Nghiên cứu độc tính cấp và bán trường diễn của bài thuốc TB15 trên động vật thực nghiệm

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2017<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ BÁN TRƯỜNG DIỄN CỦA<br /> BÀI THUỐC TB15 TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM<br /> Hà Thị Nga*; Nguyễn Hoàng Ngân**; Trần Quốc Bảo***<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: nghiên cứu tính an toàn của bài thuốc TB15 trên thực nghiệm. Đối tượng và<br /> phương pháp: xác định độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng dòng Swiss theo<br /> phương pháp Litchfield - Wilcoxon và xác định độc tính bán trường diễn trên chuột cống trắng<br /> dòng Wistar theo quy định của Bộ Y tế Việt Nam. Kết quả: chưa tìm thấy LD50 của bài thuốc<br /> TB15 theo đường uống trên chuột nhắt trắng với mức liều cao nhất có thể cho chuột uống trong<br /> 24 giờ là 228,0 g/kg thể trọng. Với liều 23,2 g/kg/24 giờ và liều 69,6 g/kg/24 giờ cho chuột cống<br /> trắng uống liên tục trong 60 ngày, thuốc không ảnh hưởng lên trọng lượng cơ thể và điện tim<br /> của chuột; không gây thay đổi có ý nghĩa thống kê các chỉ số huyết học, sinh hóa; không gây<br /> biến đổi mô bệnh học gan, lách, thận của chuột nghiên cứu. Kết luận: bài thuốc TB15 không<br /> gây độc tính cấp và độc tính bán trường diễn trên động vật thực nghiệm.<br /> * Từ khóa: Bài thuốc TB15; Độc tính cấp; Độc tính bán trường diễn; Động vật thực nghiệm.<br /> <br /> Studying the Acute Toxicity and Semi-Chronic Toxicity of Herbal<br /> Medicines TB15 on Experimental Animals<br /> Summary<br /> Objectives: To study the safety of herbal medicines TB15 on experimental animal. Subjects<br /> and methods: The oral acute toxicity was evaluated on Swiss mice by the Litchfield - Wilcoxon’s<br /> method and the semi-chronic toxicity was evaluated on Wistar rats according to Vietnam Health<br /> Ministry’s regulation. Results: With the highest dose that mice could drink in 24 hours (228.0<br /> g/kg bw), LD50 of TB15 was not identified. With the dose of 23.2 g/kg and 69.6 g/kg per day for<br /> 60 consecutive days, TB15 did not affect body weight and ECG of rats; did not cause any<br /> statistically significant changes in hematological and biochemical indexes; did not cause any<br /> changes in histology of liver, spleen, kidney of experimental rats. Conclusion: Herbal medicines<br /> TB15 did not cause acute toxicity and semi-chronic toxicity on experimental animals.<br /> * Key words: Herbal medicine TB15; Acute toxicity; Semi-chronic toxicity; Experimental animal.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Rối loạn lipid máu có xu hướng ngày<br /> càng tăng. Rối loạn lipid máu làm tăng<br /> nguy cơ bệnh lý tim mạch, suy giảm chức<br /> năng của nhiều cơ quan (gan, thận, sinh<br /> <br /> dục...). Sử dụng kéo dài thuốc tân dược<br /> điều trị rối loạn lipid máu thường có nhiều<br /> tác dụng phụ [6]. Y học cổ truyền có nhiều<br /> vị thuốc, bài thuốc hay điều trị rối loạn<br /> lipid máu có hiệu quả và tính an toàn cao.