Nghiên cứu độc tính và tác dụng an thần của cao bình vôi - lạc tiên - lá sen - lá vông nem trên chuột nhắt trắng

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG AN THẦN<br /> CỦA CAO BÌNH VÔI – LẠC TIÊN – LÁ SEN – LÁ VÔNG NEM<br /> TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG<br /> Nguyễn Văn Đàn*, Phan Quan Chí Hiếu*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Công thức thuốc có nguồn gốc từ bài thuốc điều trị mất ngủ do GS. Bùi Chí Hiếu đề xướng,<br /> gồm 4 vị Bình vôi, Lạc tiên, Lá sen, Lá vông nem. Công thức trên cần phải được khẳng định tính an toàn cũng<br /> như các tác dụng dược lý bằng các mô hình dược lý thực nghiệm.<br /> Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát độc tính và tác dụng an thần của cao chiết nước Bình vôi-Lạc tiên-Lá sen-Lá<br /> vông nem.<br /> Phương pháp nghiên cứu: Trong nghiên cứu này, các tác dụng an thần và độc tính của cao chiết nước Bình<br /> vôi-Lạc tiên-Lá sen-Lá vông nem được đánh giá với các mô hình thử nghiệm trên thú vật. Tác động an thần được<br /> đánh giá bằng cách đo lường việc kéo dài thời gian ngủ mê của chuột gây ra bởi thiopental và tác dụng giải lo âu<br /> đánh giá bằng mô hình hai ngăn sáng tối.<br /> Kết quả: Cao chiết liều 1,97 g/kg không có tác dụng kéo dài thời gian gây ngủ của thiopental sau 30 phút sử<br /> dụng, chỉ thể hiện sau 60 phút sử dụng. Trong khi liều 3,94 g/kg khẳng định tác dụng sau 30 và 60 phút sử dụng.<br /> Sau 60 phút, cao chiết liều 3,94 g/kg hiệu quả gây ngủ tăng hơn gấp 1,9 lần so với Sen vông-R liều 40 mg/kg. Cả<br /> hai liều không thể hiện tác dụng giải lo âu tại thời điểm 30 và 60 phút sử dụng. Chưa xác định được LD50 và độc<br /> tính bán trường diễn trên chuột nhắt trắng theo đường uống.<br /> Kết luận: Cao chiết nước Bình vôi-Lạc tiên-Lá sen-Lá vông nem có tác dụng hợp đồng gây ngủ với<br /> thiopental.<br /> Từ khóa: Bình vôi, Lạc tiên, Lá sen, Lá vông nem, an thần, giải lo âu, mất ngủ.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> RESEARCH ON THE TOXICITY AND SEDATIVE-HYPNOTIC EFFECTS<br /> OF TUBER STEPHANIAE - HERBA PASSIFLORAE FOETIDAE - FOLIUM ERYTHRINAE FOLIUM NELUMBINIS EXTRACT ON MICE<br /> Nguyen Van Dan, Phan Quan Chi Hieu<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 – 2014: 130 - 135<br /> Background: Formulation proposed by Ph.D. Hieu Bui Chi, including Tuber Stephaniae- Herba Passiflorae<br /> foetidae - Folium Erythrinae - Folium Nelumbinis for the treatment of insomnia. It is necessary to evaluate<br /> pharmacological activities and toxicity of this formula in animal models.<br /> Aims of study: Evaluate the hypnotic-anxiolytic effects and toxcity of Tuber Stephaniae- Herba Passiflorae<br /> foetidae - Folium Erythrinae - Folium Nelumbinis extract on mice.<br /> Materials and Method: In this present study, the anxiolytic-hypnotic effects of extract were evaluated in<br /> animal models when administered oral route. The light-dark test were used to evaluate the anxiolytic effect. The<br /> hypnotic effect was evaluated by measuring potentiation of thiopental sleeping time in mice.