Nghiên cứu độc tính cấp và bán trường diễn của bài thuốc “hạ áp-01” trên động vật thực nghiệm

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2017<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ BÁN TRƯỜNG DIỄN<br /> CỦA BÀI THUỐC “HẠ ÁP-01” TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM<br /> Huỳnh Thanh Ân*; Nguyễn Hoàng Ngân**; Trần Quốc Bảo***<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: nghiên cứu tính an toàn của bài thuốc “Hạ áp-01” trên thực nghiệm. Phương pháp<br /> nghiên cứu: xác định độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng dòng Swiss theo phương<br /> pháp Litchfield – Wilcoxon và xác định độc tính bán trường diễn trên chuột cống trắng dòng Wistar<br /> theo quy định của Bộ Y tế Việt Nam. Kết quả: chưa tìm thấy LD50 của bài thuốc “Hạ áp-01” theo<br /> đường uống trên chuột nhắt trắng với mức liều cao nhất có thể cho chuột uống trong 24 giờ là<br /> 216,0g/kg thể trọng. Với liều 34,72 g/kg/24 giờ và liều 104,16 g/kg/24 giờ cho chuột cống trắng<br /> uống liên tục trong 60 ngày, thuốc không ảnh hưởng lên trọng lượng cơ thể và điện tim; không<br /> gây thay đổi có ý nghĩa thống kê các chỉ số huyết học, chỉ tiêu sinh hóa; không gây biến đổi mô<br /> bệnh học gan, lách, thận. Kết luận: bài thuốc “Hạ áp-01” không gây độc tính cấp và độc tính<br /> bán trường diễn trên động vật thực nghiệm.<br /> * Từ khóa: Hạ áp-01; Độc tính cấp; Độc tính bán trường diễn; Tăng huyết áp; Động vật<br /> thực nghiệm.<br /> <br /> Studying the Acute Toxicity and Semi-chronic Toxicity of Herbal<br /> Medicines “Ha ap-01” on Experimental Animals<br /> Summary<br /> Objectives: To study the safety of herbal medicines “Ha ap-01” on experimental animal.<br /> Subjects and methods: The oral acute toxicity was evaluated on Swiss mice by the Litchfield Wilcoxon’s method, and the semi-chronic toxicity was evaluated on Wistar rats followed Viet<br /> Nam Health Ministry regulation. Results: With the highest dose that mice could drink in 24<br /> hours (216.0 g/kg bw), LD50 of “Ha ap-01” was not identified. With the doses of 34.72 g/kg and<br /> 104.16 g/kg/per day for 60 consecutive days drinking, “Ha ap-01” did not effect on body<br /> weight and ECG of rats; did not cause any statistically significant changes in hematologies,<br /> blood chemistry indexes; did not cause any changes in histology of liver, spleen, kidney of<br /> experimental rats. Conclusion: Herbal medicines “Ha ap-01” did not cause acute toxicity and<br /> semi-chronic toxicity on experimental animals.<br /> * Key words: Ha ap-01; Acute toxicity; Semi-chronic toxicity; Hypertension; Experimental animal.