Nghiên cứu khoa học " Kết quả phân tích đa dạng di truyền loài Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib.) bằng chỉ thị phân tử RAPD "

Chia sẻ: Nguye Nhi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

56
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Các mẫu Gõ đỏ có mức đa dạng di truyền cao. Hệ số tương đồng di truyền dao động từ 47 đến 100%. Trong tổng số 50 mẫu thu được từ 7 vùng của 4 tỉnh thì các mẫu L1, L3 và L4 (từ huyện Lắc, Đắc Lắc), K9 và K4 (từ Kon Hà Nừng, Gia Lai) có mức độ khác biệt di truyền cao hơn so với các mẫu còn lại. Mẫu K4 có mức độ khác biệt đến 53% so với các mẫu khác. Các mẫu còn lại chia làm 3 nhóm chính: Nhóm I gồm các...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu khoa học " Kết quả phân tích đa dạng di truyền loài Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib.) bằng chỉ thị phân tử RAPD "

Tạp chí Nông nghiệp &PTNT, 14/2007, 44-48. Kết quả phân tích đa dạng di truyền loài Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib.) bằng chỉ thị phân tử RAPD Nguyễn Hoàng Nghĩa Viện Khoa học Lâm nghiệp Nguyễn Đức Thành, Trần Thuỳ Linh Viện Công nghệ sinh học Tóm tắt Các mẫu Gõ đỏ có mức đa dạng di truyền cao. Hệ số tương đồng di truyền dao động từ 47 đến 100%. Trong tổng số 50 mẫu thu được từ 7 vùng của 4 tỉnh thì các mẫu L1, L3 và L4 (từ huyện Lắc, Đắc Lắc), K9 và K4 (từ Kon Hà Nừng, Gia Lai) có mức độ khác biệt di truyền cao hơn so với các mẫu còn lại. Mẫu K4 có mức độ khác biệt đến 53% so với các mẫu khác. Các mẫu còn lại chia làm 3 nhóm chính: Nhóm I gồm các mẫu E1, N2, N1, L6, L7, N3 K9, L1 có sự khác biệt so với hai nhóm II và nhóm III khoảng 50%; Nhóm II gồm E5, K1, K3, K7, B4, B1, K10, K2, B2 có mức độ khác biệt so với nhóm III khoảng 45% và Nhóm III gồm các mẫu còn lại. Từ khóa: Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib), RAPD, phân tích đa dạng di truyền. I. MỞ ĐẦU Gõ đỏ (Cà te, Gõ cà te) có tên khoa học là Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib (hoặc Pahudia xylocarpa Kurz) thuộc họ Đậu (Leguminosae), họ phụ Vang (Caesalpinoideae), là loài cây gỗ lớn, cao tới 30 m và đường kính đạt tới 80 - 100 cm. Cây sống trong rừng nhiệt đới thường xanh hay nửa rụng lá, có phân bố ở Kon Tum, Gia Lai, Đắc Lắc, Khánh Hoà và các tỉnh vùng Đông Nam Bộ. Phân bố không tập trung mà gặp như các cây cá thể rải rác cùng các loài cây khác trong rừng (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1999). Gỗ Gõ đỏ rất được ưa chuộng trên thị trường, được dùng rộng rải để đóng đồ gỗ, bàn ghế, giường tủ, đồ chạm trổ cao cấp, đồ mỹ nghệ. Các “nu gõ” rất có giá trị và được bán rất đắt. Chính vì những lý do trên mà Gõ đỏ đang bị khai thác đến cạn kiệt ở khắp nơi. Số lượng cây cá thể có kích thước lớn bị giảm sút nhanh chóng và hiện không còn nhiều. Các chuyến khảo sát gần đây cho thấy số lượng cây cá thể trưởng thành của loài trong tổ thành rừng tự nhiên là khá thấp, hầu hết trước đây đã từng bị khai thác nhiều lần, nên nguồn gen của loài đã bị suy giảm mạnh. Do vậy việc đánh giá đa dạng di truyền của loài ở các xuất xứ khác nhau là một nhu cầu cấp thiết góp phần vào việc lựa chọn các khu bảo tồn in situ và xây dựng quần thụ bảo tồn ex situ. Những năm gần đây các chỉ thị phân tử được dùng rộng rãi trong nghiên cứu phân loại ở một số loài cây trồng, trong đó chỉ thị RAPD được sử dụng khá rộng rãi bởi kỹ thuật này đơn giản và ít tốn kém. RAPD đã được sử dụng để xác định mối quan hệ phát