<br /> <br /> * Khoa Y học cổ truyền, Đại học Y dược TP. Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: Ths.BS Nguyễn Văn Đàn<br /> ĐT: 0983731326<br /> <br /> 130<br /> <br /> Email:vandan2685@gmail.com<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Results: Extract given orally at the dose of 1.97 g/kg prolonged the thiopental induced sleep time after 60<br /> minutes and the dose of 3.94 g/kg prolonged the thiopental induced sleep time after 30 minutes and 60 minutes,<br /> both of them did not shown to have anxiolytic activities. After 60 minutes, extracts at dose of 3.94 g/kg of hypnotic<br /> effect more than 1.9 times the Sen vong-R at the dose of 40 mg/kg. LD50 and chronic toxicity has not been<br /> determined by orally.<br /> Conclusion: Tuber Stephaniae- Herba Passiflorae foetidae - Folium Erythrinae - Folium Nelumbinis extract<br /> were found to have the hypnotic activity.<br /> Keywords: Tuber Stephaniae, Herba Passiflorae foetidae, Folium Erythrinae, Folium Nelumbinis,<br /> anxiolytic effect, hypnotic effect, insomnia.<br /> màu sắc và Rf tương tự với mẫu đối chiếu Bình<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> vôi, Lạc tiên, Lá sen, Lá vông nem.<br /> Hiện nay, chứng mất ngủ ngày càng phổ<br /> Hóa chất – Thuốc thử nghiệm - Dụng cụ<br /> biến với nhiều yếu tố nguy cơ và nguyên nhân.<br /> Diazepam (Valium) liều 5mg/Kg (PO) là<br /> Tác động tích lũy lâu dài của mất ngủ liên quan<br /> thuốc<br /> đối chiếu trong mô hình hai ngăn sáng tối.<br /> với nhiều hậu quả sức khỏe nguy hiểm và tác<br /> Thiopental liều 40mg/Kg (IV) là thuốc dùng<br /> động kinh tế quan trọng. Tuy có nhiều phương<br /> trong mô hình kéo dài thời gian ngủ. Sen vông-R<br /> pháp điều trị khác nhau như: vệ sinh giấc ngủ,<br /> (cao lá Sen, lá Vông nem, Rotundin), sản phẩm<br /> dùng thuốc, nhưng đơn trị liệu thường kém hiệu<br /> của Công ty cổ phần dược phẩm trung ương 2, là<br /> quả, thời gian điều trị và theo dõi dài, tỉ lệ tái<br /> thuốc so sánh trong mô hình hai ngăn sáng tối<br /> phát cao. Việc điều trị với các nhóm thuốc an<br /> và mô hình kéo dài thời gian ngủ.<br /> thần, chủ yếu là nhóm bezodiazepin gây nhiều<br /> tác dụng phụ. Do vậy, việc tìm kiếm các phương<br /> pháp điều trị hiệu quả, ít hoặc không gây tác<br /> dụng phụ, giảm chi phí y tế là rất cần thiết. Từ<br /> bài thuốc điều trị mất ngủ do GS. Bùi Chí Hiếu<br /> đề xướng, gồm Bình vôi, Lạc tiên, Lá sen, Lá<br /> vông nem(1), là những vị thuốc có tác dụng an<br /> thần theo kinh nghiệm dân gian, tuy nhiên công<br /> thức trên chưa đánh giá bằng các nghiên cứu, vì<br /> vậy mục tiêu nghiên cứu này nhằm khảo sát tính<br /> an toàn và hiệu quả an thần của công thức trên<br /> thực nghiệm, đó sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu<br /> lâm sàng tiếp theo.