<br /> * ViÖn Y häc Cæ truyÒn TP. Hå ChÝ Minh<br /> ** Học viện Quân y<br /> *** Bệnh viện Quân y 175<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Hoàng Ngân (nguyenhoangngan@yahoo.com.vn)<br /> Ngày nhận bài: 05/12/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 02/12/2016<br /> Ngày bài báo được đăng: 16/01/2017<br /> <br /> 7<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2017<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Tăng huyết áp (THA) là căn bệnh nguy<br /> hiểm có xu hướng ngày càng tăng. Y học<br /> Cổ truyền có nhiều vị thuốc, nhiều bài<br /> thuốc hay điều trị THA có hiệu quả và tính<br /> an toàn cao. Việc nghiên cứu một cách<br /> khoa học, có hệ thống các bài thuốc này<br /> là cần thiết và đúng đắn trong công tác<br /> phát triển và hiện đại hóa Y học Cổ truyền.<br /> Bài thuốc “Hạ áp-01” gồm 14 vị thuốc<br /> đông dược, do Viện Y Dược học Dân tộc<br /> Thành phố Hồ Chí Minh phát triển và đưa<br /> vào nghiên cứu đánh giá tính an toàn và<br /> tác dụng điều trị bệnh THA. Vì vậy, chúng<br /> tôi tiến hành đề tài này nhằm: Nghiên cứu<br /> độc tính cấp và độc tính bán trường diễn<br /> của dịch chiết bài thuốc “Hạ áp-01” trên<br /> động vật thực nghiệm.<br /> ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ<br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu.<br /> * Thuốc nghiên cứu: bài thuốc “Hạ áp-01”<br /> Công thức bài thuốc “Hạ áp-01”: Thạch<br /> quyết minh (Concha Haliotidis) 20 g, Thiên<br /> ma (Rhizoma Gastrodiae) 15 g, Chi tử<br /> (Fructus Gardeniae) 12 g, Bạch thược<br /> (Radix Paconiae alba) 25 g, Hoàng kỳ<br /> (Radix Astragali) 20 g, Ích mẫu thảo<br /> (Fructus Leonuri) 20 g, Ngưu tất (Radix<br /> Achyranthis bidentatae) 15 g, Trạch tả<br /> (Rhizoma Alismatis) 20 g, Viễn chí (Radix<br /> Polygalae) 10 g, Đan sâm (Radix Salviae<br /> militiorrhizae) 20 g, Trần bì (Pericarpium<br /> Citri Reticulatae) 10 g, Bán hạ chế (Rhizoma<br /> Pinelliae) 10 g, Hồng hoa (Flos Carthami)<br /> 10 g, Ngũ vị tử (Fructus Schisandrae<br /> chinenis) 10 g.<br /> Thuốc được chiết xuất tại Khoa Dược,<br /> Viện Y Dược học Dân tộc Thành phố Hồ<br /> Chí Minh thành dạng dịch chiết theo tỷ lệ<br /> 8<br /> <br /> 1 - 1 (1 ml cao chứa 1 g dược liệu). Trong<br /> nghiên cứu thực nghiệm: dịch chiết thuốc<br /> “Hạ áp-01” được cô quay chân không đến<br /> độ đậm đặc nhất có thể cho chuột uống<br /> được bằng kim đầu tù chuyên dụng. Cao<br /> đặc này cùng các dung dịch thuốc pha loãng<br /> ở những nồng độ khác nhau dùng cho<br /> chuột uống nhằm đánh giá độc tính cấp và<br /> bán trường diễn trên động vật thực nghiệm.<br /> * Động vật nghiên cứu:<br /> Chuột nhắt trắng dòng Swiss, 40 con,<br /> cân nặng 18 - 22 g. Chuột cống trắng dòng<br /> Wistar, 24 con, cân nặng 160 - 180 g.<br /> Động vật do Ban Cung cấp Động vật thí<br /> nghiệm, Học viện Quân y cung cấp, nuôi<br /> trong phòng nuôi động vật thí nghiệm<br /> 1 tuần trước khi nghiên cứu bằng thức ăn<br /> chuẩn dành cho động vật nghiên cứu,<br /> nước sạch uống tự do.