sinh loài ở các loài Citrus (Federici et al., 1998) Juglans regia (Nicese et al., 1998), cây hoa mõm chó (Jimenez et al., 2005), và các loài Tinospora (Ahmed et al., 2005). ở Việt Nam, RAPD đã được sử dụng vào nghiên cứu đa dạng di truyền ở loài Lim xanh (Quách Thị Liên et al., 2004) và loài Tràm (Trần Quốc Trọng et al., 2005). Bài viết trình bày những kết quả về sử dụng chỉ RAPD trong nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa các xuất xứ loài Gõ đỏ nhằm đưa ra đề xuất về việc bảo tồn nguồn gen đối với loài cây quan trọng này. 1
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Vật liệu Mẫu lá của 50 cây Gõ đỏ được thu hái từ rừng tự nhiên của 4 tỉnh (Đồng Nai, Đắc Lắc, Gia Lai, Ninh Thuận) và 1 khu rừng trồng 50 tuổi ở Đắc Lắc (Bảng 1) đã được sử dụng. Bảng 1. Các mẫu Gõ đỏ sử dụng trong phân tích TT Địa điểm lấy mẫu Số cây Ký hiệu lấy mẫu 1 VQG Cát Tiên, huyện Tân Phú, Đồng Nai 10 C1 đến C10 2 Huyện Bắc ái, Ninh Thuận 5 B1 đến B5 3 Đèo Ngoạn Mục, Ninh Thuận 5 N1 đến N5 4 VQG Yokdon, huyện Buôn Đôn, Đắc Lắc 2 D1 và D2 5 Thôn Jun, huyện Lắc, Đắc Lắc 10 L1 đến L10 6 Eakmat, Tp Buôn Ma Thuột, Đắc Lắc 8 E1 đến E8 7 Kon Hà Nừng, huyện Kbang, Gia Lai 10 K1 đến K10 Tổng 50 2. Phương pháp nghiên cứu ADN genome của các mẫu Gõ đỏ được tách từ các mẫu lá khô được bảo quan bằng silicagel theo phương pháp CTAB của Saghai Maroof et al. (1994). Kỹ thuật PCR với các mồi RAPD được tiến hành với tổng thể tích là 25 μl/mẫu gồm những thành phần sau: ADN genome (50 ng); mồi cpDNA (10 ng); dNTP (200 mM); MgCl2 (2 mM); enzym Taq polymerase (0,5 đơn vị) và đệm thích hợp cho enzym. Chu trình nhiệt bao gồm các bước: 94oC - 4 phút; 94oC - 1 phút; 34oC - 1 phút; 72oC - 2 phút, lặp lại 45 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4; 72oC -7 phút; giữ nhiệt độ ở 4oC. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%, quan sát dưới đèn cực tím và chụp ảnh bằng hệ thống Thermal Imaging System FTI-500 (Pharmacia Biotech). Các số liệu được đưa vào xử lý bằng chương trình NTSYS pc (Rohlf F. J, 1993) để tính ma trận tương đồng giữa các đôi mẫu. Sau đó các mẫu nghiên cứu được xử lý tiếp trong NTSYS - SIMQUAL (phần mềm NTSYSpc 2.0) và được biểu hiện trên biểu đồ quan hệ di truyền. Mồi sử dụng cho nhân PCR là các mồi ngẫu nhiên RAPD của hãng OPERON (Mỹ) gồm: OPC8, OPC9, OPB6, OPB10, OPB17, và OPB20 (Bảng 2) Bảng 2. Trình tự mồi RAPD TT Tên mồi Trình tự 1 OPC8 5’-TGGACCGGTG-3’ 2 OPC9 5’-CTCACCGTCC-3’ 3 OPB6 5’-TGCTCTGCCC-3’ 4 OPB10 5’CTGCTGGGAC-3’ 5 OPB17 5’-AGGGAACGAG-3’ 6 OPB20 5’-GGACCCTTAC-3’ 2
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Kết quả tách chiết ADN genome Kết quả tách chiết cho thấy ADN genome tách chiết được từ các mẫu lá loài Gõ đỏ có độ tinh sạch cao (hình 1), đủ tiêu chuẩn cho các thí nghiệm tiếp theo. Hình 1. ADN genome tách từ một số mẫu Gõ đỏ 2. Kết quả phân tích RAPD Sản phẩm PCR với các mồi RAPD được điện di trên gel agarose 1%. Các sản phẩm PCR ADN genome của các mẫu Gõ đỏ với các mồi RAPD cho thấy tất cả các mồi đều cho đa hình. Trong 6 mồi sử dụng có các mồi OPC9 (hình 2) và OPB10 (hình 3) cho nhiều băng đa hình hơn. Hình 2. Sản phẩm PCR với mồi OPC9. E, D, C, L, N là ký hiệu các địa điểm thu mẫu, các số là số thứ tự các mẫu. 3
Hình 3. Sản phẩm PCR với mồi OPB10 3. Quan hệ di truyền giữa các mẫu Gõ đỏ Quan hệ di truyền giữa các mẫu Gõ đỏ được thể hiện trên hình 3 4