<br /> <br /> PHƯƠNG TIỆN- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN<br /> CỨU<br /> Nguyên liệu<br /> Cao chiết nước hỗn hợp Bình vôi-Lạc tiên-Lá<br /> sen-Lá vông nem (1,5-1-1-1), ký hiệu CAT. Hiệu<br /> suất chiết 11,59 %, độ ẩm 16,72 % ± 0,02, độ tro<br /> toàn phần 1,3 % ± 0,15, độ tro không tan trong<br /> acid hydrochloric 0, 14% ± 0,01, định tính bằng<br /> phương pháp sắc ký lớp mỏng cho các vết có<br /> <br /> Xét nghiệm công thức máu: Máy huyết học<br /> hoàn toàn Sysmex KX-21, Nhật.<br /> Xét nghiệm Glucose, Urea, Creatinin, AST,<br /> ALT máu: Máy sinh hóa Eos Bravo W (Hospitex<br /> diagonosis – Italy).<br /> Giải phẫu mô học gan, thận được thực hiện<br /> tại Khoa Giải phẫu bệnh -Bệnh viện Chợ Rẫy –<br /> Thành phố Hồ Chí Minh.<br /> <br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> Chuột nhắt trắng đực chủng Swiss albino,<br /> khỏe mạnh, 6 - 8 tuần tuổi, trọng lượng trung<br /> bình 25 - 32g, cung cấp bởi Viện Pasteur TP. Hồ<br /> Chí Minh. Chuột được nuôi trong điều kiện ổn<br /> định về dinh dưỡng và đảm bảo chu kỳ 12/12 giờ<br /> sáng tối. Chuột được làm quen với điều kiện<br /> phòng thí nghiệm ít nhất 24 giờ. Kích thích âm<br /> thanh, mùi ở phòng thí nghiệm được hạn chế ở<br /> mức thấp nhất. Tất cả các thử nghiệm được tiến<br /> hành từ 9:00 đến 16:00, ở điều kiện ổn định về<br /> nhiệt độ và độ ẩm.<br /> <br /> Phương pháp khảo sát độc tính cấp (4)<br /> Thử nghiệm thực hiện qua 2 giai đoạn:<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> 131<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014<br /> <br /> Giai đoạn thăm dò (mỗi lô dò liều 6 chuột):<br /> Khởi đầu từ liều cao nhất có thể bơm được qua<br /> kim đầu tù cho uống. Xác định liều LD0 (liều tối<br /> đa không gây chết) và liều LD100 (liều tối thiểu<br /> gây chết 100%).<br /> Giai đoạn xác định: chuột được chia lô và<br /> cho sử dụng thuốc ở các liều trong khoảng LD0<br /> và LD100 chia theo cấp số nhân.<br /> Theo dõi các biểu hiện về hành vi và vận<br /> động của chuột trong vòng 72 giờ sau khi<br /> dùng thuốc. Ghi nhận số chuột chết trong<br /> từng lô. Xác định LD50 (nếu có) theo phương<br /> pháp Karber-Behrens.<br /> <br /> Phương pháp khảo sát độc tính bán<br /> trường diễn (2)<br /> Chuột thử nghiệm được chia ngẫu nhiên<br /> thành 2 lô:<br /> - Lô chứng (n=10): Được cho uống nước cất<br /> hàng ngày trong 60 ngày.<br /> - Lô thử (n=10): Uống cao CAT với liều 3,94 g<br /> cao khô/kg chuột (tương đương 16,42 g cao<br /> khô/kg người) trong 60 ngày.<br /> Thể tích cho chuột uống là 0,2ml/10g thể<br /> trọng.<br /> Cuối thử nghiệm, ghi nhận và so sánh các chỉ<br /> số: số lượng hồng cầu (triệu/mm3), số lượng bạch<br /> cầu (ngàn/mm3), tiểu cầu (ngàn/mm3),<br /> hemoglobin (g/L), hematocrit (%), AST(U/L),<br /> ALT(U/L), creatinin (mg/dL), glucose máu<br /> (mg/dL), vi thể gan và thận.<br /> <br /> Thử nghiệm tác dụng gây ngủ (5, 7)<br /> Sau 30 hoặc 60 phút dùng thuốc thử hay chất<br /> chứng, tiêm tĩnh mạch thiopental 30 mg/kg<br /> chuột. Thời gian chuột ngủ mê được tính từ<br /> lúc chuột mất phản xạ thăng bằng cho đến khi<br /> chuột có lại phản xạ thăng bằng. Chuột được<br /> chia ngẫu nhiên thành 7 lô như sau:<br /> - Lô 1 (n=10): Lô chứng uống nước cất.