<br /> <br /> * Viện Y học Cổ truyền TP. Hồ Chí Minh<br /> ** Học viện Quân y<br /> *** Bệnh viện Quân y 103<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Hoàng Ngân (nguyenhoangngan@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 05/12/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 15/02/2017<br /> Ngày bài báo được đăng: 01/03/2017<br /> <br /> 24<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2017<br /> Bài thuốc TB15 gồm 8 vị thuốc đông<br /> dược, được phát triển và dùng điều trị hạ<br /> lipid máu cho bệnh nhân tại Viện Y Dược<br /> học Dân tộc Thành phố Hồ Chí Minh<br /> trong nhiều năm qua. Các vị thuốc trong<br /> bài thuốc TB15 với liều lượng có tính an<br /> toàn cao [3]. Đây là một bài thuốc nghiệm<br /> phương nên theo quy định của Bộ Y tế<br /> cần đánh giá về độc tính cấp, độc tính<br /> bán trường tiền lâm sàng trước khi ứng<br /> dụng rộng rãi trong điều trị cũng như đưa<br /> vào các dạng bào chế hiện đại hóa y<br /> dược học cổ truyền [1]. Vì vậy, chúng tôi<br /> tiến hành nghiên cứu này nhằm: Đánh giá<br /> kết quả nghiên cứu độc tính cấp và độc<br /> tính bán trường diễn của dịch chiết bài<br /> thuốc TB15 trên động vật thực nghiệm.<br /> ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG<br /> PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu.<br /> * Thuốc nghiên cứu: bài thuốc TB15.<br /> Công thức bài thuốc TB15: Trạch tả<br /> (Alisma plantago Aqualica L) 30 g, Đại<br /> hoàng (Rheum palmatum L.) 08 g, Sơn tra<br /> (Crataeguscuneara Sied.et Zucc) 12 g,<br /> Bạch truật (Atractylodes macrocephala)<br /> 20 g, Phá cố chỉ (Psoralea Corylifolia L)<br /> 10 g, Đan sâm (Radix Salviae multiorrhizae)<br /> 30 g, Chỉ xác (Fructus citri Aurantii) 20 g,<br /> Qua lâu nhân (Semen Trichosanthis) 15 g.<br /> - Nơi sản xuất: Khoa Dược, Viện Y<br /> Dược học Dân tộc Thành phố Hồ Chí Minh,<br /> ở dạng dịch chiết theo tỷ lệ 1:1 (1 ml<br /> cao chứa 1 g dược liệu), đạt tiêu chuẩn<br /> cơ sở.<br /> - Thuốc dùng trong nghiên cứu thực<br /> nghiệm: thuốc TB15 dạng dịch chiết được<br /> <br /> cô quay chân không đến độ đậm đặc nhất<br /> có thể cho chuột uống bằng kim đầu tù<br /> chuyên dụng. Cao đặc này cùng các dung<br /> dịch thuốc pha loãng ở nồng độ khác<br /> nhau, dùng cho chuột uống đánh giá độc<br /> tính cấp và độc tính bán trường diễn trên<br /> động vật thực nghiệm.<br /> * Động vật được sử dụng trong nghiên<br /> cứu:<br /> Chuột nhắt trắng dòng Swiss, 40 con,<br /> cân nặng 18 - 22 g. Chuột cống trắng<br /> dòng Wistar, 24 con, cân nặng 160 - 180 g.