E1 N2 N1 L6 L7 N3 K9 L1 E2 E3 E4 D1 D2 C8 E6 C2 E7 E8 K8 K6 C1 B5 C3 C4 C7 C5 C6 C9 L10 K5 L5 B3 L8 L9 N5 N4 C10 L4 L3 E5 K1 K3 K7 B4 B1 K10 K2 B2 K4 0.47 0.60 0.74 0.87 1.00 Coefficient Hình 4. Biểu đồ quan hệ di truyền giữa các mẫu Gõ đỏ Biểu đồ hình 4 cho thấy các mẫu Gõ đỏ có mức đa dạng di truyền cao. Hệ số tương đồng di truyền dao động từ 47 đến 100%. Mẫu K4 (thu từ Kon Hà Nừng tỉnh Gia Lai) có mức độ khác biệt đến 53% so với các mẫu khác. Các mẫu còn lại chia làm 3 nhóm chính: 5
• Nhóm I gồm các mẫu E1, N2, N1, L6, L7, N3 K9, L1, nhóm này có sự khác biệt so với hai nhóm II và nhóm III khoảng 50%; • Nhóm II gồm E5, K1, K3, K7, B4, B1, K10, K2, B2, nhóm này có mức độ khác biệt so với nhóm III khoảng 45%; • Nhóm III gồm các mẫu còn lại. Trong mỗi nhóm các mẫu cũng có mức độ khác nhau nhưng ở mức thấp hơn và có các mẫu hoàn toàn giống nhau: trong nhóm I có mẫu E1và N2, L6 và L7; nhóm II có E5 và K1, B1 và K10; nhóm III có D1 và D2, C4 và C7, C6 và C9 là những mẫu giống nhau về mặt di truyền. Điều này có thể giải thích như sau: Các mẫu E1 và E5 thu từ rừng trồng 50 tuổi không rõ nguồn gốc hạt, như vậy có thể suy luận là E1 đã được thu hái hạt từ vùng đèo Ngoạn Mục (Ninh Thuận)(giống với mẫu N2) và E5 từ vùng Kon Hà Nừng (Gia Lai)(giống mẫu K1). Các cặp mẫu khác là các cặp mẫu được thu hái từ cùng một vùng: L6 và L7 từ huyện Lắc, D1 và D2 từ Yokdon, C4 và C7, C6 và C9 đều từ Cát Tiên, chứng tỏ từng cặp là các cây tái sinh từ một cây mẹ nên các cặp có nguồn gốc di truyền giống nhau. Riêng trường hợp B1 (Ninh Thuận) và K10 (Gia Lai) là chưa thể giải thích được. Phân tích theo vùng có thể thấy như sau: Mười mẫu thu từ VQG Cát Tiên (C1 đến C10) toàn bộ nằm trong nhóm III. Hai mẫu thu từ VQG Yondon giống nhau hoàn toàn và nằm trong nhóm III. Chín mẫu thu từ huyện Lắc, Đắc Lắc (trừ mẫu L2 không thu được số liệu) có 3 mẫu nằm ở nhóm I (L1, L6, L7) và 6 mẫu nằm ở nhóm III (L3, L4, L5, L8, L9, L10). Mười mẫu thu từ Kon Hà Nừng, Gia Lai có mức đa dạng cao. Các mẫu thu nằm rải rác ở các nhóm nhưng tập trung chủ yếu ở nhóm II (K1, K3, K7, K10, K2), mẫu K9 ở nhóm I, các mẫu K5, K6, K8 ở nhóm III và riêng K4 có mức độ khác biệt di truyền lớn nhất so với các mẫu thu ở Kon Hà Nừng, Gia Lai và các nơi khác nên tạo thành một nhóm riêng. Năm mẫu thu ở Bắc ái, Ninh Thuận có 3 mẫu (B1, B2, B4) nằm ở nhóm II và 2 mẫu (B3, B5) nằm ở nhóm III. Năm mẫu thu từ đèo Ngoạn Mục, Ninh Thuận có 3 mẫu (N1, N2, N3) nằm ở nhóm I, hai mẫu (N4, N5) thuộc nhóm II. Tám mẫu thu ở rừng trồng Eakmat, Đắc Lắc chủ yếu nằm ở nhóm III (E2, E3, E4, E6, E7, E8) còn lại chỉ có E1 nằm ở nhóm I, và E5 nằm ở nhóm II. Trong tổng số 50 mẫu thu được từ 7 vùng của 4 tỉnh thì các mẫu L1, L3 và L4 (từ huyện Lắc, Đắc Lắc), K9 và K4 (từ Kon Hà Nừng, Gia Lai) có mức độ khác biệt di truyền cao hơn so với các mẫu còn lại. IV. KẾT LUẬN Các sản phẩm PCR ADN genome của các mẫu Gõ đỏ với các mồi RAPD cho thấy tất cả các mồi đều cho đa hình. Trong 6 mồi sử dụng có các mồi OPC9 và OPB10 cho nhiều băng đa hình hơn. Các mẫu Gõ đỏ có mức đa dạng di truyền cao. Hệ số tương đồng di truyền dao động từ 47 đến 100%. Trong tổng số 50 mẫu thu được từ 7 vùng của 4 tỉnh thì các mẫu L1, L3 và L4 (từ huyện Lắc, Đắc Lắc), K9 và K4 (từ Kon Hà Nừng, Gia Lai) có mức độ khác biệt di truyền cao hơn so với các mẫu còn lại. Mẫu K4 có mức độ khác biệt đến 53% so với các mẫu khác Ngoài K4 lập thành nhóm riêng, các mẫu còn lại chia làm 3 nhóm chính: Nhóm I gồm các mẫu E1, N2, N1, L6, L7, N3 K9, L1 có sự khác biệt so với hai nhóm II và nhóm III khoảng 50%; Nhóm II gồm E5, K1, K3, K7, B4, B1, K10, K2, B2 có mức độ khác biệt so với nhóm III khoảng 45% và Nhóm III gồm các mẫu còn lại. 6