<br /> - Lô 2 (n=10): Uống Sen vông-R liều 40 mg/kg<br /> (tính theo cao khô lá sen) (dựa theo nhóm tác giả<br /> Nguyễn Lan Thùy Ty, Võ Phùng Nguyên,<br /> Nguyễn Hữu Đức (2008)).<br /> <br /> 132<br /> <br /> - Lô 3 (n=10): Uống cao CAT với liều 1,97 g<br /> cao khô/kg chuột (tương đương 8,21 g cao khô/<br /> người 50 kg).<br /> - Lô 4 (n=10): Uống cao CAT với liều 3,94 g<br /> cao khô/kg chuột (tương đương 16,42 g cao khô/<br /> người 50 kg).<br /> - Lô 5 (n=10): Uống thuốc Sen vông-R liều 40<br /> mg/kg (tính theo cao khô lá sen).<br /> - Lô 6 (n=10): Uống cao CAT với liều 1,97 g<br /> cao khô/kg chuột (tương đương 8,21 g cao khô/<br /> người 50 kg).<br /> - Lô 7 (n=10): Uống cao CAT với liều 3,94 g<br /> cao khô/kg chuột (tương đương 16,42 g cao khô/<br /> người 50 kg).<br /> Chuột được cho uống 30 phút trước thử<br /> nghiệm đối với lô 1, 2, 3, 4. Đối với lô 5,6, 7 chuột<br /> được cho uống 60 phút trước thử nghiệm. Thể<br /> tích uống là 0,2 ml/10 g chuột. Sau đó tiêm<br /> thiopental đường tĩnh mạch đuôi chuột.<br /> <br /> Thử nghiệm giải lo âu với mô hình hai<br /> ngăn sáng tối (5, 7)<br /> Thiết bị thử nghiệm Panlab Black and White<br /> box–Tây Ban Nha gồm hộp nhựa Perspex được<br /> chia thành hai ngăn: sáng (250 x 250 x 240 mm,<br /> lắp bóng đèn trắng 100W) và ngăn tối (160 x 250<br /> x 240 mm, lắp bóng đèn đỏ 40W). Hai bóng đèn<br /> cách sàn 370 mm. Hai ngăn thông nhau bởi một<br /> cửa có kích thước 70 x 70 mm ở bên dưới, chính<br /> giữa hộp. Thời gian và số lần chuột di chuyển<br /> vào các ngăn được máy tính ghi nhận thông qua<br /> phần mềm chuyên dụng (PPC Win v2.0.03).<br /> Chuột được chia ngẫu nhiên thành 4 lô<br /> thử nghiệm như sau:<br /> - Lô 1 (n=10): Lô chứng, uống nước cất.<br /> - Lô 2 (n=10): Lô đối chiếu, uống Diazepam<br /> liều 5 mg/kg chuột.<br /> - Lô 3 (n=10): Uống cao CAT với liều 1,97 g<br /> cao khô/kg chuột (tương đương 8,21.g cao<br /> khô/kg người).<br /> - Lô 4 (n=10): Uống cao CAT với liều 3,94 g<br /> cao khô/kg chuột (tương đương 16,42 g cao<br /> khô/kg người).<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014<br /> Chuột được cho uống 30 phút trước thử<br /> nghiệm. Thể tích uống là 0,2 ml/10 g chuột.<br /> Chuột được đặt ở cửa ngăn cách vùng sáng<br /> và tối, hướng ra ngăn sáng. Sau đó chuột được<br /> tự do khám phá trong 5 phút. Ghi nhận lại số lần<br /> ra vùng sáng của chuột và thời gian ở vùng sáng.<br /> Chuột được tính là ra vùng sáng khi cả 4 chân<br /> vượt qua lằn phân cách giữa 2 vùng.<br /> Ghi nhận tại các thời điểm 30 phút và 60<br /> phút sau khi uống thuốc đối với các lô 3, 4. Còn<br /> lô 1 và 2 chỉ ghi nhận tại thời điểm 30 phút sau<br /> khi uống.