<br /> Động vật do Ban cung cấp Động vật thí<br /> nghiệm, Học viện Quân y cung cấp, được<br /> nuôi trong phòng nuôi động vật thí<br /> nghiệm 1 tuần trước khi nghiên cứu bằng<br /> thức ăn chuẩn dành cho động vật nghiên<br /> cứu, nước sạch uống tự do.<br /> * Dụng cụ máy móc:<br /> Máy xét nghiệm sinh hoá Evolution<br /> 3000 (Italia) sử dụng hóa chất của hãng;<br /> máy xét nghiệm huyết học Humacount<br /> 30TS (Đức) sử dụng kít xét nghiệm của<br /> hãng và phần mềm xét nghiệm cho chuột;<br /> máy điện tim Fukuda FX 7102 (Fukuda,<br /> Nhật Bản); cân phân tích 10-4, model<br /> CP224S (Sartorius, Đức).<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> * Nghiên cứu độc tính cấp:<br /> Nghiên cứu độc tính cấp của thuốc thử<br /> trên chuột nhắt trắng bằng đường uống<br /> theo phương pháp Litchfield - Wilcoxon<br /> [2], hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới<br /> [7] và thông tư hướng dẫn về thử thuốc<br /> trên lâm sàng của Bộ Y tế [1].<br /> Trước khi tiến hành thí nghiệm, cho<br /> chuột nhịn ăn 16 giờ, nước uống tự do.<br /> Sau 16 giờ, chia ngẫu nhiên chuột thành<br /> 5 lô, mỗi lô 8 con. Các lô thử được cho<br /> uống thuốc với thể tích 0,2 ml/10 g/lần,<br /> 25<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2017<br /> 3 lần/24 giờ, mỗi lần cách nhau 3 giờ.<br /> Mức liều cho uống ở mỗi lô tăng dần:<br /> 76,0 g/kg; 91,2 g/kg; 114,0 g/kg; 152,0<br /> g/kg; 228,0 g/kg thể trọng.<br /> Theo dõi tình trạng chung của chuột và<br /> số lượng chuột chết ở mỗi lô trong vòng<br /> 72 giờ sau khi cho chuột uống thuốc lần<br /> cuối. Tìm liều cao nhất không gây chết<br /> chuột (0%), liều thấp nhất gây chết chuột<br /> hoàn toàn (100%) và liều trung gian. Từ<br /> đó xây dựng đồ thị tuyến tính để xác định<br /> LD50 của thuốc thử (nếu có). Sau đó, tiếp<br /> tục theo dõi tình trạng chung của chuột<br /> (hoạt động, ăn uống, bài tiết…) ở mỗi lô<br /> cho đến hết 7 ngày sau khi uống thuốc.<br /> <br /> hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch<br /> cầu, công thức bạch cầu và số lượng tiểu<br /> cầu); sinh hóa đánh giá chức năng gan<br /> (ALT, AST, bilirubin toàn phần, albumin<br /> và cholesterol toàn phần) và chức năng<br /> thận (nồng độ creatinin huyết thanh) [4, 5].<br /> Sau 60 ngày uống thuốc, mổ chuột để<br /> quan sát đại thể toàn bộ các cơ quan.<br /> Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan,<br /> lách, thận của ít nhất 30% số chuột ở mỗi<br /> lô. Các xét nghiệm vi thể được thực hiện<br /> tại Bộ môn Khoa Giải phẫu bệnh - Pháp y,<br /> Bệnh viện Quân y 103.<br /> <br /> Tiến hành phẫu tích, quan sát tình<br /> trạng các tạng ngay sau khi có chuột chết<br /> (nếu có) để xác định nguyên nhân gây độc.<br /> <br /> * Xử lý số liệu: theo phương pháp<br /> thống kê y sinh học, so sánh bằng Anova<br /> test, sử dụng phần mềm SPSS 16.0.<br /> Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi<br /> p < 0,05.