0,331 0,320 4,276 4,339<br /> <br /> Trung bình 0,330 0,315 4,251 4,243<br /> <br /> RSD (%) 1,7 1,4 1,8 1,6<br /> <br /> Độ lệch (%) -4,5 -0,2<br /> <br /> Sau 3 chu kỳ đông - rã đông, nồng độ của ACV vẫn ổn định, độ lệch giữa nồng độ<br /> thời điểm ban đầu và nồng độ sau 3 chu kỳ đông - rã đông ≤ 4,5% (< 15%) và kết quả<br /> định lượng ở mỗi nồng độ có RSD ≤ 1,8% (< 15%), đạt yêu cầu theo quy định để có<br /> thể phân tích lại mẫu khi cần thiết.<br /> - Độ ổn định dài ngày: bảo quản mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC, nhiệt<br /> độ -350C ± 50C. Phân tích mẫu tại thời điểm ban đầu và sau từng khoảng thời gian bảo<br /> quản nhất định (7 ngày, 22 ngày và 44 ngày).<br /> <br /> Bảng 9: Kết quả độ ổn định dài ngày của ACV trong huyết tương chó.<br /> <br /> Nồng độ (µg/ml)<br /> <br /> Mẫu LQC (≈ 0,3 µg/ml) Mẫu HQC (≈ 4,0 µg/ml)<br /> Mẫu<br /> Ban Sau Sau Sau Ban Sau Sau Sau<br /> đầu 7 ngày 22 ngày 44 ngày đầu 7 ngày 22 ngày 44 ngày<br /> <br /> 1 0,335 0,318 0,306 0,299 4,140 4,004 3,997 3,999<br /> <br /> 2 0,330 0,319 0,304 0,287 4,181 4,091 4,227 4,031<br /> <br /> 3 0,319 0,348 0,305 0,277 4,274 4,052 4,270 4,127<br /> <br /> 4 0,329 0,319 0,300 0,285 4,315 4,160 4,351 4,027<br /> <br /> 5 0,334 0,345 0,305 0,277 4,324 4,181 4,368 4,095<br /> <br /> 6 0,331 0,338 0,299 0,283 4,276 4,193 4,288 3,955<br /> <br /> Trung bình 0,330 0,331 0,303 0,285 4,251 4,114 4,250 4,039<br /> <br /> RSD (%) 1,7 4,3 1,0 2,9 1,8 1,9 3,2 1,6<br /> <br /> Độ lệch (%) -0,3 -8,1 -13,7 2,4 0,0 -5,0<br /> <br /> Độ lệch của nồng độ mẫu 44 ngày với nồng độ tại thời điểm ban đầu ≤ 13,7% (< 15%)<br /> và giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ có RSD ≤ 4,3% (< 15%), đạt độ lệch<br /> chuẩn theo quy định, chứng tỏ mẫu vẫn ổn định sau 44 ngày bảo quản, đảm bảo phân<br /> tích hết mẫu.<br /> <br /> 11<br /> T¹P CHÝ Y - d−îc HäC QU¢N Sù Sè 1-2020<br /> <br /> KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Bộ Y tế. Dược thư Quốc gia Việt Nam.<br /> Đã thẩm định được độ chọn lọc, độ Nhà xuất bản Y học. 2009, tr.36-40.<br /> tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, hiệu 2. Sweetman S.C et al. Martindale.<br /> suất chiết và độ ổn định của ACV trong Pharmaceutical Press. 2009, pp.862-864, 911.<br /> 3. Gaoo J. Bioanalytical method validation<br /> huyết tương chó. Quy trình đã đáp ứng<br /> for studies on pharmacokinetics, bioavailability<br /> được các yêu cầu của một phương pháp and bioequivalence: Highlights of the FDA’s<br /> phân tích trong dịch sinh học theo quy guidance. Asian J Drug Metab Pharmacokinet.<br /> 2004, 4 (1), pp.5-13.<br /> định của FDA. Phương pháp này có thể<br /> 4. Center for Drug Evaluation and<br /> áp dụng để định lượng ACV trong huyết Research. Guidance for Industry Bioanalytical<br /> tương chó khi nghiên cứu sinh khả dụng Method Validation, FDA, U.S. Department of<br /> Health and Human Services. 2001.<br /> và xác định các thông số dược động học<br /> 5. Food and Drug Administration USA.<br /> của viên nén ACV 200 mg kết dính sinh Guidance for Industry: Q1A (R2) Stability Testing<br /> học trên chó thực nghiệm. of New Drug Substances and Products. 2003.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 12<br />