Tài liệu tham khảo 1. Ahmed SM, Verma V., Qazi PH., Ganaie MM, Bakshi SK., Qazi GN, 2005. Molecular phylogeny in indian Tinospora species by DNA based markers. Plant Systematics and Evalution, 256 (1-4): 75-87. 2. Federici CT. et al, 1998. Phylogenetic relationship within the genus Citrus (Rutaceae) and related genera as revealed by RFLP and RAPD analysis. Theor Appl Genet, 96:812-822. 3. Nicese. F.P., Homaza JI., and McGranahan GH, 1998. Molecular Characterization and genetic relatedness among walnut (Juglans regia L) genotypes based on RAPD markers. Euphytica 101: 199- 206. 4. Jimenez JF., Guemes J., Sanchez-Gomez P., Rossello JA, 2005. Isolated populations or isolated taxa? A case study in narrowly-distributed snapdragons (Antirrhinum sect. Sempervirentia) using RAPD markers. Pl. Syst. Evol. 252: 139-152. 5. Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1999. Một số loài cây bị đe doạ ở Việt Nam. Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 6. Quách Thị Liên, Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2004. Sử dụng các chỉ thị RAPD và ADN lục lạp trong nghiên cứu quan hệ di truyền của một số xuất xứ cây Lim xanh Erythrophleum fordii Oliv. Kỷ yếu Hội nghị toàn quốc “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống”, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 2004. 464-468. 7. Rohlf FJ., 1993. NTSYS-pc Numerrical taxonomy and multivariate system, Version 1.80. Applied Biostatitics Inc., New York. 8. Trần Quốc Trọng, Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Việt Cường, 2005. Sử dụng chỉ thị RAPD và ADN lục lạp trong nghiên cứu quan hệ di truyền của một số xuất xứ Tràm (Maleleuca cjuputy) từ các vùng khác nhau của Việt Nam. Kỷ yếu Hội thảo Quốc gia lần thứ nhất về Sinh thái và tài nguyên sinh vật. Hà Nội, 2005. 259-265. 9. Saghai Maroof M. A., Biyashev R. M., Yang G. P., Zhang Q., Allard R. W., 1994, Extraodirnarily polymorphic microsatellite DNA in barley: species diversity, chromosome location, and population dynamics, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 91: 5466-5470. Results on Genetic Diversity Analysis of Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib Provenances by using RAPD markers Nguyen Hoang Nghia (Forest Science Institute of Vietnam) Nguyen Duc Thanh, Tran Thuy Linh (Biotechnology Institute) Summary By using RAPD markers, samples of Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib, an important tree species of Vietnam, showed high genetic diversity. Genetic similarity indeces varied from 47% to 100%. Among 100 samples collected from 7 locations of 4 provinces, the samples L1, L3 and L4 (from Lac district, Dac Lac province) as well as K9 and K4 (from Kon Ha Nung, Gia Lai province) showed higher genetic difference than the other samples. The sample K4 showed difference of 53% from other samples. The remaining samples can be divided into 3 main groups: Group I includes samples such as E1, N2, N1, L6, L7, N3 K9, L1 which showed difference of about 50% from other two groups; Group II includes samples such as E5, K1, K3, K7, B4, B1, K10, K2, B2 which showed difference of 45% from Group III; and Group III includes remaining samples. Keywords: Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib, RAPD, genetic diversity analysis. 7