<br /> * Dụng cụ máy móc:<br /> Máy xét nghiệm sinh hoá tự động<br /> Chemix 180 (Hãng Sysmex); máy xét<br /> nghiệm huyết học tự động XE2100 (Hãng<br /> Sysmex); máy điện tim Fukuda FX 7102<br /> (Fukuda, Nhật Bản); cân phân tích 10-4,<br /> model CP224S (Sartorius, Đức).<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> * Nghiên cứu độc tính cấp:<br /> Nghiên cứu độc tính cấp của thuốc<br /> “Hạ áp-01” trên chuột nhắt trắng bằng<br /> đường uống theo phương pháp Litchfield Wilcoxon [2] và hướng dẫn của Tổ chức<br /> Y tế Thế giới [5], quy chế đánh giá tính an<br /> toàn và hiệu lực thuốc cổ truyền của Bộ<br /> Y tế [1].<br /> Trước khi tiến hành thí nghiệm, cho chuột<br /> nhịn ăn 16 giờ, nước uống tự do. Sau 16 giờ,<br /> chia ngẫu nhiên chuột thành 05 lô, mỗi lô<br /> 08 con. Các lô thử cho uống thuốc với<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2017<br /> thể tích 0,2 ml/10 g/lần, 3 lần/24 giờ, mỗi<br /> lần cách nhau 3 giờ. Mức liều uống ở mỗi<br /> lô tăng dần: 72,0 g/kg; 108,0 g/kg; 129/6<br /> g/kg; 162,0 g/kg; 216,0 g/kg thể trọng.<br /> Theo dõi tình trạng chung của chuột và<br /> số lượng chuột chết ở mỗi lô trong 72 giờ<br /> sau khi chuột uống thuốc lần cuối. Tìm<br /> liều cao nhất không gây chết chuột (0%),<br /> liều thấp nhất gây chết chuột hoàn toàn<br /> (100%) và các liều trung gian. Từ đó xây<br /> dựng đồ thị tuyến tính để xác định LD50<br /> của thuốc thử (nếu có). Tiếp tục theo dõi<br /> tình trạng chung của chuột (hoạt động,<br /> ăn uống, bài tiết…) ở mỗi lô cho đến hết<br /> 7 ngày sau uống thuốc.<br /> <br /> thể tích trung bình hồng cầu, hàm lượng<br /> hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch<br /> cầu, công thức bạch cầu và số lượng tiểu<br /> cầu); sinh hóa đánh giá chức năng gan<br /> ( ALT, AST, bilirubin toàn phần, albumin<br /> và cholesterol toàn phần) và chức năng<br /> thận (nồng độ creatinin huyết thanh) [3, 4].<br /> Sau 60 ngày uống thuốc, mổ chuột để<br /> quan sát đại thể toàn bộ các cơ quan.<br /> Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan,<br /> lách, thận của ít nhất 30% số chuột ở mỗi<br /> lô. Thực hiện xét nghiệm vi thể tại Bộ<br /> môn Khoa Giải phẫu bệnh - Pháp y, Bệnh<br /> viện Quân y 103.<br /> * Xử lý số liệu:<br /> <br /> Tiến hành phẫu tích quan sát tình trạng<br /> các tạng ngay sau khi chuột chết (nếu có)<br /> để xác định nguyên nhân gây độc.<br /> <br /> Theo phương pháp thống kê y sinh<br /> học, so sánh bằng Anova test, sử dụng<br /> phần mềm SPSS 16.0. Biểu diễn số liệu<br /> <br /> * Nghiên cứu độc tính bán trường diễn:<br /> <br /> dưới dạng ± SD. Khác biệt có ý nghĩa<br /> thống kê khi p < 0,05.<br /> <br /> Theo quy định của Bộ Y tế Việt Nam<br /> [1], hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới<br /> [5] về đánh giá tính an toàn và hiệu lực<br /> của thuốc Y học Cổ truyền.<br /> Chia ngẫu nhiên 24 chuột cống trắng<br /> thành 3 lô, mỗi lô 08 con.