<br /> <br /> Phương pháp xử lý thống kê số liệu thực<br /> nghiệm<br /> Các dữ liệu được trình bày dưới dạng<br /> Mean ± SEM, xử lý bằng phần mềm SPSS<br /> phiên bản 16.0 với phép kiểm Student cho 2<br /> dãy số liệu độc lập. So sánh sự khác nhau giữa<br /> các nhóm có tác dụng gây ngủ bằng phép<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> kiểm ANOVA một chiều, một yếu tố. Sự khác<br /> nhau được xem là có ý nghĩa khi giá trị p <<br /> 0,05. Đồ thị được vẽ theo giá trị Mean ± SEM<br /> bằng phần mềm MS. EXCEL 2007.<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> Độc tính cấp<br /> D max là 19,7 g cao khô/kg chuột (khoảng<br /> 169,95 g dược liệu khô) gấp 257 lần liều thường<br /> sử dụng trong ngày (khoảng 24 - 42 g/ngày),<br /> không có chuột chết trong vòng 72 giờ. Liều thử<br /> nghiệm dò liều tác dụng dược lý trong trường<br /> hợp chưa xác định được LD50 trên chuột nhắt<br /> trắng theo đườn g uống gồm liều 1/20, 1/10 và<br /> 1/5 D max.(4) Liều có hiệu quả tác dụng dược lý sẽ<br /> được lấy làm liều thử độc tính bán trường diễn.<br /> Sau khi dò liều có hai liều 1/10 D max (1,97 g cao<br /> khô/kg chuột) và 1/5 D max (3,94 g cao khô/kg<br /> chuột) thể hiện tác dụng dược lý.<br /> <br /> Độc tính bán trường diễn<br /> Bảng 1: Trị số huyết học, sinh hóa của chuột nhắt sau uống thuốc liều 3,94 g cao khô/kg trong 60 ngày<br /> Lô chứng (n=10)<br /> <br /> Trị số<br /> 3<br /> <br /> Bạch cầu (ngàn/mm )<br /> 3<br /> Hồng cầu (triệu/mm )<br /> Hemoglobin (g/dL)<br /> Hematocrit (%)<br /> 3<br /> Tiểu cầu (ngàn/mm )<br /> ALT (U/L)<br /> AST (U/L)<br /> Creatinin (mg/dL)<br /> <br /> Trước<br /> 4,49 ± 0,44<br /> 6,12 ± 0,3<br /> 10,3 ± 0,36<br /> 36,61 ± 0,12<br /> 363,71 ± 67,79<br /> 50,51 ± 8,68<br /> 90,37 ± 8,27<br /> 0,64 ± 0,83<br /> <br /> Trị số huyết học và sinh hóa của chuột nhắt<br /> uống cao CAT liều 3,94 g cao khô/kg chuột, sau<br /> 60 ngày đều không có sự khác biệt có ý nghĩa<br /> thống kê so với lô chứng uống nước cất (p> 0,05).<br /> Hình ảnh giải phẫu mô học gan, thận của<br /> chuột uống cao CAT liều 3,94 g cao khô/kg chuột<br /> sau 60 ngày không có sự khác biệt so với lô<br /> chứng uống nước cất.<br /> Cao CAT không có tác dụng hiệp lực gây<br /> ngủ với thiopental ở liều 1,97 g/kg ở thời điểm 30<br /> phút nhưng có tác dụng ở thời điểm 60 phút<br /> sau khi sử dụng.<br /> <br /> Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền<br /> <br /> Lô thuốc (n=10)<br /> <br /> Sau 60 ngày<br /> 5,32 ± 1,01<br /> 6,23 ± 0,97<br /> 10,23 ± 0,80<br /> 31,98 ± 0,45<br /> 385,17 ±40,86<br /> 43,2 ± 6,94<br /> 78,1 ± 5,69<br /> 0,67 ± 0, 91<br /> <br /> Trước<br /> 4,34 ± 0,46<br /> 5,8 ± 0,21<br /> 9,53 ± 0,42<br /> 35,78 ± 0,12<br /> 398,71 ± 52,18<br /> 50,26 ± 2,87<br /> 89,89 ± 5,25<br /> 0,65 ± 0,7<br /> <br /> Sau 60 ngày<br /> 5,8±0,51<br /> 6,34 ± 0,40<br /> 10,29 ± 0,82<br /> 32,38 ± 0,24<br /> 412,83 ± 48,9<br /> 43,4 ± 5,69<br /> 79,51 ± 4,61<br /> 0,69 ± 0,88<br /> <br /> Cao CAT có tác dụng hiệp lực gây ngủ<br /> với thiopental ở liều 3,94 g/kg ở cả hai thời điểm<br /> 30 phút và 60 phút sau khi sử dụng (p