<br /> <br /> * Nghiên cứu độc tính bán trường diễn<br /> trên thực nghiệm:<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> <br /> Theo quy định của Bộ Y tế Việt Nam<br /> [1], hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới<br /> [7] về đánh giá tính an toàn và hiệu lực<br /> của thuốc y học cổ truyền.<br /> Chuột cống trắng 24 con, chia ngẫu<br /> nhiên thành 3 lô, mỗi lô 8 con.<br /> - Lô chứng: uống nước.<br /> - Lô trị 1: uống TB15 liều 23,2 g dược<br /> liệu/kg/ngày (tương đương liều trên người).<br /> - Lô trị 2: uống TB15 liều 69,6 g dược<br /> liệu/kg/ngày (gấp 3 lần liều trên người).<br /> Cho chuột uống hàng ngày, trong 60<br /> ngày bằng kim đầu tù chuyên dụng.<br /> Theo dõi các chỉ tiêu trước lúc uống<br /> thuốc, sau 30 và 60 ngày uống thuốc,<br /> gồm: tình trạng chung, thể trọng của<br /> chuột; điện tim của chuột ghi ở đạo trình<br /> DII; huyết học (số lượng hồng cầu, thể<br /> tích trung bình hồng cầu, hàm lượng<br /> 26<br /> <br /> 1. Kết quả nghiên cứu độc tính cấp.<br /> Sau 3 lần uống thuốc với lượng lớn,<br /> chuột có biểu hiện mệt mỏi nhẹ, giảm vận<br /> động và ăn uống, nhưng sau đó vài giờ<br /> chuột trở lại hoạt động, vận động và ăn<br /> uống bình thường; đồng tử mắt chuột<br /> bình thường; không có biểu hiện của khó<br /> thở hay tím tái; chuột đi ngoài phân<br /> khuôn, một số chuột có đi ngoài phân nát,<br /> nhưng sau đó nhanh chóng trở lại bình<br /> thường.<br /> Chuột nhắt trắng được uống thuốc thử<br /> với mức liều khác nhau, từ liều thấp nhất<br /> 76,0 g dược liệu/kg thể trọng đến liều cao<br /> nhất 228,0 g dược liệu/kg thể trọng,<br /> 0,2 ml/10 g, 3 lần trong 24 giờ. Chuột đã<br /> uống đến liều 228,0 g dược liệu/kg thể<br /> trọng là liều tối đa có thể dùng được bằng<br /> đường uống để đánh giá độc tính cấp của<br /> thuốc thử, nhưng không có chuột nào chết.<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2017<br /> Bảng 1: Kết quả đánh giá số chuột chết ở mỗi lô trong vòng 72 giờ sau uống TB15.<br /> Lô<br /> chuột<br /> <br /> Số chuột<br /> thí nghiệm<br /> <br /> Liều sử dụng tính theo g dược liệu<br /> (g/kg trọng lượng cơ thể)<br /> <br /> Thể tích cho<br /> uống<br /> <br /> Số chuột sống/chết<br /> sau 72 giờ<br /> <br /> Lô 1<br /> <br /> 08<br /> <br /> 76,0<br /> <br /> 0,2 ml x 3 lần<br /> <br /> 8/0<br /> <br /> Lô 2<br /> <br /> 08<br /> <br /> 91,2<br /> <br /> 0,2 ml x 3 lần<br /> <br /> 8/0<br /> <br /> Lô 3<br /> <br /> 08<br /> <br /> 114,0<br /> <br /> 0,2 ml x 3 lần<br /> <br /> 8/0<br /> <br /> Lô 4<br /> <br /> 08<br /> <br /> 152,0<br /> <br /> 0,2 ml x 3 lần<br /> <br /> 8/0<br /> <br /> Lô 5<br /> <br /> 08<br /> <br /> 228,0<br /> <br /> 0,2 ml x 3 lần<br /> <br /> 8/0<br /> <br /> Tiếp tục theo dõi chuột trong 7 ngày<br /> sau uống thuốc, không thấy xuất hiện<br /> triệu chứng bất thường nào, không có<br /> chuột nào chết.