<br /> - Lô chứng: uống nước.<br /> - Lô trị 1: uống thuốc “Hạ áp-01” liều<br /> 34,72 g dược liệu/kg/ngày (tương đương<br /> liều trên người).<br /> - Lô trị 2: uống thuốc “Hạ áp-01” liều<br /> 104,16 g dược liệu/kg/ngày (gấp 03 lần<br /> liều trên người).<br /> Cho chuột uống hàng ngày, trong 60<br /> ngày bằng kim đầu tù chuyên dụng.<br /> Theo dõi các chỉ tiêu vào trước lúc<br /> uống thuốc, sau 30 ngày và 60 ngày uống<br /> thuốc, gồm: tình trạng chung, thể trọng<br /> của chuột; ghi điện tim của chuột ở đạo<br /> trình DII; huyết học (số lượng hồng cầu,<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> 1. Kết quả nghiên cứu độc tính cấp.<br /> Bảng 1: Độc tính cấp theo đường uống<br /> của bài thuốc “Hạ áp-01” trên chuột nhắt<br /> trắng.<br /> <br /> Lô<br /> chuột<br /> <br /> Liều sử<br /> dụng tính<br /> Số<br /> theo g<br /> chuột<br /> dược liệu<br /> thí<br /> (g/kg trọng<br /> nghiệm lượng cơ<br /> thể (TLCT))<br /> <br /> Thể tích<br /> cho uống<br /> <br /> Số chuột<br /> sống/chết<br /> sau 72 giờ<br /> <br /> Lô 1<br /> <br /> 08<br /> <br /> 72,0<br /> <br /> 0,2 ml x<br /> 3 lần<br /> <br /> 8/0<br /> <br /> Lô 2<br /> <br /> 08<br /> <br /> 108,0<br /> <br /> 0,2 ml x<br /> 3 lần<br /> <br /> 8/0<br /> <br /> Lô 3<br /> <br /> 08<br /> <br /> 129,6<br /> <br /> 0,2 ml x<br /> 3 lần<br /> <br /> 8/0<br /> <br /> Lô 4<br /> <br /> 08<br /> <br /> 162,0<br /> <br /> 0,2 ml x<br /> 3 lần<br /> <br /> 8/0<br /> <br /> Lô 5<br /> <br /> 08<br /> <br /> 216,0<br /> <br /> 0,2 ml x<br /> 3 lần<br /> <br /> 8/0<br /> <br /> 9<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2017<br /> Chuột nhắt trắng được uống thuốc thử<br /> với mức liều khác nhau từ liều thấp nhất<br /> 72,0 g dược liệu/kg thể trọng đến liều cao<br /> nhất 216,0 g dược liệu/kg thể trọng, 0,2<br /> ml/10 g, 3 lần trong 24 giờ. Chuột uống<br /> đến liều tối đa 216,0 g dược liệu/kg thể<br /> trọng có thể dùng bằng đường uống để<br /> đánh giá độc tính cấp của thuốc thử,<br /> nhưng không có chuột nào chết, không<br /> xuất hiện triệu chứng bất thường trong 72<br /> giờ sau uống thuốc lần cuối và trong suốt<br /> 7 ngày sau uống thuốc.<br /> Kết luận: chưa tìm thấy LD50 của dịch<br /> chiết bài thuốc “Hạ áp-01” theo đường<br /> uống trên chuột nhắt trắng. Với mức liều<br /> cao nhất có thể cho chuột uống trong 24<br /> giờ là 216,0 g dược liệu/kg thể trọng<br /> không xuất hiện độc tính cấp.<br /> <br /> 2. Kết quả nghiên cứu độc tính bán<br /> trường diễn.<br /> * Ảnh hưởng của dịch chiết bài thuốc<br /> “Hạ áp-01” lên tình trạng chung và sự<br /> thay đổi thể trọng của chuột cống trắng<br /> khi dùng dài ngày:<br /> - Tình trạng chung:<br /> Theo dõi chuột cống trắng hàng ngày<br /> về tình trạng chung gồm hoạt động, ăn<br /> uống, tình trạng lông, da, niêm mạc, chất<br /> tiết. Chuột ở cả lô chứng và lô dùng bài<br /> thuốc “Hạ áp-01” đều hoạt động bình<br /> thường. Lông mượt, da niêm mạc bình<br /> thường, ăn uống bình thường, phân thành<br /> khuôn.<br /> - Sự thay đổi thể trọng và điện tim của<br /> chuột:<br /> <br /> Bảng 2: Ảnh hưởng của bài thuốc “Hạ áp-01” đối với thể trọng và điện tim chuột.<br /> Thời điểm thí nghiệm<br /> <br /> Lô chứng (1)<br /> <br /> Lô trị 1 (2)<br /> <br /> Lô trị 2 (3)<br /> <br /> p so sánh các lô<br /> <br /> Thể trọng (g)<br /> Trước thí nghiệm (a)<br /> <br /> 168,50 ± 4,47<br /> <br /> 169,75 ± 5,52<br /> <br /> 168,13 ± 3,56<br /> <br /> p2-1 > 0,05<br /> <br /> Sau 30 ngày (b)<br /> <br /> 203,75 ± 8,26<br /> <br /> 204,13 ± 5,69<br /> <br /> 205,00 ± 4,38<br /> <br /> p3-2 > 0,05<br /> <br /> Sau 60 ngày (c)<br /> <br /> 226,38 ± 6,12<br /> <br /> 225,13 ± 4,64<br /> <br /> 224,63 ± 6,16<br /> <br /> p3-1 > 0,05<br /> <br /> p so sánh các thời điểm<br /> <br /> pb-a < 0,01; pc-a < 0,01; pc-b < 0,01<br /> <br /> -<br /> <br /> Tần số tim (chu kỳ/phút, X ± SD)<br /> Trước thí nghiệm (a)<br /> <br /> 488,25 ± 14,90<br /> <br /> 484,25 ± 11,47<br /> <br /> 486,13 ± 13,16<br /> <br /> p2-1 > 0,05<br /> <br /> Sau 30 ngày (b)<br /> <br /> 488,63 ± 17,74<br /> <br /> 487,00 ± 12,34<br /> <br /> 485,88 ± 11,86<br /> <br /> p3-2 > 0,05<br /> <br /> Sau 60 ngày (c)<br /> <br /> 486,75 ± 19.47<br /> <br /> 489,25 ± 14,78<br /> <br /> 488,00 ± 15,88<br /> <br /> p3-1 > 0,05<br /> <br /> p so sánh các thời điểm<br /> <br /> pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05<br /> <br /> -<br /> <br /> Biên độ (mV, X ± SD)<br /> Trước thí nghiệm (a)<br /> <br /> 0,315 ± 0,025<br /> <br /> 0,315 ± 0,055<br /> <br /> 0.316 ± 0,038<br /> <br /> p2-1 > 0,05<br /> <br /> Sau 30 ngày (b)<br /> <br /> 0,315 ± 0,031<br /> <br /> 0,316 ± 0,041<br /> <br /> 0,318 ± 0,026<br /> <br /> p3-2 > 0,05<br /> <br /> Sau 60 ngày (c)<br /> <br /> 0,316 ± 0,040<br /> <br /> 0,316 ± 0,045<br /> <br /> 0,316 ± 0,036<br /> <br /> p3-1 > 0,05<br /> <br /> p so sánh các thời điểm<br /> Sóng bất thường<br /> <br /> 10<br /> <br /> pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05<br /> Không<br /> <br /> Không<br /> <br /> Không<br /> <br /> -<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 2-2017<br /> So sánh giữa các thời điểm sau so với trước thấy thể trọng chuột của cả 3 lô nghiên<br /> cứu đều tăng, thay đổi có ý nghĩa thống kê (p < 0,01). So với lô chứng sinh lý, tại tất cả<br /> các thời điểm đo, thể trọng của chuột ở hai lô uống dịch chiết bài thuốc “Hạ áp-01”<br /> không có khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Dịch chiết bài thuốc “Hạ áp-01” với<br /> các mức liều và thời gian sử dụng trong nghiên cứu chưa thấy gây thay đổi đến phát<br /> triển thể trọng của chuột.