<br /> Chưa tìm thấy LD50 của dịch chiết bài<br /> thuốc TB15 theo đường uống trên chuột<br /> nhắt trắng. Với mức liều cao nhất có thể<br /> cho chuột uống trong 24 giờ là 228,0 g<br /> dược liệu/kg thể trọng không xuất hiện<br /> độc tính cấp. Với dược liệu có liều chết<br /> LD50 gấp trên 10 lần điều trị được xem là<br /> có khoảng an toàn điều trị tốt [2]. Kết quả<br /> không tìm thấy LD50 cũng như không thấy<br /> biểu hiện của độc tính cấp khi cho chuột<br /> uống đến mức liều tối đa, cho thấy dịch<br /> <br /> chiết của bài thuốc TB15 có tính an toàn<br /> cao trong thử nghiệm đánh giá độc tính<br /> cấp trên chuột.<br /> 2. Kết quả nghiên cứu độc tính bán<br /> trường diễn.<br /> * Ảnh hưởng của TB15 lên tình trạng<br /> chung và thay đổi thể trọng của chuột<br /> cống trắng khi dùng dài ngày:<br /> - Tình trạng chung:<br /> Chuột ở lô chứng và lô dùng dịch chiết<br /> bài thuốc TB15 đều hoạt động bình<br /> thường, lông mượt, da niêm mạc và ăn<br /> uống bình thường, phân thành khuôn.<br /> - Thay đổi thể trọng và điện tim của chuột:<br /> <br /> Bảng 2: Ảnh hưởng của bài thuốc TB15 đối với thể trọng và điện tim chuột (đạo<br /> trình DII).<br /> Thời điểm xét nghiệm<br /> <br /> Lô chứng (1)<br /> <br /> Lô trị 1 (2)<br /> <br /> Lô trị 2 (3)<br /> <br /> pso sánh các lô<br /> <br /> Thể trọng (g)<br /> Trước thí nghiệm (a)<br /> <br /> 168,50 ± 4,47<br /> <br /> 167,25 ± 4,56<br /> <br /> 170,63 ± 4,17<br /> <br /> Sau 30 ngày (b)<br /> <br /> 203,75 ± 8,26<br /> <br /> 199,50 ± 3,12<br /> <br /> 198,63 ± 6,44<br /> <br /> Sau 60 ngày (c)<br /> <br /> 226,38 ± 6,12<br /> <br /> 220,38 ± 5,55<br /> <br /> 218,25 ± 5,42<br /> <br /> pso sánh các thời điểm<br /> <br /> pb-a < 0,01; pc-a< 0,01; pc-b< 0,01<br /> <br /> p > 0,05<br /> p3-1 < 0,05<br /> -<br /> <br /> Tần số tim (chu kỳ/phút, X ± SD)<br /> Trước thí nghiệm (a)<br /> <br /> 488,25 ± 14,90<br /> <br /> 484,13 ± 14,13<br /> <br /> 486,38 ± 15,82<br /> <br /> Sau 30 ngày (b)<br /> <br /> 488,63 ± 17,74<br /> <br /> 484,00 ± 13,10<br /> <br /> 483,13 ± 10,66<br /> <br /> Sau 60 ngày (c)<br /> <br /> 486,75 ± 19,47<br /> <br /> 485,13 ± 21,10<br /> <br /> 487,13 ± 14,44<br /> <br /> pso sánh các thời điểm<br /> <br /> pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05<br /> <br /> p2-1 > 0,05<br /> p3-2 > 0,05<br /> p3-1 > 0,05<br /> -<br /> <br /> 27<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2017<br /> Biên độ (mV, X ± SD)<br /> Trước thí nghiệm (a)<br /> <br /> 0,314 ± 0,027<br /> <br /> 0,314 ± 0,057<br /> <br /> 0,313 ± 0,031<br /> <br /> Sau 30 ngày (b)<br /> <br /> 0,313 ± 0,035<br /> <br /> 0,313 ± 0,044<br /> <br /> 0,314 ± 0,028<br /> <br /> Sau 60 ngày (c)<br /> <br /> 0,316 ± 0,040<br /> <br /> 0,314 ± 0,052<br /> <br /> 0,313 ± 0,038<br /> <br /> pso sánh các thời điểm<br /> Sóng bất thường<br /> <br /> p2-1 > 0,05<br /> p3-2 > 0,05<br /> p3-1 > 0,05<br /> <br /> pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05<br /> Không<br /> <br /> Không<br /> <br /> So sánh giữa thời điểm sau so với<br /> trước thấy thể trọng chuột của cả ba lô<br /> nghiên cứu đều tăng, thay đổi có ý nghĩa<br /> thống kê (p < 0,01). Thể trọng của chuột<br /> ở hai lô uống dịch chiết bài thuốc TB15 tại<br /> thời điểm sau 30 và 60 ngày giảm hơn so<br /> với ở lô chứng sinh lý; tuy nhiên chỉ ở lô<br /> dùng TB15 liều 2 tại thời điểm sau 60<br /> ngày, sự khác biệt mới có ý nghĩa thống<br /> kê (p < 0,05).<br /> So sánh các lô với nhau trong cùng<br /> một thời điểm và so sánh trong từng lô<br /> <br /> Không<br /> <br /> -<br /> <br /> giữa các thời điểm thí nghiệm, tần số và<br /> biên độ của điện tim chuột thay đổi không<br /> có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Không có<br /> sóng bất thường trên điện tim của các lô<br /> chuột tại thời điểm nghiên cứu.<br /> Dịch chiết bài thuốc TB15 với mức liều<br /> và thời gian sử dụng trong nghiên cứu<br /> chưa gây ra thay đổi trên điện tim chuột.<br /> * Ảnh hưởng của dịch chiết bài thuốc<br /> TB15 đối với một số chỉ tiêu huyết học<br /> của chuột:<br /> <br /> Bảng 3: Ảnh hưởng của dịch chiết bài thuốc TB15 lên một số chỉ tiêu huyết học của<br /> chuột (n = 8, X ± SD).<br /> Thời điểm xét nghiệm<br /> <br /> Lô chứng (1)<br /> <br /> Lô trị 1 (2)<br /> <br /> Lô trị 2 (3)<br /> <br /> pso sánh các lô<br /> <br /> 12<br /> <br /> Số lượng hồng cầu chuột (x10 g/l)<br /> Trước thí nghiệm (a)<br /> <br /> 7,39 ± 1,07<br /> <br /> 7,28 ± 0,72<br /> <br /> 7,36 ± 0,51<br /> <br /> p2-1 > 0,05<br /> <br /> Sau 30 ngày (b)<br /> <br /> 7,10 ± 0,48<br /> <br /> 7,13 ± 0,18<br /> <br /> 7,27 ± 0,52<br /> <br /> p3-2 > 0,05<br /> <br /> Sau 60 ngày (c)<br /> <br /> 7,26 ± 0,97<br /> <br /> 7,09 ± 0,90<br /> <br /> 7,10 ± 0,98<br /> <br /> p3-1 > 0,05<br /> <br /> pso sánh các thời điểm<br /> <br /> pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05<br /> <br /> -<br /> <br /> Hàm lượng huyết sắc tố trong máu chuột (g/dl)<br /> Trước thí nghiệm (a)<br /> <br /> 13,58 ± 2,32<br /> <br /> 13,24 ± 1,16<br /> <br /> 13,10 ± 1,21<br /> <br /> p2-1 > 0,05<br /> <br /> Sau 30 ngày (b)<br /> <br /> 12,89 ± 1,19<br /> <br /> 12,86 ± 0,54<br /> <br /> 13,19 ± 0,86<br /> <br /> p3-2 > 0,05<br /> <br /> Sau 60 ngày (c)<br /> <br /> 12,98 ± 1,44<br /> <br /> 12,81 ± 1,05<br /> <br /> 12,85 ± 1,51<br /> <br /> p3-1 > 0,05<br /> <br /> pso sánh các thời điểm<br /> <br /> pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05<br /> <br /> -<br /> <br /> Hematocrit (%)<br /> Trước thí nghiệm (a)<br /> <br /> 35,09 ± 6,54<br /> <br /> 32,86 ± 2,67<br /> <br /> 32,58 ± 2,42<br /> <br /> Sau 30 ngày (b)<br /> <br /> 32,41 ± 3,65<br /> <br /> 32,03 ± 1,56<br /> <br /> 33,11 ± 2,16<br /> <br /> 28<br /> <br /> p2-1 > 0,05<br /> p3-2 > 0,05<br /> <br />