<br /> So sánh các lô với nhau trong cùng một thời điểm và so sánh trong từng lô giữa các<br /> thời điểm thí nghiệm, tần số và biên độ của điện tim chuột không thay đổi có ý nghĩa<br /> thống kê (p > 0,05). Không có sóng bất thường trên điện tim chuột tại các thời điểm<br /> nghiên cứu. Như vậy, dịch chiết bài thuốc “Hạ áp-01” với các mức liều và thời gian sử<br /> dụng chưa thấy gây thay đổi trên điện tim chuột.<br /> * Ảnh hưởng của dịch chiết bài thuốc “Hạ áp-01” đối với một số chỉ tiêu huyết học<br /> của chuột:<br /> Bảng 3:<br /> Thời điểm thí nghiệm<br /> <br /> Lô chứng (1)<br /> <br /> Lô trị 1 (2)<br /> <br /> Lô trị 2 (3)<br /> <br /> p so sánh các lô<br /> <br /> 12<br /> <br /> Số lượng hồng cầu chuột (x10 g/l)<br /> Trước thí nghiệm (a)<br /> <br /> 7,39 ± 1,07<br /> <br /> 7,20 ± 0,77<br /> <br /> 7,32 ± 0,64<br /> <br /> p2-1 > 0,05<br /> <br /> Sau 30 ngày (b)<br /> <br /> 7,10 ± 0,48<br /> <br /> 7,13 ± 0,45<br /> <br /> 7,06 ± 0,68<br /> <br /> p3-2 > 0,05<br /> <br /> Sau 60 ngày (c)<br /> <br /> 7,26 ± 0,97<br /> <br /> 7,10 ± 0,61<br /> <br /> 7,19 ± 0,040<br /> <br /> p3-1 > 0,05<br /> <br /> p so sánh các thời điểm<br /> <br /> pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05<br /> <br /> -<br /> <br /> Hàm lượng huyết sắc tố trong máu chuột (g/dl)<br /> Trước thí nghiệm (a)<br /> <br /> 13,58 ± 2,32<br /> <br /> 12,85 ± 1,43<br /> <br /> 13,65 ± 0,82<br /> <br /> p2-1 > 0,05<br /> <br /> Sau 30 ngày (b)<br /> <br /> 12,89 ± 1,19<br /> <br /> 12,94 ± 0,87<br /> <br /> 12,83 ± 0,75<br /> <br /> p3-2 > 0,05<br /> <br /> Sau 60 ngày (c)<br /> <br /> 12,98 ± 1,44<br /> <br /> 12,94 ± 1,16<br /> <br /> 12,89 ± 0,77<br /> <br /> p3-1 > 0,05<br /> <br /> p so sánh các thời điểm<br /> <br /> pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05<br /> <br /> -<br /> <br /> Hematocrit (%)<br /> Trước thí nghiệm (a)<br /> <br /> 35,09 ± 6,54<br /> <br /> 32,35 ± 2,92<br /> <br /> 33,71 ± 1,81<br /> <br /> p2-1 > 0,05<br /> <br /> Sau 30 ngày (b)<br /> <br /> 32,41 ± 3,65<br /> <br /> 32,78 ± 2,35<br /> <br /> 31,05 ± 2,92<br /> <br /> p3-2 > 0,05<br /> <br /> Sau 60 ngày (c)<br /> <br /> 33,94 ± 2,97<br /> <br /> 33,75 ± 3,46<br /> <br /> 32,30 ± 0,99<br /> <br /> p3-1 > 0,05<br /> <br /> p so sánh các thời điểm<br /> <br /> pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05<br /> <br /> -<br /> <br /> Thể tích trung bình hồng cầu (fl)<br /> Trước thí nghiệm (a)<br /> <br /> 47,29 ± 2,44<br /> <br /> 44,56 ± 2,11<br /> <br /> 46,20 ± 2,77<br /> <br /> p2-1 > 0,05<br /> <br /> Sau 30 ngày (b)<br /> <br /> 45,56 ± 3,34<br /> <br /> 45,96 ± 2,23<br /> <br /> 47,93 ± 3,40<br /> <br /> p3-2 > 0,05<br /> <br /> Sau 60 ngày (c)<br /> <br /> 46,99 ± 3,10<br /> <br /> 47,48 ± 1,52<br /> <br /> 44,98 ± 1,89<br /> <br /> p3-1 > 0,05<br /> <br /> p so sánh các thời điểm<br /> <br /> pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05<br /> <br /> -<br /> <br /> 11<br /> <br />